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Universidad Santo Tomas – Sede La Serena

Departamento de Ciencias Básicas


Bioquímica - BIO-005 – I -2019

Laboratorio Nº 3
Cuantificación de la concentración de proteínas por espectrofotometría
Método de Biuret
APRENDIZAJES ESPERADOS:

- Construir una recta de calibrado que correlacione la concentración de proteína patrón v/s absorbancia.
- Determinar la concentración de proteínas presentes en distintas muestras problemas entregadas en el laboratorio.

INTRODUCCIÓN
Las proteínas son macromoléculas presentes en prácticamente todas las estructuras celulares y participan de casi todas las funciones
celulares. Dentro del grupo de proteínas se encuentran enzimas, transportadores, anticuerpos, receptores, proteínas estructurales
como microtúbulos y microfilamentos del citoesqueleto, etc. Adicionalmente, participan en la regulación del equilibrio osmótico y tienen
capacidad reguladora del pH.
Existen variados métodos para reconocer y cuantificar proteínas, una de las cuales es la espectrofotometría. Este método permite la
determinación cuantitativa de una sustancia (no es exclusiva de las proteínas), y se basa en la capacidad de estas sustancias para
absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de una luz incidente. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al
espesor del medio y a la concentración de la sustancia presente, lo cual está contenido en la ley de Lambert – Beer:
Log (I0 / I) = ε c l = A
Donde I0 e I corresponden respectivamente a la Intensidad de luz antes (incidente) y después (transmitida) de pasar a través de la
muestra; A corresponde a la Absorbancia, un indicador de la luz que es absorbida por la muestra en solución (a veces también se
denomina Densidad Óptica, DO). ε es el coeficiente de extinción molar (un valor constante para cada compuesto expresado en
[litros/M cm] y que es numéricamente igual a la DO de una solución de concentración 1M), c es la concentración molar (moles/L) y l es
el espesor de la cubeta, siendo éste último un valor constante igual a 1 cm. De esta manera, si se mantiene constante el espesor del
medio, la absorción de luz por una sustancia disuelta en un medio acuoso será proporcional a su concentración molar.Si las muestras
analizadas siguen la ley de Lambert-Beer, existirá una relación lineal entre la Absorbancia y concentración para una misma longitud
de onda dentro de un margen de concentración (debido a que el cálculo de A considera el uso de logaritmo). Dentro de este margen,
se puede usar una serie de soluciones patrón o estándar (soluciones de concentración conocida de la sustancia a analizar) para
determinar la concentración de otras soluciones de concentración desconocida. Adicionalmente, se requiere el uso de una solución
blanco (solución que contiene todos los componentes del ensayo con excepción de la sustancia a medir, por lo que corresponde a
una concentración “cero” de la sustancia).
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En este laboratorio, usted será capaz de realizar una cuantificación de proteínas a partir de muestras desconocidas utilizando la
técnica de espectrofotometría. Para cuantificar las proteínas se utilizará el método de Biuret, que se basa en la formación de un
complejo coloreado entre el ión Cu+2 presente en el reactivo y los nitrógenos amídicos del enlace peptídico, por lo que este reactivo
reconoce específicamente la presencia de dichos enlaces. Se utiliza como blanco el reactivo de Biuret mezclado con agua destilada
en lugar de la muestra o del estándar.

Figura 2: Esquema estructura básica de un aminoácido (izquierda) y enlace peptídico (derecha)

PARTE EXPERIMENTAL
Materiales Soluciones
9 Tubos de ensayo Reactivo de Biuret
1 Gradilla Soluciones estándar de Seroalbúmina Bovina
Pipetas de 1, 5 y 10 mL (BSA): 1, 3, 5, 8 y 10 mg/mL
Termómetro Muestras problemas
Baño termorregulado
Espectrofotómetro de longitud de onda visible A
Cubetas o celdas espectrofotométricas B
C

PROCEDIMIENTOY RESULTADOS

 Enumere una serie de tubos del 1 a 9


 Tome 1 mL de cada solución y agréguela en un tubo limpio y seco.
 Agregue 2 mL del reactivo de Biuret a cada tubo e incúbelos por 10 minutos a 37°C en el baño termorregulado.
 Una vez pasado el tiempo, coloque la solución blanco en la cubetas del espectrofotómetro y ajuste el valor de absorbancia 0 a 540
nm. Realice la medición de los tubos patrón y muestra y anote el valor de Absorbancia de cada solución en la tabla anterior.
 Realice la gráfica de curva de calibrado con los valores de Absorbancia (eje y) y Concentración (eje x) de los patrones (Tubos 2 a
5).
 Calcule las concentraciones de proteína de las muestras problemas con la ecuación de la recta de la curva de calibrado.
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Soluciones Patrón
Agua Sol. Reactivo Resultado
Tubo
destilada 1 mg/mL 3 mg/mL 5 mg/mL 10 mg/mL Muestra Biuret Absorbancia

Tubo 1
1 mL -- -- -- -- -- 2 mL 0,000
(Blanco)
Tubo 2
-- 1 mL -- -- -- -- 2 mL
(Patrón 1)
Tubo 3
-- -- 1 mL -- -- -- 2 mL
(Patrón 2)
Tubo 4
-- -- -- 1 mL -- -- 2 mL
(Patrón 3)
Tubo 5
-- -- -- -- 1 mL -- 2 mL
(Patrón 4)
Tubo 6
-- -- -- -- -- 1 mL 2 mL
(MP1)
Tubo 7
-- -- -- -- 1 mL 2 mL
(MP2)
Tubo 8
-- -- -- -- 1 mL 2 mL
(MP3)

CUESTIONARIO

1. Indique 2 técnicas colorimétricas adicionales para cuantificar proteínas, y compárelas con el método usado en este trabajo
(indicando para ello 1 ventaja y 1 desventaja del método de Biuret en comparación a los métodos propuestos.

2. De acuerdo a la Ley de Lambert-Beer existe un valor de absorbancia que limita la detección por espectrofotometría debido a la
fórmula que lo gobierna. ¿Cuál es ese límite? Si su muestra cae en esta condición, ¿cómo podría resolverlo?