PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

BIOQUÍMICA BÁSICA

LABORATORIO #2
CURVAS DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS

Santiago Robayo Tavera

Química Farmacéutica

Santiago Córdoba Morales

Química Farmacéutica

Sara Sofía Rodríguez Diaz

Microbiología Industrial

Juliana Coronado Ortiz

Química Farmacéutica

Fecha de elaboración: 19/08/2023

Fecha de entrega: 26/08/2023
1. RESUMEN

Este informe se centra en la importancia y el propósito de utilizar técnicas

espectrofotométricas para cuantificar proteínas, empleando curvas de calibración. La
espectrofotometría, basada en la interacción de la radiación electromagnética con la
materia, es crucial en la identificación (en este caso, con ayuda del Biuret) y medición de
compuestos. Las curvas de calibración permiten determinar concentraciones
desconocidas utilizando la relación lineal entre absorbancia y concentración. El
experimento permitió elaborar una de estas curvas comprobando que dicha relación es
directamente proporcional, además de determinar unas concentraciones de 3,00194
mg/mL y 4,09311 mg/mL para las muestras problema 1 y 2 respectivamente.

Palabras clave: espectrofotometría, absorbancia, concentraciones, proteínas, biuret.

2. OBJETIVOS

- Utilizar técnicas espectrofotométricas en la cuantificación de proteínas.

- Aprender a utilizar curvas de calibración para determinar la concentración de

muestras problema.

3. INTRODUCCIÓN

La espectrofotometría es un método de análisis óptico constantemente usado en las

investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar
la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
(Equipos y Laboratorio de Colombia S.A.S., s.f.)

El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber

radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV- visible. Las longitudes de
onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se
absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH,
temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que esta técnica figura como un
instrumento eficiente y práctico en la determinación y caracterización de biomoléculas.
(Abril et al., s.f.)

La ley de Lambert-Beer expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática

(de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución. (Abril et al., s.f)

l0
A = log (Ec. 1)
lt

A = Absorbancia.

𝑙0 = Luz incidente.

𝑙𝑡 = Luz transmitida. Figura 1. Imagen y partes del espectrofotómetro.

En esta práctica, se hizo uso del reactivo Biuret, el cual permite detectar la presencia de
proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en
sustancias de composición desconocida.

Este se compone de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con
tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta
en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena
corta. El hidróxido de potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio
alcalino necesario para que tenga lugar. (QUIMICA.ES, s.f.).
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.1. MATERIALES

4.1.1. Instrumentación

Figura 2. Funcionamiento del reactivo de Biuret cuando interacciona con una proteína.

- Gradilla.
- Pipeteador de cremallera.
- Vaso de precipitados de 100 mL.
- Vasos de precipitados de 50 mL.
- Tubos de ensayo.
- Celdas para espectrofotómetro.
- Pipetas graduadas de 5 mL.
- Papel filtro.
- Micropipeta 100 a 1000 µL.
- Pipeta Pasteur de plástico.

4.1.2. Reactivos

- Reactivo de Biuret.
- Agua destilada.
- Muestras problema.
- HCl a 0.1M.
- Patrón de proteínas.

4.1.3. Dispositivos

- Incubadora.
- Centrífuga.
 - Espectrofotómetro.

4.2. PROCEDIMIENTO

4.2.1. Elaboración de la curva de calibración

Se prepararon 2,500 mL de cada uno de los siguientes patrones de proteína: 0,5; 1; 2; 4 y 5

mg/mL de una solución de 10 mg/mal. Además, de un tubo blanco de 2,500 mL de agua
destilada + 2,500 mL de reactivo de Biuret con el que se llevó a cabo la calibración del
espectrofotómetro.

Tubo P. de proteínas Muestra problema Agua Biuret Volumen final

0,5 mg/mL 2,500 mL 0,125 mL 2,375 mL 2,500 mL 5,000 mL
1 mg/mL 2,500 mL 0,250 mL 2,250 mL 2,500 mL 5,000 mL
2 mg/mL 2,500 mL 0,500 mL 2,000 mL 2,500 mL 5,000 mL
4 mg/mL 2,500 mL 1,000 mL 1,500 mL 2,500 mL 5,000 mL
5 mg/mL 2,500 mL 1,000 mL 1,250 mL 2,500 mL 5,000 mL
MP1 X 1,500 mL 1,000 mL 2,500 mL 5,000 mL
MP2 Y 1,500 mL 1,000 mL 2,500 mL 5,000 mL

Tabla 1. Datos con los que se construyeron los patrones y las disoluciones.

Figura 3. Muestras patrón de la proteína de 0,5 mg/mL, 1mg/mL, 2 mg/mL, 4 mg/mL y 5 mg/mL.
Se mezclaron adecuadamente los tubos y se incubaron a una temperatura de 60,8 °C
durante 7 minutos. Mientras tanto, se encendió el espectrofotómetro, se estabilizó y se
ajustó la longitud de onda a 540 nm.

Figura 4. Imágenes de la incubadora y los filtros ubicados en la misma a 60,8 °C.

