Caracterización morfológica y molecular de colectores

linfáticos dérmicos humanos

Viktoria Hasselhof , # 1 Anastasia Sperling , # 1 Kerstin Buttler , 1 Philipp Ströbel , 2 Jürgen
Becker , 1 Thiha Aung , 3, 4 Gunther Felmerer , 3 y Jörg Wilting 1, *

Robert W Dettman, editor

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Resumen
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Introducción

El sistema vascular linfático está compuesto por precolectores, colectores, ganglios linfáticos y troncos linfáticos iniciales
(sinusoides, capilares) [ 1 ]. Los linfáticos iniciales absorben líquido intersticial, quilomicrones, células migratorias y patógenos, y
los conducen a través de colectores linfáticos aferentes a los ganglios linfáticos [ 2 , 3 ]. Los colectores y troncos linfáticos eferentes
finalmente drenan la linfa en la unión venosa yugulo-subclavia (ángulo venoso). El flujo de líquido intersticial en los vasos
linfáticos iniciales está dirigido por delicadas válvulas endoteliales, equipadas con filamentos de anclaje y uniones intercelulares
especializadas [ 4 , 5] Dentro de los linfáticos, el flujo centrípeto de la linfa se logra mediante la contractilidad autónoma del sistema
linfático, incluso en ausencia total de estímulos mecánicos externos, como la contracción del músculo esquelético o la
respiración. Esto se ha demostrado experimentalmente en embriones de pollo, donde los corazones linfáticos especializados
cumplen estas funciones [ 6 ]. En los humanos, los colectores linfáticos, que son espontáneamente contráctiles y están equipados
con válvulas semilunares intraluminales, inducen el flujo linfático y lo dirigen hacia los ángulos venosos. Esto se puede demostrar
con elegancia con tintes vitales en humanos, donde se ha demostrado el bombeo activo de colectores linfáticos dérmicos con
inyecciones de verde de indocianina (ICG) y detección del flujo linfático con una cámara infrarroja [ 7] De hecho, la contractilidad
espontánea de los colectores linfáticos se conoce desde hace bastante tiempo [ 8 ], pero nunca se ha demostrado en humanos de
manera tan inequívoca como con la técnica ICG [ 9 ].

A pesar de su gran importancia para el transporte activo de la linfa, los colectores linfáticos humanos no se han caracterizado bien,
tanto a nivel morfológico como molecular. La mayoría de los estudios se realizaron en animales como perros, cobayas, ovejas,
vacas, conejos y ratas [ 10 - 16 ]. Se realizaron algunos estudios en hombres sobre el conducto torácico, que es la parte más central
del sistema linfovascular y ya puede poseer características intermedias entre los vasos linfáticos y las venas [ 17 - 20] Al igual que
los colectores linfáticos, el conducto torácico posee contractilidad peristáltica, que se ha atribuido a la existencia de células
intersticiales similares a Cajal (ICLC). Las ICLC se han caracterizado principalmente a nivel de microscopía electrónica de
transmisión como células ramificadas con procesos largos y delgados [ 17 ]. Aunque estos autores también realizaron estudios
inmunohistológicos del conducto torácico, todavía falta la caracterización de los ICLC en colectores linfáticos.

Mientras que los linfáticos iniciales no poseen células murales, ni siquiera pericitos, los colectores linfáticos tienen una túnica media
(media) y una túnica externa (adventicia). Las contracciones fásicas y peristálticas de los colectores linfáticos se basan en la
estructura y función de las células del músculo liso (SMC) en los medios [ 21 ]. La expresión de óxido nítrico sintetasa endotelial
(eNOS) en LEC de colectores parece ser importante para la ejecución de ondas de dilatación [ 22 ]. Sin embargo, nuestro
conocimiento de los objetivos farmacológicos para la activación de las ondas de contracción en colectores linfáticos humanos es
extremadamente pobre.

'El linfedema es un problema global significativo, y su incidencia aumentará con una población que vive más tiempo. Además,
debido a la interrelación entre el sistema linfático y el tejido adiposo, la epidemia de obesidad ha provocado un rápido aumento de
esta complicación '[ 23] Inducir y apoyar la actividad y función de los colectores linfáticos en brazos y piernas parece ser una opción
terapéutica atractiva para tratar el linfedema. Como requisito previo, los colectores deben caracterizarse a niveles moleculares y
morfológicos. Aquí, comenzamos a caracterizar colectores linfáticos humanos aislados de la dermis del muslo. Estos colectores
completamente normales se utilizaron para trasplantes autólogos en pacientes que sufren de linfedema secundario del brazo después
del tratamiento contra el cáncer de mama. Utilizamos marcadores LEC y comparamos colectores y linfáticos iniciales. Con
microscopía electrónica e inmunohistología, caracterizamos las SMC y las células intersticiales tipo Cajal (ICLC) en los medios, y
también realizamos análisis de expresión global de colectores para identificar nuevas dianas moleculares.vasa vasorum e ICLC que
se extienden a los medios. Confirmamos la heterogeneidad entre los LEC de los linfáticos iniciales y los colectores, identificamos
nuevos marcadores para los LEC, mostramos la expresión de vimentina y PDGFRα en las ICLC e indicamos objetivos moleculares
en los medios de los colectores linfáticos para el control de la contractilidad.

