Grado de Biotecnología Profa.

Pilar Arias Crespo

Bioquímica I

GRADO DE BIOTECNOLOGÍA
BIOQUÍMICA I

PRÁCTICA 2
CURSO ACADÉMICO 2021-2022

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Grado de Biotecnología Profa. Pilar Arias Crespo
Bioquímica I

PRÁCTICA 2.- DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS POR

EL MÉTODO DE LOWRY

1. FUNDAMENTO TEÓRICO.
El método de Lowry es una técnica colorimétrica que permite calcular la concentración de
proteínas totales presentes en una disolución o extracto biológico. El método se basa en el
empleo de dos reactivos. El componente fundamental del Reactivo A es el CuSO4, que
aporta iones Cu2+. En medio alcalino, estos iones reaccionan con aquellas moléculas que
tengan varios enlaces peptídicos consecutivos, es decir, péptidos y proteínas, dando lugar
a complejos solubles que presentan un color azul pálido. El Reactivo B, también conocido
como reactivo de Folin-Ciocalteau o reactivo de fenoles, reacciona con aquellos
aminoácidos de la proteína que lleven en su cadena lateral grupos fenólicos (la tirosina, la
fenilalanina y el triptófano), dando lugar a un color azul intenso.
La intensidad del color producido en el tubo de ensayo, que se mide con un
espectrofotómetro (figura 1), es directamente proporcional a la cantidad de proteína
presente en la disolución, lo que permite cuantificar ésta si se compara con tubos
preparados de forma similar con cantidades conocidas de una proteína de referencia, con
los que se hace una recta de calibrado. Siempre que se mide una coloración debe restarse
el color debido a las disoluciones que se están utilizando e independiente de la muestra
proteica objeto de la lectura. Con este objetivo se utiliza un tubo blanco (sin muestra) que
sirve para poner a cero el espectrofotómetro/colorímetro.

Figura 1.- Esquema de un Espectrofotómetro UV-Vis y Cubetas. Observar que tienen una parte lisa que es la
que se debe colocar paralela al eje de luz del espectrofotómetro y que no se debe tocar para no interferir
en la medida.

2. OBJETIVO
En esta práctica procedemos a determinar la concentración de proteína del extracto
diluido de hígado de ternera, el posterior cálculo de la concentración en el extracto crudo
inicial y determinar el rendimiento de la extracción en forma de mg proteína / g de tejido.

3.- MATERIALES Y REACTIVOS

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Bioquímica I

• Tubos de ensayo y gradilla.

• Probeta de 50 mL.
• Espectrofotómetro y cubetas de plástico.
• Pipetas de vidrio, automáticas y Pasteur
• Disolución proteína problema (M): diluimos la alícuota de 50 μL de extracto de
hígado 1:20 con agua.
• Disolución patrón: disolución en agua de la proteína seroalbúmina bovina (BSA) a
una concentración de 1 mg/mL.
• Reactivo A de Lowry se prepara en el momento a partir de las disoluciones a, b y c,
previamente preparadas: En un vaso de precipitados se añaden 0,5 mL de b
(medidos con una micropipeta P1000- punta azul) + 0,5 mL de c (medidos con una
micropipeta P1000- punta azul) + 49 mL de a (medidos con una probeta de 50 mL).
Lo agitamos para que se mezcle bien. (Disolución a: carbonato sódico al 3% (P/V) en
NaOH 0,1 N, Disolución b: sulfato de cobre penta hidratado al 2% (P/V) y Disolución
c: tartrato sódico al 4% (P/V))
• Preparar el Reactivo B de Lowry justo antes de su uso diluyendo al 50% en agua del
reactivo de Folin-Ciocalteau. Lo agitamos para que se mezcle bien.

4.-PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Rotulamos 6 tubos de vidrio con B, 1, 2, 3, 4 y M1 y M2 disponiéndolos en una
gradilla.
2. Añadimos primero la disolución patrón BSA a los tubos 1, 2, 3, 4 con las
micropipetas correspondientes, como se indica en la tabla 1 (tubos 1 a 4). A
continuación añadimos a cada tubo M1 y M2 las cantidades de Muestra que se
indican (ver tabla 1). En el tubo B no añadimos muestra.
3. Añadimos agua a cada tubo, hasta completar el volumen de todos los tubos a un
volumen final de 1 mL.
4. Le añadimos 5 mL del Reactivo A de Lowry a cada uno de los 6 tubos.
5. Agitamos y dejamos incubar 10 min. a temperatura ambiente.
6. Mientras incuba se preparan 8 mL del Reactivo B de Lowry.
7. Transcurridos los 10 min. añadimos a cada tubo 0,5 mL y agitamos.
8. Incubamos al menos 5 min. a temperatura ambiente.
9. Colocamos el contenido de cada tubo en una cubeta de espectrofotómetro
previamente marcada para su identificación.
10. Vamos al espectrofotómetro y medimos la absorbancia a 620nm ajustándolo
previamente a 0 con el blanco (tubo B), colocamos las cubetas en el aparato de
manera que el haz de luz atraviese la parte lisa a la que nunca tocaremos con los
dedos (si lo hacemos por despiste la limpiamos con papel). Cerramos la puerta y
observamos la medida que corresponde a cada tubo.

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11. Anotamos los valores de la absorbancia en unidades de densidad óptica (DO) en los
cuadros de la tabla que correspondan al orden seguido en la medición.

Tubo Muestra (mL) µg de proteína Absorbancia (DO)

Blanco (B) --
Patrón 1 0,1 (BSA)
Patrón 2 0,2 (BSA)
Patrón 3 0,3 (BSA)
Patrón 4 0,4 (BSA)
Problema (M1) 0,1 (Extracto)
Problema (M2) 0,2 (Extracto)
Tabla 1.- Orden de los tubos para la determinación de la cantidad de proteína por el método de Lowry.

5.-RESULTADOS
1. Representar gráficamente realizando una recta de calibrado, los resultados
correspondientes a los tubos 1, 2, 3 y 4. En el eje X se representan los mg de
proteína que hay en cada tubo, y en el eje Y los valores de absorbancia obtenidos
para cada uno.
2. Para calcular la cantidad de proteína presente en los tubos problema se hallará
primero la media aritmética de la absorbancia obtenidas con los tubos M1 y M2,
teniendo en cuenta las diferencias de volumen de muestra en ambos tubos, es
decir:

3. El valor de “absorbancia M media” se llevará a la recta patrón de calibrado y por

extrapolación se obtienen los µg de proteína que hay en 0,1 mL de muestra
problema. A partir de ese dato, teniendo en cuenta la dilución efectuada en la
muestra problema, hay que calcular:
• mg de proteína / mL de extracto crudo.
• mg de proteína / g de tejido (para hacer este cálculo hay que tener en
cuenta el proceso de extracción realizado en la práctica 1).