1. CUAL FUE EL TRABAJO DE W. COULTER? El principio Coulter de medicin de volumen y recuentos de partculas se lo debemos a Wallace H.

Coulter quien el ao 1956 invent el primer contador automtico de clulas sanguneas (1) W. Coulter describi su mtodo "El instrumento emplea un sistema de medicin no ptico que provee un rango de medicin que excede las 6.000 clulas individuales por segundo con un intervalo de conteo de 15 segundos. Una suspensin de clulas sanguneas es pasada a travs de un pequeo orificio simultneamente con una corriente elctrica. Las clulas sanguneas individuales pasando a travs del orificio producen un cambio de impedancia (resistencia) en el orificio el cual est determinado por el tamao de la clula. El sistema cuenta las clulas individuales y provee distribucin de tamaos. El nmero de clulas contadas por muestra es aproximadamente 100 veces mayor que los recuentos microscpicos, reduciendo el error estadstico aproximadamente 10 veces"(1)

Figura que muestra el Principio Coulter

El nmero de pulsos elctricos indica la cantidad de partculas que pasan a travs de la apertura y el tamao de los pulsos es proporcional al volumen de las partculas (2, 3, 4,5). Los contadores modernos an siguen usando este mtodo, el cual es el mtodo de referencia para recuentos de clulas Los contadores COULTER realizan este recuento por triplicado para eritrocitos, leucocitos y plaquetas Este sistema es actualmente el mtodo de referencia para el recuento de clulas y es usado por todos los fabricantes de contadores celulares El Coulter Counter Model S fue el primer instrumento que de manera automtica proces datos multiparamtricos en sangre.

2. COMO SE DEFINE EL CITMETRO DE FLUJO?

Se define como citmetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades celulares (partculas biolgicas) que fluyen en suspensin. Existen citmetros que poseen, adems, la capacidad de separar partculas de forma selectiva, a partir de una suspensin lquida, denominndose "sorters". 3. DESCRIBA UN CLITMETRO DE FLUJO? Un citmetro de flujo tiene tres sistemas principales:

Sistema hidrulico Se compone de un conjunto de controles neumticos y fludicos necesarios para establecer un flujo laminar que permita a la suspensin celular atravesar la cmara de flujo de forma estable e individual. Sistema ptico Consta de: lser, filtros, lentes y detectores. La fuente de luz es producida normalmente por un lser (en algunos modelos, sobre todo en investigacin, se combinan varias fuentes de luz). En la mayora de los citmetros se instala un lser de gas (comunmente argn) refrigerado por aire, que produce una luz monocromtica de 488 nm. Esta luz es utilizada para la excitacin de la mayora de los fluorocromos y provoca la dispersin de luz que nos informa de las caractersticas celulares.

Sistema electrnico-informtico Convierte la luz dispersa en seales elctricas y las procesa para su posterior anlisis. La perfecta integracin de estos sistemas permite un rpido y preciso anlisis de un elevado nmero de clulas en poco tiempo.