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Materiales y métodos

Pacientes

El trasplante autólogo de colector linfático (n = 22) se realizó en pacientes con cáncer de mama que padecen linfedema secundario
del brazo después del tratamiento estándar. Se tomó un colector linfático normal de la hipodermis del muslo, se trasplantó a la
región axilar y se conectó proximal y distalmente a los colectores linfáticos como se describió anteriormente [ 24].] Los colectores
del muslo se identificaron mediante inyecciones de 0.2–0.5 ml de azul patente en la dermis del primer y segundo espacio
interdigital. Se aisló una sección suficientemente larga de un colector, se retiró y se usó para trasplante. Los extremos libres de los
linfáticos del muslo fueron sellados. Las operaciones fueron altamente exitosas. Ningún paciente desarrolló linfedema en la pierna
donde se realizó el trasplante, y todos mostraron significativamente menos linfedema en el brazo después del trasplante. Los datos
clínicos se presentarán en un estudio separado. Pequeños trozos de colectores linfáticos, que quedaron después de los trasplantes, se
utilizaron para el presente estudio. Sin embargo, algunos de los coleccionistas eran lo suficientemente largos como para dividirse en
piezas y podían usarse para diferentes técnicas. Por lo tanto, el número total de experimentos fue: Inmunofluorescencia, n =
15; Microscopía electrónica de transmisión (TEM), n = 6; Secuenciación de próxima generación (NGS), n = 6. Todos los estudios
de pacientes fueron aprobados por el comité de ética del Centro Médico de la Universidad de Gotinga (solicitud no. 11/4/05). Los
cirujanos informaron a los pacientes y dieron su consentimiento por escrito. Para la comparación de los marcadores linfáticos, se
estudiaron los linfáticos iniciales en el prepucio de los niños pequeños (n = 6), retirados por razones personales. Los estudios sobre
el prepucio se realizaron con el consentimiento informado por escrito de los padres de los menores y también fueron aprobados por
el comité de ética del Centro Médico Universitario de Gotinga (solicitud no. 11/4/05). Todos los estudios de pacientes fueron
aprobados por el comité de ética del Centro Médico de la Universidad de Gotinga (solicitud no. 11/4/05). Los cirujanos informaron
a los pacientes y dieron su consentimiento por escrito. Para la comparación de los marcadores linfáticos, se estudiaron los linfáticos
iniciales en el prepucio de los niños pequeños (n = 6), retirados por razones personales. Los estudios sobre el prepucio se realizaron
con el consentimiento informado por escrito de los padres de los menores y también fueron aprobados por el comité de ética del
Centro Médico de la Universidad de Gotinga (solicitud no. 11/4/05). Todos los estudios de pacientes fueron aprobados por el comité
de ética del Centro Médico de la Universidad de Gotinga (solicitud no. 11/4/05). Los cirujanos informaron a los pacientes y dieron
su consentimiento por escrito. Para la comparación de los marcadores linfáticos, se estudiaron los linfáticos iniciales en el prepucio
de los niños pequeños (n = 6), retirados por razones personales. Los estudios sobre el prepucio se realizaron con el consentimiento
informado por escrito de los padres de los menores y también fueron aprobados por el comité de ética del Centro Médico
Universitario de Gotinga (solicitud no. 11/4/05).

Inmunohistologia

Para los estudios de inmunofluorescencia, las muestras se fijaron durante 20-25 min en paraformaldehído al 4% (PFA), se
enjuagaron en PBS, se transfirieron a sacarosa al 10% y al 30% en PBS y se incluyeron en medio de congelación de tejidos (Tissue
Tek, Sakura Finetek Zoeterwoude, NL ) Se incubaron secciones de 12-14 μm con los siguientes anticuerpos primarios: conejo-anti-
humano CCBE1 (1: 500, Sigma-Aldrich, München, Alemania), conejo-anti-humano ESAM-1 (1: 100, Sigma-Aldrich, München,
Alemania), α-actina de músculo liso de cabra anti-humano (SMA) (Acris Antibodies, Herford, Alemania), CD31 anti-humano de
ratón (1:50, BD Pharmingen), CD117 anti-humano de ratón (c -KIT, 1: 100, Santa Cruz Biotechnol., Y 1: 1, Dako, Hamburgo,
Alemania), ratón anti-humano D2-40 (1: 200, Dako, Hamburgo, Alemania), conejo-anti-humano Lyve -1 (1: 500, ReliaTech,
Braunschweig, Alemania), conejo-anti-humano Prox1 (1: 500, ReliaTech, Braunschweig, Alemania), vimentina anti-humano de
ratón (1: 200, Dako), PDGFRa anti-humano de ratón (1: 1, Dako), CD34 anti-humano de ratón (1: 200, Dako). Los anticuerpos
secundarios fueron: cabra-anti-ratón Alexa 488/594, cabra-anti-conejo Alexa 594, burro-anti-cabra Alexa 488 (MobiTech, Gotinga,
Alemania). Las secciones se tiñeron con Dapi y se montaron bajo cubreobjetos con Fluoromount-G (Southern Biotechnology, EE.
UU.). Las fotos fueron tomadas con AxioImagerZ1 (Zeiss, Gotinga, Alemania).

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las muestras se fijaron con el fijador original de Karnovsky durante la noche [ 25 ], se lavaron en tampón fosfato 0,15 M durante 10
min, se transfirieron a una solución de tetróxido de osmio y se incubaron durante 2 ha 4 ° C. Luego, las muestras se enjuagaron con
tampón fosfato 0,15 M durante 10 minutos y posteriormente se deshidrataron en una serie ascendente de etanol. Luego, las muestras
se transfirieron a una solución de inclusión Epon y se incubaron durante 24 ha 60 ° C. El tejido embebido se cortó con un
microtomo Ultracut E (Reichert-Jung) a secciones de 750 nm (semifino) y 90 nm (ultrafino). Las secciones semifinas se tiñeron con
la solución de Richardson y se estudiaron con un microscopio óptico. Las secciones ultrafinas se transfirieron a rejillas recubiertas
con formvar. Después del secado al aire, las muestras se incubaron 10 minutos en solución de acetato de uranilo al 1%, 10 minutos
en citrato de plomo [ 26] y enjuagado con agua purificada. Las muestras se analizaron con un microscopio electrónico de
transmisión Leo 906E (Zeiss).

Cultivo de células
Las células endoteliales linfáticas (LEC) se aislaron de malformaciones linfáticas de dos niños pequeños como se describió
anteriormente. Las células poseen características moleculares de los linfáticos iniciales [ 27 ]. La pureza del cultivo fue cercana al
100% según lo determinado por la doble tinción anti-CD31 y anti-Prox1. Como tercera sonda, utilizamos HDLEC derivados de
prepucio juvenil (PromoCell, Heidelberg, Alemania), controlados para la expresión de Prox1 y CD31. Para las células endoteliales
de sangre (BEC), elegimos una mezcla de tres líneas de BEC derivadas de prepucio juvenil (HDBEC; PromoCell). Las células eran
positivas para CD31 y al menos 90% de Prox1 negativo.

