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LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL

Espectrofotómetro UV-VIS virtual


Nombres:
1. Felipe Antonio Jaramillo 1107097966
2. Angie López Gil 1113669052
3. María Alejandra Rentería 1107512361
4. Luis López Rosero 1130589851
5. Claudia Lorena Villegas 1144076609
Actividad 1
Diseño del experimento: Utilizando el para-nitrofenol (pNF) y agua, prepara 3
muestras en sendas cubetas, que contengan distintos volúmenes de pNF y
siempre un volumen total de 3 mℓ.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que
hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en
cada cubeta:

Una vez preparadas las 3 mezclas en las 3 cubetas, introdúcelas de una en


una al espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.

Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las


cubetas y el valor de absorbancia. Comparando las 3 medidas, ¿observas
alguna dependencia entre el valor de absorbancia y la mayor o menor
concentración de pNF en la cubeta?
Respuesta:
A medida que aumenta el color de la cubeta, aumenta la concentración y esta
se define por que aumenta la absorbancia, donde la absorbancia es
directamente proporcional a la concentración .
Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de pNF en la
mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de
80 µM pNF. Prepara una tabla con los datos y traza una gráfica representando
A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?
Fórmula para hallar concentración
(80 µM)(1 ml)
Concentración 1= =26.6
3 ml
(80 µM)(2 ml)
Concentración 2= =53.3
3 ml
(80 µM )(3 ml)
Concentración 3 =¿ 80
3 ml

90
80
70
60
A bsorbancia

50
40
30
20
10
0
0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Concentraciòn mg/ℓ Linear (Concentraciòn mg/ℓ )
Linear (Concentraciòn mg/ℓ )

ACTIVIDAD 2
Fundamento de un ensayo de cuantificación de proteínas
El que se conoce como método de Bradford es un ensayo habitual para medir
la concentración de proteínas en una muestra. Se basa en que la unión del
colorante azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G250) a las proteínas
modifica el espectro visible de aquél.
Diseño del experimento: Prepara una cubeta sólo con reactivo de Bradford y
otras dos cubetas (o más) con cantidades diferentes de la disolución de
proteína. Añade a todas las cubetas la cantidad de reactivo necesaria para un
volumen total de 3 mℓ en cada una.

Calibración: Introduce la primera cubeta (que sólo contiene el reactivo de


Bradford) en el espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsa
el botón “A=0”. Esta muestra se denomina el "tubo blanco" o "blanco de
reactivos" y sirve para que el color propio del reactivo no se considere en la
determinación de proteínas.
Medida: A continuación, introduce el resto de cubetas, de una en una, en el
espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.

Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las


cubetas y el valor de absorbancia. Comparando entre sí las medidas,
¿observas alguna dependencia entre la absorbancia y la mayor o menor
concentración de proteínas en la cubeta?
Respuesta:
La dependencia se da por la relación dada por la ley de Beer-Lambert donde
se relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad
saliente después de que en dicho medio se produzca absorción.
Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de proteínas en
la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es
de 800 mg/ℓ. Prepara una tabla con los datos y traza una gráfica representando
A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?

Concentraci ò n 1=0
ml∗800 mg
1
L
Concentraci ò n 2 : =266,7 mg/ L
3 ml
ml∗800 mg
2
L
Concentraci ò n 3 : =533,3 mg/ L
3 ml

En la gráfica se observa un comportamiento lineal, donde la absorbancia es


directamente proporcional a la concentración.
El R cuadrado de “1” nos indica que hay relación lineal entre los tres valores
reportados
Para la determinación de una muestra problema que se encuentra dentro de
los parámetros de la curva de calibración se puede usar la expresión derivada
de la ecuación de recta:

Y + 0,0003
X=
0,0007
Donde “X” corresponde a un valor de concentración en mg/L y “Y” a la
absorbancia respuesta de la medida de una muestra problema.

0.4
f(x) = 0.18 x − 0.18
0.35 R² = 1

0.3
0.25
A bsorbancia

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Concentraciòn mg/ℓ Linear (Concentraciòn mg/ℓ )
Linear (Concentraciòn mg/ℓ )

A partir de la gráfica, resuelve esta pregunta:


Se mezcla 1 mℓ de una muestra problema con reactivo de Bradford, para un
volumen total de 3 mℓ. Calcula la concentración de proteínas en la muestra de
partida si el ensayo ha proporcionado un valor A595 = 0.049
Respuesta:
Usando la ecuación de la recta antes encontrada y despejando “x” y tomando
“y” como la absorbencia respuesta: 0,049, tenemos que:

