Practica #2 Espectrofotometría

ESPECTROFOTOMETRIA

Jose David Gonzalez Mestra, Diana Paola Meneses, Jose Watt

UNIVERSIDAD DEL MAGDALENA

RESUMEN
En este laboratorio se trabajó con la espectrofotometría (Aparato de alta precisión que se
usa en colorimetría para analizar la composición espectral de una muestra de luz (reflejada
o incidente)) cumpliéndose nuestro objetivo de aplicar los conocimientos teóricos
adquiridos en la teoría para la realización de la espectrofotometría y comprender la
importancia de esta en los procedimientos de laboratorio que se requiera, tales como;
Determinar la concentración de una solución (La concentración de una solución lo da el
número de moléculas que tenga que tenga el soluto de una sustancia y el número de
moléculas que tiene el resto de la sustancia.) Aplicar la Ley de Lambert Beer en los
ejercicios propuestos. (Permite hallar la concentración de una especie química a partir de la
medida de la intensidad de luz absorbida por la muestra) Establecer la relación entre la
absorbancia y la Transmitancia con la concentración de una solución mediante fórmulas.

Palabras Claves: soluciones, concentración, absorbancia, transmitancia

ABSTRACT

In this laboratory we worked with spectrophotometry (High precision apparatus used in

colorimetry to analyze the spectral composition of a light sample (reflected or incident)),
fulfilling our objective of applying the theoretical knowledge acquired in theory to perform
spectrophotometry and understand the importance of this in the laboratory procedures
required, such as; Determine the concentration of a proposed solution. (It allows to find the
concentration of a chemical species from the measurement of the intensity of light absorbed
by the sample) Establish the relationship between absorbance and transmission with the
concentration of a solution using formulas.

Key Words: solutions, concentration, absorbance, transmittance

MATERIALES Y MÉTODOS

Para realizar nuestra experiencia se ha llevado acabo practicas experimentales que nos
permitan resolver las incógnitas, buscar respuestas e hacer uso del conocimiento previo
implementado de manera teórica. La intuición y la inspiración juegan un papel importante y
forman parte de un proceso sistemático. Para la resolución de estas incógnitas se utilizaron
las formulas y métodos visibles en el apartado de cada experimento; dependiendo en sí de
que incógnita se esté resolviendo, haciendo uso de procedimientos matemáticos precisos o
páginas en las formulas. Para realizar estas prácticas experimentales fueron de vital
importancia el uso de materiales como; la página de simulación de experimentos con
espectrofotómetro [ CITATION Anger \l 3082 ] que nos entrega todas las herramientas
requeridas para la realización de estos procedimientos tales como los siguientes materiales;
espectrofotómetro, cubetas, pipetas. Y el uso de las siguientes sustancias: agua (H2O), pNF
(para-nitrofenol) NADH (Nicotinamida adenina dinucleótido) y otras sustancias
visualizadas en cada apartado de los experimentos, los cuales nos ayudaron a realizar
determinadas prácticas. También se usó la calculadora y algunos formatos Excel para la
realización de gráficas y tablas.
DISCUSIÓN

PRÁCTICA 1. RELACIÓN ENTRE ABSORBANCIA Y CONCENTRACIÓN

Calibración: Primeramente, llena una Celda y/o cubeta con 3 mℓ de agua, introdúcela en el

espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 405 nm y pulsa el botón “A=0”. Saca la
cubeta y vacíala.

Procedimiento: Utilizando el para-nitrofenol (pNF) y agua, prepara 3 muestras en sendas

cubetas, que contengan distintos volúmenes de pNF y siempre un volumen total de 3 mℓ.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu
cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:

Celda y/o cubeta 1.0 2.0

3.0

Volumen de pNF 1 2 3 mL

Volumen de 2 1 0 mL
Agua

Una vez preparadas las 3 mezclas en las 3 celdas, introdúcelas de una en una al
espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.
Celda y/o Cubeta 1.0 2.0 3.0

A405 = 0.528 1.06 1.584

Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las celdas y el

valor de absorbancia. Comparando las 3 medidas, ¿observas alguna dependencia entre el
valor de absorbancia y la mayor o menor concentración de pNF en la cubeta?

R/ Si, considero que según las muestras que tome se puede concluir que la absorbancia y la
concentración de pNF son directamente proporcionales, siendo estas directamente
proporcionales, ya que mientras mayor sea la concentración de para-nitrofenol en la cubeta,
mayor será el valor de absorbancia en esta y asi se ve demostrado en cada muestra
visualizando a la cubeta 1 con 0.528ml (La que mayor cantidad de agua trae) de solución
teniendo la menor concentración de pNF y por ende menor absorbancia.

Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de pNF en la mezcla final

de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 80 µM pNF. Prepara una
tabla con los datos y traza una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir
lo que observas?
V1xC1 = V2xC2

Figura 1. Calculo de concentración de pNF

MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3
V1 1 2 3 mL
C1 80 80 80 uM
V2 3 3 3 mL
C2 26,66666667 53,3333333 80 uM

Celda y/o
C(μM) A405
Cubeta
1 26,666 0.528
2 53,333 1.061
3 80 1.584
Nota. Acá se visualiza la resolución con la formula V1xC1 = V2xC2

Figura 2. Grafica sobre la relación de C y A

Nota. Datos correspondientes a la Solución pNF directamente proporcional.

