Cuantificación de caseína por espectrofotometría UV-Vis

Paula Andrea Fernández Pinzón

Laura Sofia Forero Quintero
Heidy Valentina Fuentes Albino
Paula Camila Gutiérrez Ángel
Programa de Química Farmacéutica
Facultad de Ciencias
Universidad el Bosque, Bogotá, Colombia
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Resumen
En la presente práctica de laboratorio se tuvo como objetivo principal realizar una curva de calibración para la
cuantificación espectrometrica de la caseína, de igual manera, en relación a lo anterior se determinó la concentración de
esta proteína en una muestra problema (M4). Teniendo en cuenta lo anterior se realizó una cuantificación de la proteína
haciendo uso del reactivo de Biuret , el cual es necesario que esté en medio alcalino, por lo tanto se adiciona un buffer de
−3
pH 8. Se obtuvo una concentración experimental de 𝑥 = 2, 13 × 10 𝑔/𝑚𝐿, la cual se calculó por medio de la ecuación
de la recta obtenida de la curva de calibración, en relación a lo anterior se tuvo que realizar una espectroscopia para
conocer la absorción de la serie de tubos con volúmenes de patrón y buffer especificados en la tabla 1. Los resultados
cualitativos obtenidos permitieron identificar la poca sensibilidad del reactivo de biuret ante pequeñas concentraciones de
la proteína
Palabras claves: Cuantificación, proteína, caseína, calibración, biuret.
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Resultados

Tabla 1. Reporte de datos obtenidos en el laboratorio.

Tubo Patrón (mL) Buffer pH 8,0 (mL) Biuret (mL) Concentración de la proteína (g/mL) Absorbancia
1 0,0 1,0 2,0 0,0 0,000
2 1,0 0,0 2,0 3,33*10-3 0,573
3 0,8 0,2 2,0 2,67*10-3 0,433
4 0,6 0,4 2,0 2,00*10-3 0,331
5 0,4 0,6 2,0 1,33*10-3 0,278
6 0,2 0,8 2,0 6,67*10-4 0,114
Muestra 1,0 2,0 2,13*10-3 0,366

Imagen 1. Resultados cualitativos de las muestras Gráfico 1. Regresión lineal

1
Muestra de cálculos

Concentración Patrón = 1%=0,01 g/mL encontrar la recta de calibrado que es una expresión
Cálculo de la concentración del tubo 2 matemática que basicamente hace una interpolación de los
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2 datos, brindando así la variable que al despejar se obtiene
𝐶2 =
0,01 𝑔/𝑚𝐿 ×1 𝑚𝐿 −3
= 3, 33 × 10 𝑔/𝑚𝐿 la variable x que corresponde a la concentración de la
3𝑚𝐿
molécula a cuantificar (Cuello, 2019)
Cálculo de la concentración del tubo 3
Al relacionar el valor teórico y el valor experimental si se
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
0,01 𝑔/𝑚𝐿 ×0,8 𝑚𝐿 −3
observan diferencias esto se puede deber a un mal uso de
𝐶2 = 3𝑚𝐿
= 2, 66 × 10 𝑔/𝑚𝐿 las micropipetas, puesto que se pudo agregar cantidades
Cálculo de la concentración del tubo 4 menores o mayores a las que se buscaba, a pesar de que la
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2 micropipeta es un instrumento de medición con gran
𝐶2 =
0,01 𝑔/𝑚𝐿 ×0,6 𝑚𝐿 −3
= 2, 00 × 10 𝑔/𝑚𝐿 exactitud, se pueden generar errores personales a la hora
3𝑚𝐿 de pipetear o por defecto la contaminación del reactivo.
Cálculo de la concentración del tubo 5 En cuanto al reactivo del Biuret, este método consiste que
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2 en presencia de iones cúpricos del reactivo, se provoca la
0,01 𝑔/𝑚𝐿 ×0,4 𝑚𝐿 −3
𝐶2 = 3𝑚𝐿
= 1, 33 × 10 𝑔/𝑚𝐿 formación de un complejo, entre el ión Cu+2 y los grupos
Cálculo de la concentración del tubo 6 carboxi y amino terminales de los enlaces de péptidos; se
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2 necesitan por lo menos dos de cada uno de estos grupos,
0,01 𝑔/𝑚𝐿 ×0,2 𝑚𝐿 −4 por lo que la reacción no la darán aminoácidos y
𝐶2 = = 6, 66 × 10 𝑔/𝑚𝐿
3𝑚𝐿 dipéptidos, pero sí tripéptidos, polipéptidos y proteínas.
Cálculo de la concentración de la muestra problema (Nowotny, 1979)
por medio de la ecuación de la curva de calibración Teniendo en cuenta lo anterior, es posible afirmar que,
𝑦 = 160, 95𝑥 + 0, 0239 cuanto mayor es la cantidad de proteína presente, más
𝑦 = 0, 366 enlaces de péptidos hay disponibles para la reacción, por
0,366−0,0239
𝑥= 160,95
lo tanto la intensidad del color producido es proporcional
−3 a la concentración (número de enlaces de péptidos que
𝑥 = 2, 13 × 10 𝑔/𝑚𝐿
reaccionan) de la proteína.
Como se puede observar en la imagen 1 y en relación a la
2. Discusión
tabla 1 con respecto a las cantidades añadidas, el tubo 2,
Para dar inicio al análisis de resultados y de acuerdo con
es el que presenta una coloración más fuerte en relación a
los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio se
los otros, de igual manera, al realizar el cálculo
observa que en la concentración de caseína hay una
matemático, se confirma que es aquel en el que se presenta
tendencia de disminución en la cantidad que debía ser
una mayor concentración de la proteína. A su vez, el tubo
agregada a los respectivos tubos de ensayo, esto también
6, al cual se le agregó una mínima cantidad del patrón,
debido a la cantidad de solución buffer, como se evidencia
cambió ligeramente su color azul, casi imperceptible.
en la Tabla 1. a menor cantidad que se agregaba del buffer
Asimismo, esto permite exponer que la sensibilidad del
la reacción genera un color azul más intenso.
reactivo es baja con respecto a concentraciones pequeñas
La construcción de la curva patrón o curva de calibración
de proteínas.
permite conocer la concentración de la muestra gracias a
Para soportar lo anterior, se realizó una comparación con
que se generan varios puntos de referencia en este caso 5,
un trabajo de laboratorio ejecutado por Fuentes y
creando así un intervalo, a los cuales se les conoce la
colaboradores en 2012, en cual se realizó una
concentración y ya están estandarizados, estos van a
estandarización del método de Biuret para cuantificar
contener la molécula que se quiere cuantificar (Caseína),
proteínas totales en suero antibotrópico polivalente, en
se hace una relación de concentración y absorbancia (esta
este se afirma que el método de la prueba de Biuret posee
última brindada por el espectrofotómetro) que permite

