LABORATORIO N° 6: CUANTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS POSTERIOR A HIDRÓLISIS CON ENZIMAS PROTEOLÍTICAS

LABORATORIO N° 5: CUANTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

POSTERIOR A HIDRÓLISIS CON ENZIMAS PROTEOLÍTICAS

APRENDIZAJES ESPERADO:

- Aplicar métodos espectrofotométricos en el análisis de concentración de proteínas de

una muestra biológica.

- Analizar características estructurales y funcionales de las enzimas por medio de datos

experimentales.

INTRODUCCIÓN CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Las proteínas son macromoléculas presentes en prácticamente todas las estructuras celulares y participan
de casi todas las funciones celulares. Dentro del grupo de proteínas se encuentran enzimas,
transportadores, anticuerpos, receptores, proteínas estructurales como microtúbulos y microfilamentos
del citoesqueleto, etc. Adicionalmente, participan en la regulación del equilibrio osmótico y tienen
capacidad reguladora del pH.

Existen variados métodos para reconocer y cuantificar proteínas, una de las cuales es la
espectrofotometría. Este método permite la determinación cuantitativa de una sustancia (no es exclusiva
de las proteínas), y se basa en la capacidad de estas sustancias para absorber selectivamente ciertas
longitudes de onda de una luz incidente. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al
espesor del medio y a la concentración de la sustancia presente, lo cual está contenido en la Ley de
Lambert – Beer:

𝑰𝟎
𝑨 = 𝑳𝒐𝒈 = e×𝒄×𝒍
𝑰

Donde I0 e I corresponden respectivamente a la Intensidad de luz incidente y la intensidad de luz

transmitida a través de la muestra; A corresponde a la Absorbancia, un indicador de la luz que es absorbida
por la muestra en solución (a veces también se denomina Densidad óptica, DO); ε es el coeficiente de
extinción molar (un valor constante para cada compuesto expresado en [litros/M cm] y que es
numéricamente igual a la DO de una solución de concentración 1M), c es la concentración molar (moles/L)
y l es el espesor de la cubeta, de ser de tamaño estándar el valor será constante e igual a 1 cm.

De esta manera, si se mantiene constante el espesor del medio, la absorción de luz por una sustancia
disuelta en un medio acuoso será proporcional a su concentración molar.

Si las muestras analizadas siguen la Ley de Lambert-Beer, existirá una relación lineal entre la Absorbancia
y concentración para una misma longitud de onda dentro de un margen de concentración (debido a que
el cálculo de A considera el uso de logaritmo).
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Dentro de este margen, se puede usar una serie de soluciones patrón o estándar (soluciones de
concentración conocida de la sustancia a analizar) para determinar la concentración de otras soluciones
de concentración desconocida.

Para determinar el rango lineal de cumplimiento de la Ley de Lambert Beer se utilizan las curvas de
calibración con las muestras patrón de la molécula a estudiar. Adicionalmente, se requiere el uso de una
solución blanco (solución que contiene todos los componentes del ensayo con excepción de la sustancia
a medir, por lo que corresponde a una concentración “cero” de la sustancia).

Intensidad de Intensidad de
luz incidente luz transmitida
(I0) (I)

Fuente Monocromador Detector

de luz
Cubeta con
muestra
absorbente

Figura 6.1. Esquema simplificado del funcionamiento de un espectrofotómetro.

En este laboratorio, usted será capaz de realizar una cuantificación de proteínas remanentes de la
actividad de enzimas proteasas a partir de muestras de problemas de proteína, utilizando la técnica de
espectrofotometría. Para cuantificar las proteínas se utilizará el método de Biuret, que se basa en la
formación de un complejo coloreado entre el ión Cu+2 presente en el reactivo y los nitrógenos amídicos
del enlace peptídico, por lo que este reactivo reconoce específicamente la presencia de dichos enlaces. Se
utiliza como blanco el reactivo de Biuret mezclado con agua destilada en lugar de la muestra o del
estándar.