4. CUAL ES LA UTILIDAD DE LA CITOMETRA DE FLUJO EN LA MEDICINA?

1. Deteccin y cuantificacin de antgenos: Identificacin de antgenos mediante anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos, que permiten la identificacin y clasificacin de diferentes clulas tanto normales como patolgicas. El isotiocianato de fluorescena, la ficoeritrina y el PerCP son los fluorocromos ms empleados en el marcaje de anticuerpos monoclonales. Todos ellos se excitan a 488 nm (luz azul) y emiten en la zona del verde, naranja y rojo, respectivamente. El citmetro mediante una compensacin electrnica permite su utilizacin simultnea. La posibilidad de realizar un triple marcaje con diferentes anticuerpos monoclonales en una misma muestra ha permitido profundizar en el conocimiento de las diferentes poblaciones celulares estudiadas. As, se han logrado importantes avances en el diagnstico clnico y clasificacin de leucemias y linfomas. En otras reas tambien se ha demostrado su utilidad como en la deteccin de autoanticuerpos e inmunocomplejos, en el diagnstico de trombocitopatas adquiridas, y en la realizacin del test cruzado linfocitario. 1.A. Subpoblaciones linfocitarias: La monitorizacin de las subpoblaciones linfocitarias en el sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), fundamentalmente la cuantificacin en sangre perifrica de las clulas CD4+ y los linfocitos CD8+, aporta un valor diagnstico y pronstico en esta patologa En la actualidad representa una tcnica de rutina en muchos laboratorios, ante la necesidad de establecer controles peridicos del nmero de clulas CD4+ en estos pacientes. En otras reas ha demostrado su utilidad como en el diagnstico y clasificacin de las inmunodeficiecias primarias, en la monitorizacin de enfermedades autoinmunes como la esclerosis mltiple, el lupus eritematoso sistmico y la artritis reumatoide. Tambin se ha demostrado til en el seguimiento de la recuperacin inmune trs el trasplante de mdula sea, en la identificacin precoz del rechazo en pacientes que han recibido un trasplante alognico, o en la monitorizacin terapetica de los enfermos con anemia aplsica. Por ltimo, resear la utilidad de la determinacin de poblaciones linfocitarias en liquidos de lavados broncoalveolares con fines diagnsticos en la sarcoidosis y en la neumonitis por hipersensibilidad. 1.B. Inmunofenotipaje de leucemias y linfomas: El inmunofenotipaje es til en la clasificacin de las leucemias linfoblsticas agudas, as como en las crisis blsticas de los sindromes mieloproliferativos y mielodisplsicos, con implicaciones terapeticas y pronsticas. En las leucemias mieloblsticas agudas tambien permite su clasificacin. Su utilidad es evidente en el diagnstico de las leucemias megacarioblsticas. Adems la reactividad de algunos antgenos como el CD34, CD11b y CD7 se ha relacionado con el pronstico. En los sindromes linfoproliferativos crnicos permite un diagnstico diferencial rpido entre una linfocitosis reactiva y un proceso monoclonal, facilitando su diagnstico. El triple marcaje CD19/kappa/lambda permite detectar monoclonalidad B en sangre perifrica, mdula sea, ganglio o bazo. Otro aspecto es la deteccin de enfermedad mnima residual en las leucemias agudas en remisin. En estos pacientes, la comprobacin de la persistencia de clulas con fenotipos

leucmicos durante el tratamiento quimioterpico o su incremento tras la remisin completa, facilita el diagnstico precoz de recadas. 1.C. Otras aplicaciones de la determinacin de antgenos: La deteccin de inmunoglobulinas humanas mediante citometra de flujo facilita el diagnstico de diferentes enfermedades autoinmunes como la prpura trombopnica idioptica, las anemias hemolticas y las neutropenias autoinmunes. La realizacin del test cruzado linfocitario constituye el mtodo de mayor sensibilidad y especificidad para demostrar antes del trasplante la presencia de anticuerpos preformados dirigidos frente a antgenos HLA de clase I y II, antgenos de clulas del endotelio vascular y del sistema monocitario. El diagnstico de trombocitopatas congnitas como la enfermedad de Glanzman y el sindrome de Bernard-Soulier, mediante el hallazgo de la ausencia de expresin en la membrana plaquetaria de las glicoproteinas IIb/IIIa y Ib, respectivamente. Otras aplicaciones son el tipaje dirigido frente al antgeno HLA-B27, la cuantificacin de receptores de progesterona/clula en los tumores de mama, el recuento de clulas "stem" en muestras de sangre perifrica y de mdula sea obtenidas para posterior trasplante. 2. Cuantificacin de ADN: Existen diferentes fluorocromos capaces de unirse al ADN celular, de ellos el yoduro de propridio y el bromuro de etidio son los ms utilizados en citometra de flujo. Ambos se excitan a una longitud de onda de 488 nm y se une de forma estequiomtrica a la doble cadena de ADN. El problema es que se unen tambin al ARN de doble cadena lo que obliga a tratar a las clulas previamente con una ARNasa. La tincin con estos fluorocromos obliga a fijar o permeabilizar la membrana celular. La cuantificacin de ADN nos informa sobre la existencia o no de anomalas clonales de ADN (aneuploidias de ADN) y, por otra parte nos permite conocer la distribucin de una poblacin celular determinada a lo largo de las distintas fases del ciclo celular. En el rea de la patologa tumoral contribuye al diagnstico y a la valoracin pronstica de estos pacientes. Los principales usos clnicos en tumores slidos son: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Ayudar en el diagnstico de malignidad cuando los cambios morfolgicos son equvocos. Subclasficar las lesiones de baja malignidad ("borderline"). Aportar informacin pronstica de valor independiente al estadio y grado. Monitorizar la respuesta al tratamiento. Valorar la posibilidad de recidiva. Establecer el origen sncrono o metcrono de los tumores.

Hoy da se sabe que la presencia de aneuploida (cantidad no diploide de ADN) constituye un factor pronstico adverso en la gran mayora de los tumores slidos y hemopatas malignas, con excepcin del neuroblastoma, el rabdomiosarcoma y la leucemia linfoblstica aguda del nio en los que condiciona una mejor evolucin. As mismo, se ha observado en algunos estudios que la existencia de una elevada tasa proliferativa en tumores slidos y en hemopatas malignas se asocia con una supervivencia ms corta.