Preparación de ARN

El ARN total se aisló de LEC y BEC utilizando peqGOLD Tri-Fast (PeqLab, Erlangen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Se aislaron muestras de colector linfático de seis donantes femeninas (edad entre 44 y 61 años) del tejido conectivo
circundante y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. El tejido se molió finamente en nitrógeno líquido usando mortero y
mortero, y se recogió inmediatamente en reactivo Tri-Fast (PeqLab). Posteriormente, se preparó ARN total de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.

Secuenciación de próxima generación (NGS)

La calidad del ARN se evaluó midiendo el RIN (número de integridad del ARN) utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent
Technologies, Palo Alto, CA). La preparación de la biblioteca para RNA-Seq se realizó usando el kit de preparación de muestras de
ARN TruSeq ™ v2 (Illumina, Cat. N ° RS-122-2002) a partir de 1000 ng de ARN total. La cuantificación precisa de las bibliotecas
de ADNc se realizó con el sistema dsDNA QuantiFluor ™ (Promega). El rango de tamaño de las bibliotecas de ADNc finales se
determinó aplicando el chip DNA 1000 en el Bioanalyzer 2100 de Agilent (promedio de 350 pb). Las bibliotecas de ADNc se
amplificaron y secuenciaron mediante el uso de cBot y HiSeq2000 de Illumina (SR; 1x50 pb; ~ 25–40 millones de lecturas por
muestra). Las imágenes de secuencia se transformaron con el software BaseCaller de Illumina en archivos bcl, que se multiplexaron
en archivos fastq con CASAVA v1.8.2.

análisis estadístico

El control de calidad se realizó con fastqc (v. 0.10.0, Babraham Bioinformatics). La alineación de lectura se realizó usando STAR
v2.3.0 con el genoma de referencia hg19. Los datos se convirtieron y ordenaron por samtools 0.1.19 y las lecturas por gen se
contaron con htseq versión 0.5.4.p3. El análisis de datos se realizó utilizando R / Bioconductor (3.0.2 / 2.12) cargando DESeq,
gplots y paquetes goseq. Los genes candidatos se filtraron a un mínimo de cambio 1x veces y el valor p corregido por FDR
<0.05. Para el análisis funcional, se evaluó el enriquecimiento de ontología génica teniendo en cuenta la longitud del gen a través
del paquete R goseq. Los datos de secuencia se depositaron en el Omnibus de expresión génica (GEO) de NCBI y son accesibles a
través del número de acceso de la serie GEO GSE87360 . Un subconjunto de datos que muestran genes expresados en colector
linfático se presentan como S1 yTablas S2 .

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Resultados

Para el tratamiento del linfedema secundario del brazo en pacientes con cáncer de mama, se realizó un trasplante autólogo de
colectores linfáticos funcionales. Los trasplantes fueron tomados del muslo. En la hipodermis del muslo, existen numerosos
colectores linfáticos para que un solo colector pueda extraerse sin el riesgo de provocar linfedema en las piernas. Los colectores del
muslo se identificaron quirúrgicamente después de la inyección intradérmica de azul patente en los primeros espacios interdigitales
(Fig. 1A) Los colectores epifasciales del muslo podrían identificarse como delicados vasos azules, que fueron aislados y
trasplantados (Fig. 1B) La contractilidad espontánea de los recolectores se observó intraoperatoriamente. Los colectores se
trasplantaron a la región axilar y se realizaron anastomosis linfo-linfáticas para reconstituir el flujo linfático del brazo
edematoso. De este modo, la duración del trasplante debe superar ligeramente el espacio que debe ser puenteado en la axila. Las
piezas restantes de los colectores se utilizaron para estudios histológicos y moleculares.
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Figura 1
Detección de colectores linfáticos epifasciales en pacientes.

A) Inyección intradérmica de azul patente en los dos primeros espacios interdigitales del pie de un paciente. Tenga en cuenta el flujo centrípeto del
marcador en los vasos linfáticos. B) Aislamiento de un colector linfático, que está marcado en azul (flecha), en la hipodermis del muslo. CG ) Tinción
con anticuerpos contra CD31 (verde) y Prox1 (rojo) ( CF ), y control negativo con solo anticuerpos secundarios ( G ). Las células endoteliales
linfáticas expresan ambos marcadores (como se ve a mayor aumento en D, F). Vasa vasorum en adventicia (a) y medios (m) expresan solo
CD31. Barras = 150 μm en C; 25 μm en D; 15 μm en F y 200 μm en E, G.