Se utilizó el blanco para calibrar el dispositivo a un valor de 0 en la absorbancia para

proceder finalmente, con la lectora de los patrones y muestras desconocidas.

Figura 5. Procedimiento de preparación de los patrones y muestras para el espectrofotómetro.

El procedimiento mencionado anteriormente se encuentra condensado en el siguiente
diagrama de flujo (Figura 6).

Figura 6. Diagrama de flujo de elaboración de curvas de calibración.

 5. RESULTADOS
Se exponen aquí las tablas correspondientes a los patrones de proteína y a las muestras
problema, además de los valores hallados para las últimas y la función que lo permitió.

C (mg/mL) Absorbancia 3,001941845 MP1

0 0 4,09311977 MP2
0,5 0,044
1 0,107
2 0,233
4 0,466
5 0,581
MP1 0,346
MP2 0,476

Tabla 1. Datos para los patrones de proteína y muestras problema (absorbancia y concentración).

Las concentraciones de MP1 y MP2 fueron calculadas utilizando la función de tendencia en

Excel, tomando los valores de las columnas de concentración y absorbancia para los patrones
de las proteínas.

Esta función es utilizada para calcular la línea de tendencia lineal, permitiendo pronosticar
los valores de Y basados en valores de matriz X, usando el método de mínimos cuadrados
con dos series de datos proporcionadas. Los resultados numéricos reflejan una tendencia
lineal coherente con los puntos de datos conocidos. De manera que, se eligió esta función ya
que es capaz de realizar predicciones a partir de una base de datos anteriores y un ajuste
determinado.

A continuación, se presenta la gráfica de absorbancia en función de la concentración de los

primeros 5 tubos con su respectiva ecuación de la recta y el coeficiente de correlación R2
 Gráfica 1. Representación de la absorbancia en función de la concentración (mg/mL).

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

A partir de los resultados obtenidos en la curva de calibración, se puede decir que estos
cumplieron los objetivos esperados, ya que a la hora de graficarlos representaron una
tendencia lineal, mostrando que las absorbancias aumentaban progresivamente con la
concentración, por lo que se identifica una relación directamente proporcional entre
ambas variables. Esto fue favorecido al trabajar con bajas concentraciones, entrando en
la zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer. Mientras que, si estas
concentraciones hubiesen sido más altas, se perdería la linealidad de la curva y las
medidas no serían tan confiables.

Es importante mencionar que los datos registrados y el ajuste de la curva hecho por el
programa Excel para determinar la ecuación de la recta cuentan con un alto grado de
ajuste, donde el R2 se acercó significativamente a 1. Esto da cuenta de que las previsiones
hechas sobre las concentraciones X y Y (de las proteínas) tienen una fiabilidad
considerable, puesto que ese ajuste determina la función de tendencia y el cálculo de
valores desconocidos. Sin contar que las concentraciones encontradas estuvieron dentro
de la línea de tendencia y absorbancia que ya se había hallado con las muestras patrón
construidas a partir de albumina.
A raíz de lo anterior, también se puede deducir una buena construcción de los patrones
de las proteínas, lo cual se evidenció no sólo en la gráfica sino en el color emitido por
cada tubo de ensayo, que correspondía a la concentración indicada. Para ello, fue
fundamental realizar las disoluciones con micropipetas de 100 a 1000 µL, permitiendo
mayor precisión a la hora de agregar alícuotas (con una incertidumbre de ± 5µL).

Y finalmente, se podría sugerir que, para próximas prácticas de espectrofotometría

relacionadas con absorbancia y concentración, se haga al menos una repetición del
experimento para tener un mayor índice de valores para comparar y evaluar.

7. CONCLUSIONES

- Los resultados obtenidos denotaron la relación directamente proporcional entre la

absorbancia y la concentración, respondiendo a un ajuste lineal y, por lo tanto, a la
ley de Lambert-Beer.

- La correcta de medición de la absorbancia está fuertemente relacionada con la

precisión utilizada en la construcción de las disoluciones con concentraciones
específicas y los instrumentos empleados para ese proceso (aquellos con menor
incertidumbre).

- Es viable determinar valores desconocidos (en este caso, concentraciones de las

MP1 y MP2) usando la función de tendencia de Excel basándose en el método de
mínimos cuadrados y un ajuste lineal.

8. BIBLIOGRAFÍA

a. TREND function - Microsoft Support. (2021). Microsoft.com.

https://support.microsoft.com/en-us/office/trend-function-e2f135f0-8827-4096-
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b. Ashish Kumar Srivastav. (2018, September 30). TREND Function in Excel.
WallStreetMojo. https://www.wallstreetmojo.com/trend-function-in-excel/

c. Abril Díaz, N., Antonio Bárcena Ruiz, J., Fernández, E., Cejudo, A., Novo, J.,
Peinado, J., Toribio Meléndez-Valdés, F., & Fiñana, I. (n.d.). 8. Espectrofometría:
Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas.
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf

d. Artedinamico. (2022). ESPECTROFOTOMETRIA. Equipos Y Laboratorio de

Colombia. https://www.equiposylaboratorio.com/portal/inicio