2
un límite de detección de 1 mg/ml de proteína y un límite
de cuantificación de 3 mg/ml.
Para la elección del método “correcto” para la
cuantificación de proteínas este dependerá de varios
factores, unos dependen de la muestra a analizar y otros de
la infraestructura con que se cuente
La sensibilidad del método es muy importante cuando la
cantidad total de la muestra es limitada o bien cuando la
concentración de proteína en ella sea muy baja. (García,
Duhalt, 2016) La determinación de proteína por BCA es
un método altamente sensible. Este método combina la
reacción de las proteínas con Cu+2 en un medio alcalino
(produciendo Cu +) con un reactivo para la detección de
Cu + altamente selectivo y sensitivo denominado ácido
bicinconínico. Este ensayo muestra menos variación de
una proteína a otra. La variabilidad es similar a aquella
obtenida con el método de Lowry, pero puede ser reducida
efectuando el ensayo a 60°C por 30 minutos
(procedimiento mejorado), por lo cuál, si se va a hacer
uso de pequeñas concentraciones de proteína, este sería el
más adecuado.
Por otro lado, se considera que las principales causas de
error consistirán en la toma de muestras con la
micropipeta a la hora de preparar las soluciones con el
patrón y buffer utilizados siendo estos como la
contaminación de la muestra relacionado con pipetear
varias muestras con la misma punta, poseer burbujas en la
punta, disponer de la muestra muy rápido, aspirar la
muestra en un ángulo inadecuado (45°) o tener dicho
instrumento descalibrado (Mettler-Toledo, 2010). Sin
embargo, a través de la práctica de laboratorio, cada
analista tiene en cuenta esto para evitar dichos errores.
Para finalizar, se reconocen las aplicaciones de la
cuantificación de proteínas en la industria farmacéutica, ya
que intervienen en investigar una gran variedad de
procesos biológicos y a su vez mediante los lectores de
microplacas de absorbancia de cuantificación de proteínas
permitir el descubrimiento de fármacos, validación de
bioensayos, control de calidad y procesos de fabricación
en las industrias farmacéutica, biotecnológica, de
alimentos y bebidas y en el sector académico (Molecular
Devices, 2019)
3. Conclusiones.
Se realizó una curva de calibración para la cuantificación
espectrofotométrica de la caseína, la cual, permitió
conocer la concentración de la muestra gracias a que se
generan varios puntos de referencia (5) a los cuales se les
conoce la concentración y ya están estandarizados, por tal
motivo la concentración obtenida de la caseína es de
−3
𝑥 = 2, 13 × 10 𝑔/𝑚𝐿.
Se empleó en la práctica el reactivo de biuret, el cual es
empleado para indicar la presencia de péptidos en ua
molecular, por lo tanto, permite deducir que cuanto mayor
es la cantidad de proteína presente, más enlaces de
péptidos hay disponibles para la reacción, por lo tanto la
intensidad del color producido es proporcional a la
concentración de la proteína.
Por otro lado, es relevante mencionar los posible errores
ejecutados en la práctica, en primer lugar en la toma de
muestras y el uso de la micropipeta, de igual manera, a la
hora de preparar las soluciones con el patrón y buffer
utilizados siendo estos como la contaminación de la
muestra relacionado con pipetear varias muestras con la
misma punta, poseer burbujas en la punta, disponer de la
muestra muy rápido, entre otros factores.
Referencias bibliográficas
Cuello, A. (2019).Guia de laboratorios de bioquímica.
Corporación universitaria Rafael Núñez.
Nowotny, A., & Nowotny, A. (1979). Protein
determination by the Biuret method.
Fuentes F, Quispe I, García J. (2012) Estandarización del
método de Biuret para cuantificar proteínas totales en
suero antibotrópico polivalente producido en el centro
nacional de productos biológicos del INS. Bol – Inst Nac
Salud; 18 (11-12)
García, H., Duhalt, R. V. (2016). Cuantificación de
proteínas: una revisión. Instituto de biotecnología UNAM
Mettler-Toledo. (2010). Reducción de los errores de
pipeteo.
https://www.genesysanalitica.cl/pdf/informacion_tecnica/r
educcion-de-errores-pipeteo.pdf
Molecular Devices. (2019). Streamline absorbance assays
for nucleic acid & protein quantitation [EPUB].
https://es.moleculardevices.com/en/assets/ebook/br/stream
line-absorbance-assays-for-nucleic-acid-and-protein-quant
itation