Práctica 2: Biomoléculas (Carbohidratos)

Los carbohidratos son la fuente de reserva principal de energía en los organismos. Son moléculas formadas por
carbono hidrógeno y oxígeno en proporción aproximada 1:2:1, esta relación explica el origen de la palabra
“carbohidrato” que literalmente significa carbono más agua. Todos los carbohidratos son azúcares pequeños
solubles en agua o bien polímeros de azúcar como el almidón. [0]

1. Materiales y Reactivos
Por grupo se requiere llevar guantes y pañuelo para limpieza y secado.
Materiales
✔ Tubos de ensayo sin tapa
✔ Placa calefactora
✔ Beaker 250 ml
✔ Vianda ✔ Gradilla
✔ Pipetas 1,2 y 5 ml
✔ Pera de succión
✔ Pipeta Pasteur

Para cuantificación con DNS

Todo el material anterior y…
✔ Espectrofotómetro
✔ Cubetas para espectrofotómetro
Reactivos
✔ Benedict
✔ Lugol 1%
✔ Almidón 10%
✔ Glucosa 4g/L
✔ Agua Destilada

Para cuantificación con DNS

Todo el material anterior y…
✔ Reactivo DNS
✔ Hielo

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2. Carbohidratos
Los hidratos de carbono constituyen el grupo de biomoléculas más abundante sobre la superficie
terrestre, representando aproximadamente el 75 % de la materia orgánica existente. En
ocasiones, se denominan también carbohidratos, azúcares, sacáridos o glúcidos. Todos son
términos que hacen referencia a su sabor dulce, o a que poseen la composición 𝐶(𝐻2𝑂)𝑛. [1]

Los carbohidratos pueden ser clasificados de acuerdo con su grupo funcional (aldosas o cetosas)
tal como se presenta en la figura 1.[2]

Fig.1. Clasificación por grupo funcional de los tipos de azucares que existen. [2]

También es posible clasificarse por el número de átomos de carbono que los conforman como,
3C: triosas, 4C: tretrosas, 5C: pentosas, 6C: Hexosas, etc.) y por la cantidad de monosacáridos
que posea la estructura molecular del carbohidrato como lo son los monosacáridos; los cuales
corresponden a un solo monómero de glúcido y que entre sus funciones principales esta servir
de fuente de energía para las células y participar en la síntesis de ácidos nucleicos. Los
disacáridos, de los cuales algunos son comúnmente encontrados en la naturaleza como es el
caso de la lactosa (glucosa-galactosa), sacarosa (glucosa-fructosa) y maltosa (2 unidades de
glucosa). Los oligosacáridos que suelen tener cadenas entre 3 y 10 monosacáridos los cuales
entre sus funciones poseen la mejora de la actividad intestinal, también un sabor dulce, aunque
no son cariogénicos. [2]

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 Finalmente están los polisacáridos, lo cuales están constituidos por centenares de monosacáridos
unidos por enlaces glucosídicos por lo que poseen un elevado peso molecular y una estructura compleja,
además, poseen características fisicoquímicas contrarias a las de la configuración explicada para la
clasificación de carbohidratos anteriores ya que no cristalizan, no tiene sabor dulce, carecen de poder
reductor y son poco solubles en agua. Los diferentes tipos de monosacáridos que se forman difieren en
su estructura por el tipo de monosacáridos que lo conforman ya que de ser iguales se denominan
homopolisacáridos y de lo contrario heteropolisacáridos. Los homopolisacáridos también denominados
glucanos son de los más abundantes en la naturaleza, sin embargo, es importante desatacar que
dependiendo del tipo de enlaces que estos presenten podrán poseer una función energética (enlaces
tipo α) o una función estructural (enlaces tipo β) los cuales se presentan en la figura 2.[1]

Fig.2. Tres polisacáridos con monómeros de azúcar idénticos, pero con propiedades diferentes. El
glucógeno (a) almidón (b) y celulosa (c).[1]

Los polisacáridos de la figura 2 están compuestos por subunidades de glucosa los cuales poseen
como se ha descrito anteriormente funciones diferentes asociadas a sus tipos de enlaces
(encerradas en círculos enumerados). Las moléculas de glucógeno son las más ramificadas, las

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 moléculas de almidón adquieren una configuración helicoidal y las moléculas de celulosa son
muy largas y sin ramificación. Mientras que el glucógeno y el almidón almacenan la energía, las
moléculas de celulosa están empaquetadas juntas en fibras resistentes que son adecuadas para
su papel estructural. Las micrografías electrónicas coloreadas muestran los gránulos de
glucógeno en una célula de hígado, los granos de almidón (amiloplastos) en una semilla vegetal
y las fibras de celulosa en una pared celular vegetal; cada una se indica mediante una flecha.
[1]

Por último, se presenta en la tabla 1 diferentes funciones que poseen los carbohidratos.