INTRODUCCIÓN ENZIMOLOGÍA

Las enzimas son biocatalizadores esenciales para realizar los procesos metabólicos necesarios para la
célula a velocidades compatibles con la vida. Las enzimas actúan disminuyendo la energía de activación,
permitiendo aumentar la velocidad de reacción sin afectar directamente sus estados de equilibrio o sus
propiedades termodinámicas. La función de las enzimas puede verse afectada por diversos factores:

A. Las concentraciones de enzima y sustrato: Cuando aumenta la concentración de sustrato, la velocidad

de la reacción aumenta hasta un punto donde la enzima ya no es capaz de transformarlo en producto,
produciendo la saturación de la reacción. Cuando aumenta la actividad de la enzima, la velocidad de
reacción también aumenta hasta que todos los sitios activos de la enzima se encuentran ocupados con
sustrato. En esta condición se puede determinar la velocidad máxima de la reacción.
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B. Las condiciones de pH: el cambio en la concentración de protones altera las interacciones presentes en
el sitio activo (debido a la presencia de grupos ionizables tanto en el sustrato como en la enzima), lo
cual reduce la capacidad catalítica; En el caso del pH y de la temperatura, se pueden establecer
condiciones “óptimas” para el funcionamiento de la enzima, debido al cambio estructural que supone
para la enzima la alteración de estas variables en la solución.

C. La temperatura: si bien un aumento se asocia a una mayor velocidad de reacción debido a la mayor
probabilidad de que enzima y sustrato colisionen, en el caso de las enzimas una elevación por sobre
cierto valor suele asociarse a un cambio estructural debido a la pérdida de interacciones débiles.

D. La presencia y concentración de inhibidores, moduladores, cofactores y/o coenzimas.

El tiempo que tarda una determinada cantidad de sustrato en transformarse en producto es lo que
caracteriza a la enzima, y se denomina actividad enzimática medida como velocidad de reacción (v), que
se puede definir como la cantidad de sustrato transformado o de producto formado, en una unidad de
tiempo.

En este laboratorio, para la cuantificación de proteínas deberá construir una curva de calibración (curva
patrón) con las concentraciones de patrones de proteínas y las absorbancias obtenidas utilizando la técnica
de espectrofotometría (Figura 6.2). Para luego determinar la concentración de proteínas remanentes en
tubos sometidos a digestión enzimática por una mezcla de proteasas.

y = 0,587x + 0,0058
Absorbancia a 540 nm

R2 = 0,99

Concentración de Seroalbúmina bovina (mg/mL)

Figura 6.2. Curva de calibración de Seroalbúmina bovina con el método colorimétrico de Biuret. La línea
roja representa la interpolación de la absorbancia de la proteína problema.
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Al utilizar la ecuación de la recta de la curva de calibración podremos determinar la concentración de la

proteína problema a partir de su absorbancia, por ejemplo, si consideramos la Figura 3.2, el valor de la
absorbancia de la proteína problema es 0,321 u.a. y la ecuación de la recta es y = 0,0587x + 0,0058.

Podemos reemplazar y despejar de ecuación siguiente manera: y = 0,0587x + 0,0058

A = 0,0587 C + 0,0058
0,321 = 0,0587 C + 0,0058

0,321 – 0,0058 = C
0,0587
C = 5,37 mg/mL

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales
14 Tubos de ensayo y 2 Gradillas
Pipetas 1 y 5 mL y Micropipetas de 1000 µL
Baño termorregulado
Espectrofotómetro con luz visible
Cubetas de plástico
Soluciones
Solución de proteasas 1% p/v (ablandador de carne)
Soluciones Buffer Citrato pH 4,0
Soluciones Buffer Fosfato pH 7,0
Solución Buffer Amonio pH 9,0
Reactivo de Biuret
Solución de Seroalbúmina Bovina (BSA): 10 mg/mL

PROCEDIMIENTO

• Enumere una serie de tubos de 1 a 14 y prepare las solucionesde acuerdo con la tabla adjunta.