En un primer paso, la naturaleza linfática de los colectores se verificó mediante inmunotinción con anticuerpos contra CD31 y
PROX1 [ 28 ]. La tinción endotelial doble positiva CD31 y PROX1 demostró inequívocamente la corrección de la caracterización
clínica de los colectores. Aunque los colectores variaron en diámetro entre 1.3–1.8 mm, los LEC que recubren su luz siempre fueron
positivos para los dos marcadores (Figura 1C – 1G) Vasa vasorum de colectores linfáticos se han encontrado previamente en la
adventicia [ 29 ], sin embargo, nuestros datos muestran claramente que los vasos sanguíneos CD31 + / PROX1- penetran en los
medios de los colectores que exceden un cierto diámetro (Fig. 1E) Estos vasos nutritivos también se encontraron en secciones semi
y ultra delgadas. Los estudios mostraron que los medios de los colectores más grandes (1,8 mm de diámetro) consistían en dos capas
de células de músculo liso (SMC), una capa interna gruesa con orientación predominantemente longitudinal y una capa externa
delgada con orientación predominantemente circular de SMC (Fig. 2A) Los vasos vasorum en los medios estaban formados por
capilares con pericitos invertidos por una lámina basal común (Fig. 2B) Ocasionalmente se encontró un SMC vascular en la pared
de los vasos nutritivos, indicativo de un metarteriole (datos no mostrados). El revestimiento interno de los colectores consistía en
delicados LEC que descansaban sobre una lámina basal. Por lo general, no estaba presente una capa de tejido conectivo
subendotelial, que es típica de los vasos sanguíneos más grandes. Por el contrario, los LEC estaban muy cerca de las SMC (Fig.
2C) Regularmente observamos procesos finos de SMC que penetraron la lámina basal tanto de SMC como de LEC y establecimos
contactos tipo remache entre los dos tipos de células (Fig 2D) A nivel TEM, pudimos distinguir entre dos tipos de SMC, con
citoplasma oscuro y claro (Fig. 2C y 2E) Ambos tipos poseían características típicas de las SMC, tales como lámina basal, caveolas,
cuerpos densos y un núcleo central con citoplasma suelto en los polos nucleares. Muchas SMC tuvieron numerosos procesos finos,
que culminaron en una 'morfología de estrella de mar' de algunas de las células (Fig. 2F)
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Figura 2
Secciones semi y ultrafinas de colectores linfáticos epifasciales humanos.
A) Sección transversal de semitina que muestra el lumen colapsado (L) del colector. El medio (M) está densamente lleno de células musculares lisas
(SMC). Tenga en cuenta la delgada capa circular de SMC (flecha) en el borde de la adventicia. BF ) Secciones ultrafinas. B ) Imagen TEM que
muestra un capilar en los medios de un colector, que consiste en células endoteliales y pericitos. E, eritrocitos. C ) Imagen TEM que muestra la luz (L)
de un colector linfático. La célula endotelial linfática posee procesos delgados dirigidos hacia las SMC en los medios. Tenga en cuenta la existencia de
SMC oscuros (flecha) y claros (asterisco). re) Imagen TEM del colector que se muestra en A). La luz colapsada está revestida por células endoteliales
linfáticas (LEC). Tenga en cuenta la unión tipo remache (flecha) entre un SMC y un LEC. E) Imagen TEM de los medios que muestran SMC. La
mayoría de las SMC tiene un citoplasma oscuro, algunas son claras (asterisco). F ) Imagen TEM de un SMC oscuro con 'morfología de estrella de
mar'. La luz (L) del colector está revestida por LEC. Barras = 150 μm en A, 2 μm en B, C, E, F y 1 μm en D.

Para una mayor caracterización de los colectores linfáticos, utilizamos marcadores que son muy característicos de los LEC de los
linfáticos iniciales. Encontramos la expresión de D2-40 en los vasos linfáticos iniciales del prepucio (Fig. 3A y 3B), pero no en
coleccionistas (Fig 3D y 3E) La proteína de matriz extracelular CCBE1 (dominios EGF de unión a colágeno y calcio 1) delimitó
ambas LEC de los linfáticos iniciales (Fig. 3A y 3C) y coleccionistas (Fig 3D y 3F) LYVE-1, un marcador típico de LEC en
linfáticos iniciales (Fig 3G), no se encontró en coleccionistas (Higo 3H) El filamento intermedio vimentina resultó ser un marcador
constante de LEC en linfáticos tanto iniciales como colectores. Además se expresó en células de la adventicia, y en mucho menor
medida en los medios de comunicación (Fig. 4A – 4D) Además, encontramos la expresión focal de β-catenina en LEC de colectores
(Fig. 4E), pero casi ninguno en los linfáticos iniciales. Por el contrario, la tinción focal positiva para ESAM-1 se encontró en los
vasos linfáticos iniciales, pero no en los colectores (Fig. 4F)
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Fig. 3
Estudios de inmunofluorescencia de linfáticos iniciales del prepucio y colectores linfáticos epifasciales.
AC ) Linfáticos iniciales. Tinción con los anticuerpos D2-40 ( A, B ) y CCBE1 ( A, C ). D2-40 marca LEC, mientras que CCBE1 delimita tanto LEC
como el endotelio vascular sanguíneo. Bar = 50 μm. DF ) Colector linfático. Tinción con los anticuerpos D2-40 ( D, E ) y CCBE1 ( D, F ). D2-40 no
se expresa, mientras que CCBE1 delimita los LEC de los recolectores. Bar = 200 μm. G ) LYVE-1 (rojo) marca los vasos linfáticos iniciales en el
prepucio. L, luz de los linfáticos; Ep, epidermis. Bar = 75 μm. H ) No se detecta señal LYVE-1 en colectores linfáticos. L, lumen del colector. Dapi
(azul) marca todos los núcleos. Bar = 150 μm.

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Higo 4
Estudios de inmunofluorescencia de linfáticos iniciales y colectores linfáticos epifasciales.

AC) Tinción de los vasos linfáticos iniciales con los anticuerpos Prox-1 ( A, B ) y vimentina ( A, C ). La vimentina se expresa en los vasos linfáticos
iniciales. L, luz de los linfáticos. Las puntas de flecha apuntan a los núcleos de LEC. Bar = 25 μm. D) Tinción de un colector linfático con anticuerpos
contra vimentina (verde). Observe la expresión en LEC, en numerosas células de la adventicia y algunas células dispersas en los medios. Bar = 200
μm. E ) Expresión focal de β-catenina en colectores linfáticos (L) y en vasos más grandes de la adventicia. Bar = 100 μm. F ) Expresión focal de
ESAM-1 en linfáticos iniciales (L) y fuerte expresión en capilares dérmicos. Dapi (azul) marca todos los núcleos. Bar = 35 μm.