Tabla 1. Funciones de los diferentes tipos de carbohidratos. [5]

Tipo de Función Explicación Ejemplos

Fuente de energía para las células

Glucosa, fructosa
Intervienen en la formación de
ácidos nucleicos Ribosa y desoxiribosa
Es un componente estructural de Celulosa, hemicelulosa
BIOLÓGICA algunas células y tejidos (plantas)
Reserva de fuentes de carbono Almidón, glucógeno

Participan en procesos de Glucolípidos (membranas

inmunidad específica y protección. celulares)

Papel (celulosa), alimenticia

(sacarosa, almidón,
Materias primas para la industria amilopectina), madera
(lignocelulósicos),
INDUSTRIAL farmacéutica.

3. Fundamentación y Metodología

Método DNS (tomada de [3])

El método DNS determina la presencia de grupos carbónilos libres (C=O) de los azúcares
reductores.
El procedimiento se basa en una reacción redox, que ocurre con el uso de ácido 3,5
dinitrosalicílico para provocar la oxidación de los azúcares y al mismo tiempo su propia reducción

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endotérmica. Un mol de azúcar reacciona con un mol de ácido 3,5 dinitrosalicílico, dando lugar
a una reacción estequiométrica que permite conocer la cantidad de azúcares reductores
presentes en la muestra (Figura 3). Después de esto se continúa con la determinación, haciendo
lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm.

Fig.3. Reacción de oxidación de azúcares reductores, método DNS

La reacción es colorimétrica, el ácido 3.5 dinitrosalicílico es de color amarillo, mientras que la

aparición de ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico provoca un viraje a pardo oscuro, cuya intensidad
será proporcional a la cantidad de azúcares reductores. Por esta razón, el método no es
recomendable para muestras coloreadas, ya que pueden afectar en la lectura que se realice en
el espectrofotómetro (Figura 4).

Fig.4. Visualización de la coloración de la curva de calibración usando DNS con manosa como
analito. (Imagen tomada de resultados de investigación Grupo de Alimentos Frutales-GAF).

La calibración se realiza con estándares que contienen el azúcar reductor para establecer una
relación entre las características fisicoquímicas del analito y las señales del instrumento. En un
proceso analítico se relaciona la señal y características del analito, de modo que la calibración
se realiza al obtener la señal de respuesta como función de la concentración conocida del analito.

Se representan los datos obtenidos y se obtiene la gráfica de la señal corregida frente a la

concentración el analito. Lo normal es que la gráfica tienda a una línea recta, donde a medida

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 que aumenta la concentración, la señal de respuesta es mayor (pendiente positiva) que para el
caso del método DNS no puede superar los 4g/L. En el modelo de curva de calibración lineal, la
pendiente vendrá dada por la ecuación matemática: y = mx + b
Siendo m la pendiente, x la concentración e y la señal de respuesta.

Procedimiento
1. Preparación de los patrones para la curva de calibración del método DNS a través de
diluciones seriadas:

Fig. 5. Preparación de la solución de glucosa a diferentes concentraciones. [5]

Las diluciones seriadas son una técnica de laboratorio que se utilizan para reducir la concentración de
una solución proporcionadamente, tal y como se observa en la figura 5. Hay que recordar que:

Soluto
Factor de dilución=
Soluto+diluyente

Intente obtener el factor de dilución de cada uno de los tubos ilustrados en la figura
5.

Entonces, ¿Cómo calculo la concentración final de cada dilución?

Una ecuación sencilla y muy útil es:

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 C1V1=C2V2 𝐸𝑐. 1

Donde C1 y C2 corresponden a las concentraciones inicial y final, y V1 y V2 corresponden a los volúmenes

inicial y final.

Así, para el tubo 2 de la figura 5 se tiene que:

C1V1=C2V2

(4g/L)2mL=C2(4mL)

(4g/L)2mL
(4mL) =C2

Por lo tanto, la concentración será de 2g/L.

2. Adición del reactivo colorimétrico:

Tanto para los patrones de la curva, como para la muestra problema y el blanco (agua) se
procede de la siguiente forma:

✔ A 0.5 mL de cada muestra adicionar 0.5 mL de reactivo DNS. Agitar todas las muestras.

✔ Calentar las muestras en baño maría por 5 minutos y enfriar rápidamente con hielo.

✔ Adicionar 5 mL de H2O destilada, agitar y dejar en reposo en oscuridad durante 15 min.

Finalmente se lee la absorbancia a 540 nm y escribir el valor en la tabla 2 en la concentración

que corresponda. Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un
coeficiente de correlación de 0.991 a 0.999.

3. Cuantificación de una muestra específica:

Siguiendo el esquema anterior, tomar en un tubo limpio 0.5 mL de la muestra y realizar los
mismos pasos para cada dilución del extracto hasta encontrar una dilución acorde al rango
de trabajo del método.
Calcular el contenido de azúcar en la muestra a partir de la ecuación de la recta patrón.