0,049+ 0,0003
X=
0,0007

Escribe tu resultado: c = 70,4 mg/ℓ

ACTIVIDAD 2ª
El que se conoce como método de Bradford es un ensayo habitual para medir
la concentración de proteínas en una muestra. Se basa en que la unión del
colorante azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G250) a las proteínas
modifica el espectro visible de aquél.
Diseño del experimento: Todas las cubetas deben contener 1 mℓ del reactivo
de Bradford concentrado y un volumen total de 3 mℓ. En la primera cubeta no
se pondrá proteína, mientras que otras dos cubetas llevarán cantidades
diferentes de la disolución de proteína. Utiliza agua para completar el volumen
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que
hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en
cada cubeta:

Calibración: Introduce la primera cubeta (que sólo contiene reactivo de


Bradford) en el espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsa
el botón “A=0”. Esta muestra se denomina el "tubo blanco" o "blanco de
reactivos" y sirve para que el color propio del reactivo no se considere en la
determinación de proteínas.
Medida: A continuación, introduce el resto de cubetas, de una en una, en el
espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.

Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las


cubetas y el valor de absorbancia. Comparando entre sí las medidas,
¿observas alguna dependencia entre la absorbancia y la mayor o menor
concentración de proteínas en la cubeta?
Respuesta:
La dependencia se da por la ley de Beer donde relaciona la absorbancia con
intensidad de luz que se encuentre presente al pasar la luz por la muestra.

Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de proteínas en


la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es
de 800 mg/ℓ. Prepara una tabla con los datos y traza una gráfica representando
A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?
0.4
f(x) = 0.18 x − 0.18
0.35 R² = 1

0.3
0.25
A bsorbancia

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Concentraciòn mg/ℓ Linear (Concentraciòn mg/ℓ )
Linear (Concentraciòn mg/ℓ )

Respuesta:
En la gráfica se observa un comportamiento lineal, donde la absorbancia es
directamente proporcional a la concentración.
El R se encuentra cercano a 1 por lo tanto el resultado es fiable afirmando que
hay una relación lineal de los tres valores obtenidos.

ACTIVIDAD 3
Espectro de absorción de la hemoglobina
Diseño del experimento: Utilizando agua y la disolución de hemoglobina,
prepara distintas diluciones y analiza su espectro UV-VIS completo. Para ello,
llena una cubeta con hemoglobina y en las otras dos cubetas prepara sendas
mezclas diferentes de hemoglobina con agua. Todas las cubetas deben tener
un volumen total de 3 mℓ.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que
hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en
cada cubeta:

Medida: A continuación, introduce al espectrofotómetro las cubetas, de una en


una, y pulsa el botón para registrar el espectro entre 200 y 800 nm. Pulsa en el
icono de cámara de fotos y copia la imagen resultante para poderlas comparar
todas al terminar el experimento.
3 mL hemoglobina

2mL hemoglobina

1 ml hemoglobina
Análisis cualitativo de resultados: Compara los 3 espectros. ¿Qué efecto se
observa al diluir la hemoglobina de partida? ¿Cambia la posición (λ) de los
picos de absorción máxima? Describe lo que observas.
Respuesta:
Los efectos es la disminución en la Absorbencia de la muestra y esto se debe a
la proporcionalidad de la concentración.
Cuando se cambia el máximo de absorbancia se comienza a disminuir la
absorbancia en cada lectura entre más se aleje del máximo.
2ª medida: Observando el espectro, anota dos longitudes de onda (de la
región visible, no ultravioleta) en las que haya un pico (un máximo local de
absorción). A continuación mide y anota la absorbancia de las 3 cubetas a cada
una de esas dos longitudes de onda. Representa tus resultados en una gráfica,
considerando que la concentración de partida de hemoglobina (en la botella) es
de 200 mg/ℓ.
Se toman las absorbancias del visible entre 400 y 420 nm
Volumen de Concentración Longitud Longitud
hemoglobin mg/L de onda de onda
a en mL 400nm 420nm
1 66,67 0,275 0,492
2 133,33 0,55 0,989
3 200,00 0,822 1,495

Longitud de onda 400nm Linear (Longitud de onda 400nm)


Longitud de onda 420nm Linear (Longitud de onda 420nm)
1.6 1.5
1.4 f(x) = 0.5 x − 0.01
R² = 1
1.2
0.99
1
0.82
Absorbancia 0.8 f(x) = 0.27 x + 0
0.55
0.49R² = 1
0.6

0.4
0.28
0.2

0
66.67 133.33 200.00
Concentraciòn mg/L

Análisis cuantitativo de resultados: ¿Cómo puedes describir las


conclusiones de lo observado? ¿Cuál de las longitudes de onda sería útil para
determinar la concentración de muestras problema de hemoglobina?
Respuesta:
La Longitud de Onda adecuada seria 420nm ya que se presenta el máximo de
absorbencia como se aprecia en los espectros obtenidos, en la gráfica
encontramos una mayor linealidad de la ecuación de la recta.

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