La contractilidad peristáltica autónoma de los colectores linfáticos está muy bien establecida, sin embargo, las células marcapasos
que inician las contracciones SMC no se han identificado de manera inequívoca [ 21 ]. Una célula, que puede ser responsable de
esta actividad, es el ICLC. En el conducto torácico, se han demostrado ICLC en la capa externa de SMC de los medios
[ 17 ]. Utilizamos TEM, así como inmunohistología para marcadores que se han descrito como altamente específicos para ICLC
como vimentina, c-Kit y CD34, así como PDGFRα, un marcador para tumor de estroma gastrointestinal (GIST), que se origina en
ICLC [ 30] En los estudios TEM, observamos células ramificadas con un cuerpo celular perinuclear delgado y largos procesos
citoplasmáticos con diferentes calibres entremezclados y en contacto cercano con las SMC de los medios (Fig. 5A y 5B) Las células
no poseían una lámina basal continua, si la hubiera, y a menudo se ubicaban inmediatamente adyacentes a las SMC, que tenían una
cara densa con caveolas en los sitios de contacto (Fig. 5C y 5D) Por lo demás, las células ramificadas poseían características que se
han descrito previamente para las ICLC en el conducto torácico, por ejemplo, núcleo indentado y una cantidad regular pero baja de
caveolas. Nuestros estudios de inmunofluorescencia revelaron un tipo de célula con una morfología comparable. Se encontraron
células con procesos largos y delgados e inflamaciones de tipo varicoso en los medios, preferentemente en partes periféricas, con
anticuerpos contra vimentina y PDGFRα (Fig. 6A – 6D) De este modo, la doble tinción contra vimentina y PDGFRα parece ser el
marcador más confiable para ICLC (Fig. 6A – 6C) La tinción anti-c-KIT (CD117) (con anticuerpos de dos compañías) no
representaba ninguna célula ramificada en los medios, sino células granuladas redondas en la adventicia, que probablemente
representan mastocitos (Fig. 7A y 7B) El patrón de tinción con anti-CD34 es altamente complejo. En la dermis, los capilares
sanguíneos justo debajo de la epidermis fueron CD34 positivos, mientras que los linfáticos iniciales fueron negativos (Fig. 7F) En
las capas más profundas de la dermis, los BEC perdieron esta señal clara, mientras que múltiples células del tejido conectivo laxo
fueron positivas (datos no mostrados). En los colectores linfáticos, los fibrocitos de la adventicia fueron positivos, y se observó una
malla de células CD34 +, que probablemente representan fibrocitos, penetrando el tercio externo de los medios de los colectores
obviamente a lo largo del vasa vasorum (Fig. 7C y 7D) No observamos superposición de las señales CD34 y αSMA. Las dos señales
eran mutuamente excluyentes. En colectores de menor calibre, los fibrocitos positivos para CD34 también se observaron en partes
más profundas de los medios, lo que indica una mayor contribución de los fibrocitos a los medios de los colectores más pequeños
(Fig. 7E)

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Higo 5
Estudios TEM de ICLC en los medios de colectores linfáticos.

A ) ICLC (flecha) con cuerpo celular delgado y varios procesos citoplasmáticos rodeados de SMC. Bar = 5 μm. B ) Proceso largo de un ICLC (flechas)
en contacto cercano con SMC. Bar = 2 μm. C ) Mayor aumento de B), que muestra acumulaciones de caveolas (flechas) en SMC adyacentes al
ICLC. Barra = 0.8μm. D ) protuberancias similares a clavijas de SMC con caveolas (flechas) separadas por placas densas subyacentes a la membrana
plasmática, adyacentes a un proceso de ICLC. Bar = 0.2μm.
Higo 6
Estudios de inmunofluorescencia de ICLC en colectores linfáticos.

Tinción con anticuerpos contra vimentina (verde) ( A, B, D ) y PDGFRα (rojo) ( A, C ). Observe ICLC ramificado doble positivo (flecha en AC) en los
medios del colector. Bar = 50 μm. D ) Mayor aumento que muestra células positivas para vimentina con procesos largos (flechas), que poseen
inflamaciones de tipo varicoso. Dapi (azul) marca todos los núcleos. Bar = 35 μm.
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Higo 7
Estudios de inmunofluorescencia de colectores linfáticos y dermis.

A, B ) Tinción con anticuerpos anti-cKIT (CD117) de colectores linfáticos. Las células redondas granuladas que expresan c-KIT (flechas) se
encuentran en la adventicia de los recolectores. Barra = 250 μm en A y 25 μm en B. CE ) Tinción de un colector linfático con anticuerpos anti-CD34
(rojo) y anti-αSMA (verde). C, D ) En grandes colectores, las células CD34 + (flecha) se encuentran en la adventicia y en las partes externas de los
medios entre las SMC αSMA positivas. Bar = 150 μm. D ) Mayor aumento de C que muestra células CD34 + nucleadas (flecha). No hay células doble
positivas son visibles. Bar = 60 μm. mi) Colector de menor calibre teñido con anticuerpos anti-CD34 (rojo) y anti-αSMA (verde). Las células CD34 +
se encuentran en todas las partes de los medios. Bar = 200 μm. F ) Tinción del prepucio con anticuerpos anti-CD34 (verde) y anti-Lyve-1 (rojo). Los
capilares sanguíneos debajo de la epidermis expresan CD34. Los linfáticos positivos para Lyve-1 son negativos para CD34. Dapi (azul) marca todos
los núcleos. Bar = 150 μm.

La fuerza impulsora esencial para el flujo linfático es la contractilidad peristáltica de las SMC en los medios de los colectores, lo
que representa un objetivo atractivo para la terapia farmacológica del linfedema. Para una caracterización molecular global,
utilizamos secuenciación de próxima generación y comparamos colectores linfáticos con i) LEC derivados de los linfáticos iniciales,
y ii) BEC derivados de microvasos dérmicos. Se eliminó la adventicia de los coleccionistas. Dado que la mayoría de las células en
los colectores son SMC, se podría esperar que los genes expresados por el colector encontrados simultáneamente en ambas listas
fueran genes SMC. Establecimos el umbral para el cambio de pliegue log2 (Log2FC) en 2, y encontramos 2518 genes candidatos en
colectores en comparación con LEC ( Tabla S1 ) y 2151 genes candidatos en comparación con BEC ( Tabla S2)