Agua Solución Buffer Buffer Buffer

Tubo
destilada Seroalbúmina bovina pH 4 pH 7 pH 9
Tubo 1
1 mL -- -- -- --
(Blanco)
Tubo 2
0,9 mL 0,1 mL -- -- --
(Patrón 1)
Tubo 3
0,8 mL 0,2 mL -- -- --
(Patrón 2)
Tubo 4
0,6 mL 0,4 mL -- -- --
(Patrón 3)
Tubo 5
0,4 mL 0,6 mL -- -- --
(Patrón 4)
Tubo 6
0,25 mL 0,75 mL -- -- --
(Patrón 5)
Tubo 7
0,2 mL 0,8 mL -- -- --
(Patrón 6)
Tubo 8
-- 1 mL -- -- --
(Patrón 7)
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Tubo 9
-- -- 2 mL -- --
(Blanco Tubo 10)
Tubo 10
-- 1 mL 1 mL -- --
(Experimental)
Tubo 11
-- -- -- 2 mL --
(Blanco Tubo 11)
Tubo 12
-- 1 mL -- 1 mL --
(Experimental)
Tubo 13
-- -- -- -- 2 mL
(Blanco Tubo 14)
Tubo 14
-- 1 mL -- -- 1 mL
(Experimental)

• Los tubos del 10, 12 y 14 deben mezclarse con 1 mL de solución enzimática de proteasas e incubar por
5 minutos en baño termorregulador a 37°C, luego llevar inmediatamente a baño a 100°C y mantener a
esa temperatura por 5 minutos.
• Adicionar a TODOS los tubos (del 1 al 14) 2 mL de reactivo de Biuret e incubarlos por 10 minutos a 37°C
en el baño termorregulado.
• Una vez pasado el tiempo, coloque la solución blanco en la cubetas del espectrofotómetro y ajuste el
valor de absorbancia 0 a 540 nm.
• Realice la medición de absorbancia para cada tubo.

RESULTADOS

• Registrar resultados en la siguiente tabla y calcular la concentración de patrones de proteína de los

patrones y la velocidad de reacción (glucosa liberada en tiempo de reacción).
Concentración de
Tubo Absorbancia
proteína (mg/mL)
Tubo 1 -- 0,000
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
Tubo 8

• Realizar curva de calibración con gráfico de dispersión, incluir línea de tendencia, ecuación de la recta
y valor de R2.

• Registrar resultados en la siguiente tabla y calcular la concentración proteína remanente de cada tubo
utilizando la ecuación de la recta de la curva de calibración. Luego restar la cocentración inicial de
proteína (10 mg/mL) con la concentración de proteína remamnente para obtener la concentración
de proteína transformada. Con este valor determinar la velocidad de reacción (concentración de
proteína transformada/ tiempo de reacción).
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Velocidad de
Concentración de Concentración de
reacción
Tubo Absorbancia proteína remanente proteína transformada
(mg/mL de Proteína
(mg/mL) (mg/mL)
transformada/min)
Tubo 9 0,000 -- --
Tubo 10
Tubo 11 0,000 -- --
Tubo 12
Tubo 13 0,000 -- --
Tubo 14

• Realizar gráfica de la actividad enzimática en función del pH.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué utilidades presenta conocer la ecuación de la recta de la curva de calibración?

2. ¿Por qué se utilizan buffer a diferentes pHs en vez de utilizar un medio alto en compuestos solo ácidos,
solo básicos o ausentes de estos? Explique en relación con la actividad realizada.
3. ¿Cómo se podría determinar?¿Cuál es la temperatura óptima de las proteasas digestivas humanas?
4. ¿Por qué los tubos deben someterse a 100 ºC una vez transcurrido el tiempo de reacción?

PREGUNTA DE APLICACIÓN

o ¿Qué diferencias existe entre la especificidad y el efecto del pH del medio de proteínas por
pepsina, tripsina y quimiotripsina? ¿Cómo el cambio de pH podría afectar la disponibilidad de
aminoácidos de la dieta?