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 Tabla 2. Formato de recolección de datos del método del DNS.
Absorbancia
Concentración (g/L)
Tubo a 540 nm

1 0 (blanco)
2 0,5
3 1
4 2
5 4
7 Muestra 1
Muestra del
8
grupo*

*El producto que se le fue asignado puede necesitar diluciones

Prueba de Benedict (Obtenido de [4]) 24 de febrero

Se utiliza para detectar carbohidratos simples reductores. La prueba de Benedict identifica
azúcares reductores (monosacáridos y algunos disacáridos), que tienen grupos funcionales libres
de cetonas o aldehídos.

Algunos azúcares como la glucosa se llaman azúcares reductores porque son capaces de
transferir hidrógenos (electrones) a otros compuestos, un proceso llamado reducción. Cuando
los azúcares reductores se mezclan con el reactivo Benedict y se calientan, una reacción de
reducción hace que el reactivo Benedict cambie de color.

El sulfato cúprico es el componente más importante de esta solución. Contiene Cu(II), que es
un agente oxidante que fácilmente cambia a su estado Cu(I) en presencia de un agente reductor.

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El Cu (II) es de color azul, y cuando pasa a su estado de oxidación +1 Cu(I) pasa a ser un
precipitado rojizo (Figura 6).

Fig.6. Mecanismo de reacción en la reacción de Benedict.

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 Procedimiento [5]

Prueba de Benedict para azúcares reductores 24 feb.

✔ Patrón teórico negativo: Tome un tubo de ensayo (Tubo 1) y agregue 2 mL de H 2O destilada
más 1 mL de reactivo de Benedict.
✔ Patrón teórico positivo: Tome otro tubo de ensayo (Tubo 2) y agregue 2 mL de glucosa 0.4%
más 1 mL de reactivo de Benedict.
✔ Muestra: Tome un tercer tubo de ensayo (Tubo 3) y agregue 2 mL de la muestra problema y 1
mL de reactivo de Benedict.
✔ Caliente los tres tubos al baño maría durante 5 minutos, observe los cambios de color y
compárelos.

Prueba de Lugol para almidón 24 feb.

✔ Patrón teórico negativo: Tome un tubo de ensayo (Tubo 1) y agregue 2 mL de H 2O destilada
más 5 gotas de reactivo de Lugol.
✔ Patrón teórico positivo: Tome otro tubo de ensayo (Tubo 2) y agregue 2 mL de almidón al 10%
más 5 gotas de reactivo de Lugol.
✔ Muestra: Tome un tercer tubo de ensayo (Tubo 3) y agregue 2 mL de la muestra problema y
más 5 gotas de reactivo de Lugol.

4. Pre-informe
a. Tenga claro el objetivo de la práctica.

b. Realice un diagrama que le permita llevar el paso a paso de las pruebas para la identificación y
cuantificación de azucares

c. Preguntas opcionales:

1. ¿Cómo se preparan 50 ml del reactivo DNS?

2. Investigue: ¿Qué es la prueba de Tolens y de Felhing y para qué se usan?
3. ¿Existe algún protocolo para la determinación de azúcares totales (independientemente si
son reductores o no)? si es así, describa el protocolo.
4. ¿A parte del método DNS, existe algunas otras metodologías que permitan la determinación
de azúcares reductores de forma cuantitativa? Describa.

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 Homopolisacárido
Reductor
Amilopectina (ejemplo) Conformado por hexosas
Conformado por aldosas
Función energética

Monosacárido
Reductor
Galactosa Hexoaldosa
Función energética

Glúcido trisacárido
No reductor
Melecitosa Conformado por glucosa,
turanosa y sacarosa
Función energética y estructural
Tetrosa
Fructosa ciclada
Furanosa Monosacárido
Reductor
Función energética y estructural

Pentosa
Monosacárido
Piranosa Glucosa ciclada
Función energética
Reductor

Conformada por glucosa

Conformada por galactosa
Disacárido
Lactosa
Reductor
Función energética

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6. Referencias
[0] Audesirk. G. Biología: la vida en la tierra. 8va Ed. Pearson. Pág 39.
[1] G. Karp, J. Iwasa, y W. Marshall, Karp’s Cell and Molecular Biology. John Wiley & Sons, 2020.
[2] A. Porto, «monosacaridos», 29 de diciembre de 2018.
http://www.bionova.org.es/animbio/animplus/monosacaridos/monosacaridos.html (accedido 3 de
abril de 2022).
[3] «7. Bradford Y DNS - Enzinetic UPIIG». https://sites.google.com/site/enzineticupiig/bradford-y- dns
(accedido 3 de abril de 2022).
[4] «Benedict’s Test Principle, Preparation, Procedure and Result Interpretation», Microbiology
Info.com, 29 de octubre de 2015. https://microbiologyinfo.com/benedicts-test-principle-
composition-preparation-procedure-and-result-interpretation/ (accedido 3 de abril de 2022).
[5] Sebastian Pineda Pineda "Laboratorio de Microscopia" Universidad Nacional de Colombia Sede
Manizales. (accedido 21 de marzo de 2022).

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