La suposición de que la mayoría de los genes expresados en el colector, que aparecieron en ambas listas, eran genes SMC, fue
respaldada por la muy alta expresión de: actina, tanto del tipo de músculo liso (ACTA2) como del tipo entérico (ACTG2 ), así como
la desmina (DES), la miocina decorina (DCN) [ 31 ] y su lumican (LUM) estrechamente relacionado, la cadena pesada de miosina
11 (MYH11), la miosina típica de SMC [ 32 ], fosfolamban (PLN) , que controla los niveles celulares de calcio [ 33 ], el receptor 2
de rianodina (RYR2), un canal de liberación de calcio sarcoplasmático descrito principalmente en cardiomiocitos [ 34 ],
sarcoglucano-alfa (SGCA), un miembro del complejo distrofina-glucoproteína con funciones para vascular estabilidad [ 35], el
receptor de endotelina A (EDNRA) [ 36 ], la proteína de reserva de iones de calcio calsequestrina-2 (CASQ2) [ 37 ], numerosas
proteínas del canal Ca como el canal de calcio, dependiente de voltaje, tipo T α1H (CACNA1H) [ 38 ], calponina 1 (CNN1), que
inhibe tónicamente la actividad ATPasa de la miosina en las SMC [ 39 ], CRISPLD2, un gen sensible a glucocorticoides que modula
la función de las citocinas en las SMC de las vías respiratorias [ 40 ], la dermatopontina (DPT), una proteína de matriz extracelular
que está significativamente disminuido en el leiomioma uterino [ 41 ], varios receptores de EPH, que están involucrados en la
diferenciación e identidad vascular, la proteína ECM fibulina-1 (FBLN1), que es importante para la estabilidad vascular [ 42]], el
microARN143 (mir143), que regula el fenotipo proliferativo de las SMC [ 43 ], la trombospondina 4 (THBS4), que está asociada
con la enfermedad coronaria prematura [ 44 ], la sinaptopodina 2 (SYNPO2), una proteína asociada a la actina [ 45] ], así como la
superóxido dismutasa 3 (SOD3), una enzima antioxidante extracelular a menudo asociada con la superficie de las células
endoteliales [ 46 ].

Mejorar la contractilidad de los colectores linfáticos es una opción terapéutica prometedora para el tratamiento del linfedema, que
puede lograrse, por ejemplo, mediante la activación de los sistemas simpático, serotoninérgico, purinérgico y neuropeptidérgico. En
colectores linfáticos superficiales del muslo humano , detectamos una alta expresión de adrenoceptores α 2A, B, C (ADRA2A,
ADRA2B, ADRA2C), receptores de 5-hidroxitriptamina (serotonina) HTR2B y 3C; receptores purinérgicos (P2RX1, P2RY12, 13,
14), receptores neuropéptidos Y 1 y 5 (NPY1R, NPY5R), receptores de taquiquinina 1 y 2 (TACR1, TACR2) y receptor de péptido
intestinal vasoactivo 2 (VIPR2), así como adenilato ciclasa hipofisaria polipéptido activador tipo I receptor 1 (ADCYAP1R1).

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Discusión

Heterogeneidad de las células endoteliales linfáticas.

El sistema vascular linfático consta de linfáticos iniciales, precolectores, colectores, ganglios linfáticos y troncos. Estas secciones
del sistema linfovascular difieren con respecto a su morfología, función y entorno molecular. Los linfáticos iniciales absorben
líquido intersticial, los colectores y los troncos poseen funciones de transporte, y los ganglios linfáticos facilitan el contacto íntimo
entre la linfa y las células inmunes. Mientras que los linfáticos iniciales se caracterizan por válvulas inter-endoteliales, que permiten
la entrada de líquido intersticial [ 4 ], los colectores linfáticos parecen estar muy apretados [ 21 ]. Estas diferencias se reflejan en
diferentes configuraciones moleculares [ 2] Confirmamos la expresión del receptor de hialuronano Lyve-1 y la glicoproteína
podoplanina, detectada por el anticuerpo D2-40, en los linfáticos iniciales. Además, observamos la expresión focal de la molécula
de adhesión selectiva de células endoteliales ESAM-1 en LEC de linfáticos iniciales, pero no en colectores. La combinación más
confiable de marcadores para LEC son los anticuerpos contra CD31 (PECAM-1) y el factor de transcripción PROX1, que demarcan
los LEC en linfáticos iniciales, colectores y ganglios linfáticos de niños, adultos y ancianos en salud y enfermedad [ 28 , 47 , 48] La
expresión de CD31 y Prox1 demostró la exactitud del diagnóstico clínico para los recolectores, que se realizó mediante la absorción
y el transporte de Patent Blue inyectado por vía intradérmica en el primer y segundo espacio interdigital del pie. La expresión de
Prox1 diferencia claramente los vasos linfáticos de los vasos sanguíneos, como el vasa vasorum , que observamos por primera vez
en los medios de comunicación de los coleccionistas más grandes.

Además, identificamos nuevos marcadores para LEC de los recipientes iniciales y colectores. Estos son CCBE1 y
vimentina. CCBE1 es una gran proteína ECM con múltiples capacidades de unión para, por ejemplo, calcio, colágeno y VEGF-C
[ 49 ]. Las mutaciones del gen CCBE1 causan un síndrome altamente complejo, el síndrome de Hennekam. Los niños afectados
muestran múltiples defectos que incluyen retraso mental, displasia facial, hipoproteinemia, así como linfedema generalizado
[ 50 ]. La expresión constante de CCBE1 a lo largo de los vasos linfáticos iniciales y de recolección defiende una función
permanente de las proteínas de unión a VEGF-C para el mantenimiento de las redes linfáticas. El filamento intermedio vimentina se
expresa típicamente en las llamadas células mesenquimales [ 51] Sin embargo, el término está mal definido, ya que durante el
desarrollo casi todos los tipos de células experimentan fases mesenquimatosas y epiteliales, y las células endoteliales diferenciadas
son definitivamente células epiteliales. En el diagnóstico patológico, la vimentina se usa como marcador para tumores de origen de
tejidos blandos. El anticuerpo PAL-E detecta una forma secretada de vimentina en las células endoteliales venosas [ 52 ]. Aquí
mostramos que la vimentina es un marcador confiable para LEC, que debe tenerse en cuenta en los diagnósticos patológicos.

En LEC de colectores linfáticos, también identificamos la expresión del mediador de señalización de WNT β-catenina. La
señalización de WNT rara vez se ha estudiado en linfáticos (para revisión ver: [ 53 ]). Recientemente hemos observado una función
para WNT5A durante la morfogénesis normal de los vasos linfáticos dérmicos [ 54 ]. Se ha demostrado que la regulación de la
polaridad de las células planas por WNTs es un componente morfogenético durante la formación de válvulas en colectores linfáticos
[ 55 ].