Aqu son excepcin los sndromes mielodisplsicos donde la existencia de una mayor proporcin de clulas en fase S (sntesis) en la mdula sea se asocia con un mejor pronstico. El empleo combinado de cuantificacin de ADN y marcaje para diferentes antgenos de clulas tumorales y/o oncoprotenas permite la identificacin y clculo selectivo del ciclo celular de la poblacin neoplsica. 3. Cuantificacin de ARN: La cuantificacin de ARN con fluorocromos como el naranja de tiazol, la tioflavina T o la pironina Y se utiliza como tcnica de rutina en el recuento de reticulocitos y en general en la produccin celular de la mdula sea. Adems la citometra de flujo proporciona informacin sobre el contenido de ARN de cada reticulocito dato que indica su estado madurativo. 4. Otras aplicaciones de la citometra de flujo: El cariotipo de flujo representa un complemento y una alternativa a los mtodos clsicos de estudio de los cromosomas en metafase. Los cromosomas se aislan a partir de preparaciones en metafase y se tien con fluorocromos. Los cromosomas en suspensin se analizan pasando de uno en uno por delante de la fuente de luz del citmetro. Permite la deteccin de anomalas cromosmicas. La separacin de cromosomas permite purificar cromosomas en relacin con su intensidad de fluorescencia o contenido en ADN. Es de utilidad en la realizacin de mapeo gentico y en la produccin de librerias de ADN recombinante. La utilizacin conjunta de hibridacin in situ por mtodos fluorescentes y de la citometra de flujo permite una cuantificacin rpida y precisa de distintas protenas a estudiar como es el caso de la P-glicoproteina y del gen MDR1 en los fenmenos de resistencia a multidrogas de clulas tumorales. La citometra de flujo, utilizando yoduro de propridio, tambin permite realizar cuantificacin de clulas en situacin de apoptosis (muerte celular inducida). Esta tcnica se ha utilizado para estudiar clulas CD4+ de pacientes VIH+ con una alta tasa de apoptosis.

5. CULES SON LAS MUESTRAS QUE SE UTILIZAN?

La CMF se puede emplear para estudiar caractersticas estructurales y funcionales de clulas o partculas en suspensin. Las aplicaciones fundamentales de esta tcnica se dan en biologa y medicina y son la identificacin de antgenos celulares mediante tcnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular. La CMF se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos: En hematologa: contaje celular, frmula leucocitaria, contaje reticulocitario, anlisis de mdula sea. En farmacologa: estudios de cintica celular. En inmunologa: subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulacin linfocitaria. En oncologa: diagnstico/pronstico, monitorizar tratamiento. En microbiologa: diagnstico bacteriano y vrico, sensibilidad a antibiticos. En gentica: cariotipo, diagnstico de portador, diagnstico prenatal.

6. QUE SON FLUOROCROMOS Y PARA QUE SE UTILIZAN?

Son productos qumicos que al ser estimulados con fotones con longitud de onda comprendida entre determinados rangos (de excitacin) emiten a su vez otro fotn de longitud de onda mayor (de emisin). El prototipo es la fluorescena que al ser estimulada con luz ultravioleta (no visible) emite luz de color verde (visible) aunque existen muchos otros como picoeritrina, rodamina, rojo de texas etc. Los fluorocromos ofrecen un mtodo sensible para obtener informacin acerca de la estructura, funcin y vitalidad de las clulas. En citometra, el fluorocromo ideal debera tener un alto coeficiente de extincin a la longitud de onda de excitacin (probabilidad de absorber la luz), un alto rendimiento cuntico (emisin de luz), una elevada fotoestabilidad y un corto estado de excitacin. Si el fluorocromo va unido a otra molcula, por ejemplo un anticuerpo monoclonal que le confiera especificidad de marcaje, debe ser insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente. 1.- Marcadores fluorescentes de unin covalente: Se utilizan para marcaje de protenas, lpidos o bin otras molculas biolgicas. El ms empleado es el isotiocianato de fluorescena (FITC). Otros que se han descrito son rodamina, rojo texas, cianinas y ficoeritrina. Este ltimo se utiliza mucho porque, tras ser excitado a 488 nm, emite ms all del espectro de la fluorescena, permitindo el doble anlisis con un slo lser. 2.- Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Marcadores del contenido en ADN y ARN: Hoechst, DAPI, DIPI, cromomicina A3, mitramicina, naranja de acridina, y otros. De uso comn es el yoduro de propidio, que se excita con un lser de 488 nm y se une al ADN por intercalacin entre la doble cadena de bases. Marcadores de potencial de membrana: cianinas y RH 123. Tambin se utilizan para marcaje de mitocondrias, dado la alta diferencia de potencial de su membrana. Otros fluorocromos: fluorocromos que se utilizan para estudiar la actividad de bombas de membrana, receptores celulares o actividad enzimtica. Se emplean sustancias fluorescentes que se acumulan en el interior celular o que cambian su capacidad fluorescente o espectro de emisin/excitacin por accin sobre ellas de un proteinas que las expulsan o introducen en las clulas o que ejercen sobre ellas una accin enzimtica. 3.- Marcadores fluorescentes sensibles al microambiente: Pueden ser empleados para estimar las propiedades del ambiente en que se encuentran, puesto que varan su espectro de absorcin o emisin en funcin de las caractersticas del microambiente que les rodea o de la concentracin que se alcanza. Se emplean para determinar diferentes estados funcionales: pH, calcio, potencial red-ox, actividad enzimtica, cintica de frmacos y funcin de P-gp 170.