Contractilidad autónoma de colectores linfáticos.

Hace bastante tiempo se han observado contracciones autónomas, dependientes de la temperatura de los colectores linfáticos,
primero en animales [ 56 ] y más tarde en el hombre [ 8 ]. Observamos contracciones durante el aislamiento y trasplante de
colectores de muslos epifasciales. El bombeo de colectores se puede visualizar en vivo en pacientes con cámaras infrarrojas después
de la inyección del trazador ICG [ 7 ]. El inicio de las contracciones del colector solo se comprende de manera incompleta. En las
ovejas, se han encontrado posibles células marcapasos en posiciones subendoteliales, y podrían teñirse con anticuerpos contra
vimentina y c-kit [ 14] Debido a su parecido con las células intersticiales de Cajal en el tracto gastrointestinal, las células se
llamaron células intersticiales similares a Cajal (ICLC). Se han encontrado en el conducto torácico humano y se caracterizan a nivel
TEM [ 17 ]. Los ICLC que encontramos en los medios de los colectores de muslos humanos cumplen con todos los criterios
establecidos para este tipo de células: células ramificadas con procesos largos y delgados de diámetro variable, caveolas, lámina
basal ausente y contacto cercano con las células vecinas. Hemos encontrado tales ICLC en contacto íntimo con SMC. Es de destacar
que las SMC poseen numerosas caveolas en los sitios de contacto. Las caveolas tienen varias funciones, como endocitosis,
mecanosensibilidad y señalización celular a través de NO y calcio [ 57] Junto con la alta expresión de fosfolambán, que controla los
niveles de calcio celular [ 33 ], y el canal sarcoplásmico de liberación de calcio rianodina receptor 2, que encontramos con NGS en
los colectores, esto apunta a una regulación de la contractilidad del colector a través de la señalización de calcio.

En aprox. El 5% de las células derivadas de colectores linfáticos de ovejas, McCloskey y colaboradores (1999) detectaron una
corriente interna activada por hiperpolarización (llamada corriente divertida), indicativa de células marcapasos (ICLC) [ 14 ]. Como
se señaló anteriormente, los estudios inmunohistológicos indicaron la expresión de vimentina y c-kit en tales células [ 58 ]. Nuestros
estudios sugieren la existencia de diferencias de especies en lo que respecta al equipo molecular de los ICLC. Observamos la
coexpresión de vimentina y PDGFRα en células ramificadas en los medios de los colectores humanos, pero no c-KIT, que
estudiamos con dos anticuerpos diferentes. De acuerdo con otros estudios, encontramos la expresión de c-KIT en células granuladas,
tanto en la dermis como en la adventicia de los coleccionistas. Las células que probablemente representan los mastocitos [ 59] CD34
claramente delimita los fibrocitos en la adventicia, lo que está en línea con estudios previos [ 28 ], y el uso de CD34 como marcador
para el diagnóstico de tumores fibrosos [ 60 , 61 ]. Una continuación de esta señal se encuentra en los medios. En colectores de gran
calibre, las células CD34 + se encuentran principalmente en las partes periféricas de los medios. En colectores más pequeños, estas
células se encuentran en todos los medios. Allí, el número de células CD34 positivas era obviamente demasiado grande como para
representar ICLC. Lo más probable es que CD34 represente fibroblastos en la pared de los colectores.

Curiosamente, la expresión de PDGFRα en ICLC humanos está en línea con la observación de que las mutaciones en
el gen PDGFR α causan el tumor del estroma gastrointestinal (GIST), un tumor que se origina en las células intersticiales de Cajal
en el tracto gastrointestinal [ 30 ]. Sin embargo, el hecho de que las mutaciones de c-KIT también puedan causar GIST indica
heterogeneidad de células intersticiales de Cajal e ICLC. Se ha encontrado la coexpresión de vimentina y c-KIT en células del
conducto torácico humano [ 17 ]. Usando los mismos anticuerpos, no pudimos detectar c-KIT en colectores linfáticos
humanos. Nuevamente, esto puede indicar heterogeneidad, y también puede proporcionar una explicación para la observación de los
números de centros comerciales de c-KIT-negativo GIST [ 62 ].

Dianas terapéuticas en colectores linfáticos

La activación de SMC en colectores linfáticos representa un objetivo prometedor para el tratamiento farmacológico del
linfedema. Las SMC de los colectores linfáticos representan un sincitio funcional [ 63 ]. Curiosamente, observamos heterogeneidad
de SMC a nivel TEM. La mayoría de las SMC poseen un citoplasma oscuro, pero algunas son claras. Es tentador especular que los
dos tipos de SMC cumplen diferentes funciones y, como en el corazón, los ligeros pueden tener principalmente funciones
conductoras en lugar de contráctiles.

Todavía no se ha realizado una caracterización global de los colectores linfáticos humanos. Sin embargo, este conocimiento es el
requisito previo para intervenciones terapéuticas dirigidas a mejorar, por ejemplo, enfermedades inflamatorias (linfangitis) o
funciones contráctiles de los recolectores. Este último puede ser aplicable a millones de pacientes en todo el mundo que sufren de
linfedema secundario. Por lo tanto, aplicamos NGS y comparamos colectores de muslos aislados con cultivos de LEC y BEC
aislados. Encontramos 2518 genes expresados en colector en comparación con los LEC, y 2151 genes expresados en colector en
comparación con los BEC. Los genes superpuestos en ambas listas parecen representar principalmente genes expresados en SMC,
como lo confirma la alta expresión de genes SMC típicos resaltados en las tablas S1 y S2 .

Sin embargo, aunque existe evidencia de que numerosos de los genes enumerados en el S1 y S2Las tablas se expresan en SMC,
debemos ser conscientes del hecho de que la pared de los colectores está compuesta por varios tipos de células, incluidas SMC,
ICLC, fibrocitos, adipocitos, mastocitos, LEC, BEC y otros, y además hay heterogeneidad dentro de algunos de los tipos de células,
por ejemplo, observamos SMC oscuros y claros. Por lo tanto, la comparación con LEC y BEC cultivados (que poseen un equipo
molecular que no es idéntico a sus contrapartes en los colectores) no producirá una lista de genes que puedan atribuirse a un tipo de
célula específico. Sin embargo, estamos convencidos de que nuestro estudio es un punto de partida para buscar objetivos específicos
de medicamentos en colectores linfáticos. Es posible que algunos de los objetivos terapéuticos potenciales que se analizan a
continuación no se expresen en SMC, sino en otros tipos de células. Esta suposición es compatible, por ejemplo62 , 64 ]. Esto indica
que varios genes diana pueden expresarse en ICLC de los colectores, lo que, de hecho, puede ser incluso una ventaja para el
tratamiento del linfedema.

Para el tratamiento del linfedema, los receptores adrenérgicos y peptidérgicos parecen ser de gran interés. En animales, se han
encontrado nervios noradrenérgicos, purinérgicos, colinérgicos y peptidérgicos a lo largo de colectores linfáticos [ 21 ], y la
activación de la cadena simpática en animales aumenta la frecuencia de contracciones espontáneas [ 65 ]. La inervación adrenérgica
también se ha encontrado en el conducto torácico humano [ 66 ]. En coleccionistas, encontramos expresión de la α 2adrenoceptores
ADRA2A, ADRA2B y ADRA2C, que están acoplados a proteínas G. Además de los efectos en el sistema nervioso central,
controlan las funciones SMC, como la contracción de las astillas en el tracto gastrointestinal (GI), pero también la disminución de la
motilidad de las SMC en el tracto GI, así como la constricción de ciertas arterias y venas [ 67 - 69 ]

Los receptores de 5-hidroxitriptamina (serotonina) HTR2B y HTR3C, que encontramos en los colectores, parecen ser de especial
interés. La serotonina es un potente inductor de la contracción de los vasos sanguíneos y también causa efectos psicológicos en el
sistema nervioso central. La mayor parte de la serotonina del cuerpo se encuentra en las células de enterocromafina del tracto
gastrointestinal, donde promueve la motilidad [ 70 ]. Un efecto similar en la contractilidad de los colectores linfáticos podría ser
beneficioso.

Existen receptores purinérgicos con numerosos subtipos (P0, P1 y P2), y están ampliamente distribuidos en el organismo. En
colectores linfáticos, detectamos los receptores purinérgicos P2RX1, P2RX6, P2RY12, P2RY13 y P2RY14. Los receptores P2Y son
receptores acoplados a proteínas G (GPCR) [ 71 ]. El antagonista de P2RY12 está en uso clínico como inhibidores de la agregación
plaquetaria [ 72 ]. Los siete subtipos de receptores P2X forman canales iónicos homo y heteroméricos [ 73 ].

El neuropéptido Y (NPY) es un péptido de 36 aminoácidos, que ejerce varios efectos diversos, como el control de la actividad
psicomotora, la ingesta de alimentos y la actividad cardiovascular [ 74 , 75 ]. Los receptores NPY son GPCR [ 76 ]. Identificamos
NPY1R y NPY5R en colectores linfáticos humanos.

El péptido intestinal vasoactivo (VIP) es una hormona peptídica de 28 aminoácidos, que estimula la contractilidad del corazón y
relaja los SMC de la aorta, la tráquea, la vesícula biliar y el intestino [ 77 ]. Detectamos la expresión del receptor VIP 2 (VIPR2) y
su receptor relacionado ADCYAP1R1 (receptor 1 del polipéptido de activación de adenilato ciclasa pituitaria tipo I) [ 78 ] en
colectores linfáticos. Se han detectado pocas fibras nerviosas VIP positivas en las proximidades de los linfáticos humanos [ 18 ].

Además, en los colectores, identificamos los receptores de taquiquinina 1 y 2 (TACR1, TACR2 = receptores de neuroquinina), que
son GPCR que se unen a la sustancia P (SP). SP, un péptido de 11 aminoácidos, fue identificado originalmente por su capacidad de
causar contracciones intestinales [ 79 ]. SP induce vasodilatación y por lo tanto actúa a través de la liberación de NO [ 80 ]. La
relajación por SP se ha demostrado ex vivo en linfáticos mesentéricos de rata [ 81 ] y, en ratas, se ha observado una diafonía
mediada por SP entre señalización proinflamatoria y contráctil [ 82]] Y entre otros, identificamos la expresión de los receptores de
bradiquinina B1 y B2 (BDKRB1, BDKRB2) en los colectores. La bradiquinina es un péptido de 9 aminoácidos. Es un vasodilatador
y mediador inflamatorio dependiente del endotelio. Los antagonistas de la bradiquinina han sido probados en angioedema
hederitario [ 83 , 84 ].

La gran cantidad de agonistas y antagonistas específicos que existen para los receptores adrenérgicos, serotoninérgicos, purinérgicos
y peptidérgicos en combinación con la posibilidad de visualizar el bombeo de colectores linfáticos que viven en la dermis de
pacientes con el método ICG abre un nuevo campo de enfoques terapéuticos para linfedema

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información de soporte
Mesa S1
Lista de 2518 genes al menos 4 veces mayor expresados en colectores linfáticos epifasciales humanos de muslo que en LEC
humanos cultivados.

Los genes se enumeran alfabéticamente por símbolo HGNC. Log2FC: cambio de pliegue Log2; FDR: tasa de descubrimiento
falso. Los genes SMC altamente expresados, que aparecen en ambas listas y se discuten en el manuscrito, están marcados en verde.

(PDF)

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Mesa S2
Lista de 2151 genes al menos 4 veces mayor expresados en colectores linfáticos epifasciales humanos de muslo que en BEC
humanos cultivados.

Los genes se enumeran alfabéticamente por símbolo HGNC. Log2FC: cambio de pliegue Log2; FDR: tasa de descubrimiento
falso. Los genes SMC altamente expresados, que aparecen en ambas listas y se discuten en el manuscrito, están marcados en verde.

(PDF)

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