7. CUALES SON LOS PAREMTRO MEDIDOS POR CMF?

Consecuentemente los parmetros medidos son: Eritrocitos (RBC), Leucocitos (WBC), Plaquetas (PLT) y Hemoglobina (Hgb) Los parmetros derivados de las mediciones de volumen: Volumen corpuscular medio (VCM), Ancho de distribucin eritrocitaria (ADE) y Volumen plaquetario medio (VPM) Los parmetros calculados son: Hematocrito (Hct), Hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentracin corpuscular media (CHCM

8. COMO SE HACE EL ANLISIS DE DATOS? La suspensin celular es preparada previamente con anticuerpos monoclonales conjugados con diferentes fluorocromos (FITC, PE, PerCP, PECy5, APC, etc.) y es introducida en el sistema hidrulico de manera que las clulas atraviesen individualmente la cmara de flujo, donde el haz del laser intercepta las clulas. El contacto del haz del lser con una clula produce dos tipos diferentes de dispersin: frontal y lateral (90). La dispersin frontal (Forward Scatter,A) nos da informacin acerca del tamao celular, mientras que la dispersin lateral (Side Scatter,B) nos informa de la complejidad celular. Los anticuerpos monoclonales adheridos a la superficie celular son a la vez excitados por la luz del lser y generan fluorescencias que son recogidas por fotomultiplicadores (hasta 4 fluorescencias actualmente) que transforman la seal ptica en electrica, envindose toda la informacin al sistema informtico para su anlisis.

Figura 1- De forma esquemtica, las clulas teidas entran en la cmara de flujo de una en una y, al pasar por delante de un haz de luz de lser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por apropiados filtros y espejos. Estas seales luminosas son recogidas por detectores y la informacin se integra y analiza adecuadamente por un sistema informtico.

OBJETIVOS.

 Adquirir conocimientos sobre la tcnica medicin de volumen y recuentos de partculas, CMF. Conocer las partes y el anlisis de datos de CMF. Conocer Las Aplicaciones De Citmetro De Flujo Entender el funcionamiento del la citometra de flujo

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA

DE FLUJO, CMF. LABORATORIO DE INMUNLOGIA.

PRESENTADO A: Dra. MARIA LOURDES LVAREZ G.

UNIVESITARIA DE SANTANDER. BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO. CCUTA. 2004 - A. APLICACIONES DE LA CITOMETRIA

DE FLUJO, CMF. LABORATORIO DE INMUNLOGIA.

PRESENTADO A: Dra. MARIA LOURDES LVAREZ G.

PRESENTADO POR: LEIDY YUDITH ANGARITA BAUTISTA CODIGO: 02171043. ANDREA PORTILLO GALVIZ CODIGO: 02171046

UNIVESITARIA DE SANTANDER. BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO. CCUTA. 2004 A.

BIBLIOGRAFA.

www.galenica.cl/productos_inmunologia.html http://www.opolanco.es/Apat/Boletin2/CITOFLUJO.htm http://www.udl.es/dept/medicina/dept/cmfhtml http://www.country.cnb.uam.es/ http://citometria.furebtip.org/cast/manual.htm

CONCLUCIONES.

 La tcnica de citometria de flujo es muy especfico y se obtienen resultados ms exactos.

El procedimiento de La citometria de flujo tiene aplicaciones en hematologa: gentica. farmacologa, inmunologa, oncologa, microbiologa y

La CMF se puede emplear para estudiar caractersticas estructurales y funcionales de clulas o partculas en suspensin.