A partir de la gráfica, resuelve esta pregunta:

Se mezcla 1 mℓ de una muestra problema con 2 mℓ de agua. Calcula la concentración de
pNF en la muestra de partida si el ensayo ha proporcionado un valor A405 = 0.528
Escribe tu resultado: C = ___27,78___µM
PRÁCTICA 2. FUNDAMENTO DE UN ENSAYO DE CUANTIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS DISUELTAS EN EL REACTIVO

El que se conoce como método de Bradford es un ensayo habitual para medir la

concentración de proteínas en una muestra. Se basa en que la unión del colorante azul de
Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G250) a las proteínas modifica el espectro visible de
aquél.
Prepara una celda sólo con reactivo de Bradford y otras dos celdas (o más) con cantidades
diferentes de la disolución de proteína. Añade a todas las celdas la cantidad de reactivo
necesaria para un volumen total de 3 mℓ en cada una.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu
cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:

Celda y/o cubeta 1. 2.0 3.0

0
Volumen de Proteína 0 1 2 mL
Volumen de Reactivo 3 2 1 mL

Calibración: Introduce la primera celda (que sólo contiene el reactivo de Bradford) en el

espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsa el botón “A=0”. Esta
muestra se denomina el "tubo blanco" o "blanco de reactivos" y sirve para que el color
propio del reactivo no se considere en la determinación de proteínas.
Medida: A continuación, introduce el resto de celdas, de una en una, en el
espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.
Celda y/o 1.0 2.0 3.0
Cubeta
A595 = 0.000 0.186 0.369

Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las cubetas y el

valor de absorbancia. Comparando entre sí las medidas, ¿observas alguna dependencia
entre la absorbancia y la mayor o menor concentración de proteínas en la cubeta?

R/ Podemos apreciar que a medida que aumenta la concentración de la proteína en las

cubetas, el valor de la absorbancia incrementa con esta. Vemos que al añadir un ml de
proteína a 2 ml del reactivo de Bradford marca una absorbancia de 0.186, y al añadirle 2 ml
a 1 ml de proteína de Bradford marca 0.369.

Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de proteínas en la mezcla

final de cada celda, sabiendo que la concentración en la botella es de 800 mg/ℓ. Prepara una
tabla con los datos y traza una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir
lo que observas?
 Celda y/o C(mg/l) A595
Cubeta
1 0.000 0.000
2 134.78 0.187
3 267.39 0.369

Figura 3. Grafica sobre relación C y A

Nota. Datos correspondientes a las proteínas disueltas en el reactivo.

De la gráfica podemos apreciar que esa mantiene una relación lineal entre absorbancia en
función de la concentración de la proteína. Para la gráfica añadí un valor adicional el cual
es la absorbancia del reactivo solo y su concentración.

A partir de la gráfica, resuelve esta pregunta:

Se mezcla 1 mℓ de una muestra problema con reactivo de Bradford, para un volumen total
de 3 mℓ. Calcula la concentración de proteínas en la muestra de partida si el ensayo ha
proporcionado un valor A595 = (descubre el valor en la página web) = 0,144
Escribe tu resultado: C = ___104,34__mg/ℓ

PRÁCTICA 3. FUNDAMENTO DE UN ENSAYO DE CUANTIFICACIÓN DE

PROTEÍNAS DISUELTAS EN AGUA

Procedimiento: Todas las celdas deben contener 1 mℓ del reactivo de Bradford

concentrado y un volumen total de 3 mℓ. En la primera celda no se pondrá proteína,
mientras que otras dos celdas llevarán cantidades diferentes de la disolución de proteína.
Utiliza agua para completar el volumen.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu
cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:

Celda y/o cubeta 1.0 2.0 3.

0
Volumen de 0 1 2 mL
Proteína
 Volumen de agua 2 1 0 mL
Volumen de 1 1 1 mL
Reactivo

Calibración: Introduce la primera celda (que sólo contiene reactivo de Bradford) en el

espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsa el botón “A=0”. Esta
muestra se denomina el "tubo blanco" o "blanco de reactivos" y sirve para que el color
propio del reactivo no se considere en la determinación de proteínas.
Medida: A continuación, introduce el resto de celdas, de una en una, en el
espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.

Celda y/o Cubeta 1.0 2.0 3.0

A595 = -0,277 0,040 0.378
Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las celdas y el
valor de absorbancia. Comparando entre sí las medidas, ¿observas alguna dependencia
entre la absorbancia y la mayor o menor concentración de proteínas en la cubeta?

R/ Podemos apreciar que a medida que aumenta la concentración de la proteína en las

cubetas, el valor de la absorbancia incrementa con esta. En la primera muestra no hay
proteína, solo el reactivo más agua por lo que el valor de la absorbancia es negativo. A
medida que vamos aumentando la concentración de la proteína la absorbancia de las
muestras va aumentando.

Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de proteínas en la mezcla

final de cada celda, sabiendo que la concentración en la botella es de 800 mg/ℓ. Prepara una
tabla con los datos y traza una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir
lo que observas?

Celda y/o C(mg/l) A595

Cubeta
1 -200,72 -0,277
2 28,98 0.040
3 273.91 0.378

Figura 4. Gráfica: Representación A frente a C

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-300 -200 -100 0 100 200 300 400
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
Nota. Datos correspondientes a la concentración de proteínas y la absorbencia de la
solución.

En la gráfica podemos apreciar que se cumple lo establecido por la ley de beer, lo cual dice
que la concentración y la absorbancia son directamente proporcionales, lo cual está
demostrado en esta gráfica.

PRÁCTICA 4. ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA HEMOGLOBINA

El color rojo de la hemoglobina se debe a que absorbe radiación visible, aunque también
presenta picos de absorción en y cerca de la región ultravioleta.

Procedimiento: Utilizando agua y la disolución de hemoglobina, prepara distintas

diluciones y analiza su espectro UV-VIS completo. Para ello, llena una celda con
hemoglobina y en las otras dos celdas prepara sendas mezclas diferentes de hemoglobina
con agua. Todas las celdas deben tener un volumen total de 3 mℓ.

Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu
cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:
Celda y/o cubeta 1.0 2.0 3.0
Volumen de Hemoglobina 3 2 1 mL
Volumen de Agua 0 1 2 mL

Medida: A continuación, introduce al espectrofotómetro las celdas, de una en una, y pulsa

el botón para registrar el espectro entre 200 y 800 nm. Pulsa en el icono de cámara de fotos
y copia la imagen resultante para poderlas comparar todas al terminar el experimento.

Análisis cualitativo de resultados: Compara los 3 espectros. ¿Qué efecto se observa al

diluir la hemoglobina de partida? ¿Cambia la posición (λ) de los picos de absorción
máxima? Describe lo que observas.

RTA:
 Figura 5. Cubeta 1 Figura 6. Cubeta 2

Figura 7. Cubeta 3

1. ¿Qué efecto se observa al diluir la hemoglobina de partida?

RTA: Se observa que los espectros se van reduciendo a medida que va variando la
concentración de los líquidos en la respectiva solución.

2. ¿Cambia la posición (λ) de los picos de absorción máxima? Describe lo que

observas.
RTA: Se puedo apreciar que el espectro va disminuyendo considerablemente a
medida que se diluye la hemoglobina en el agua, reduciendo sus picos de absorción
máxima.

2ª medida: Observando el espectro, anota dos longitudes de onda (de la región visible, no

ultravioleta) en las que haya un pico (un máximo local de absorción). A continuación, mide
y anota la absorbancia de las 3 cubetas a cada una de esas dos longitudes de onda.
Representa tus resultados en una gráfica, considerando que la concentración de partida de
hemoglobina (en la botella) es de 200 mg/ℓ.
R/

Figura 8. Cálculo de la dilución de las tres cubetas.

Celda y/o C λ1 = 344 λ2 = 628.

Cubeta (mg/l) A…… A……
1 0 0,341 0,002
2 400 0,224 0,001
3 100 0,111 0,001

Figura 9. Absorbancia de las 3 cubetas.

Análisis cuantitativo de resultados:

1. ¿Cómo puedes describir las conclusiones de lo observado? Y ¿Cuál de las
longitudes de onda sería útil para determinar la concentración de muestras problema
de hemoglobina?

RTA: Podemos concluir en base a los resultados del experimento que es más útil el
usar la longitud de la onda visible para determinar la concentración muestra-
 problema de hemoglobina, ya que esta es la parte de espectro electromagnético que
los ojos humanos son capaces de detectar, además, cubre todos los colores del azul
a 400 nm al rojo a 700 nm.

PRÁCTICA 5. ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LAS DIVERSAS FORMAS

REDOX DE LA HEMOGLOBINA

Se trata de comparar el espectro de absorción en la región de luz visible entre las diversas
formas de la hemoglobina.
Añade a cada una de las celdas 3 mℓ de una de las muestras: desoxihemoglobina,
oxihemoglobina, metahemoglobina, carboxihemoglobina o cianmetahemoglobina.
Introduce cada una en el especrofotómetro y registra su espectro, guardando la imagen
obtenida al pulsar. Anota las longitudes de onda de los máximos de absorción de cada
muestra:

N° Celda y/o cubeta 1 2 3 4 5

Tipo de Hemoglobina Desoxi- Oxihemo Metahemo Carboxihe- Cianmeta-
hemoglobina - - moglobina meglobia
globina globina
(λ ) máximas de 0,558 0,679 0,406 0,651 0,538
Absorción

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la absortividad y absortividad molar?

 R/ Entre ambos términos no hay una diferencia, puesto que ambos se utilizan para
expresar la misma idea. Absortividad o absorbancia molar, es la absorbancia de una
solución por unidad de una trayectoria de trayectoria y concentración, la cual se
puede hallar utilizando la ley de Beer Lamber.

2. ¿Para qué utilizaría usted la curva de calibración?

3. ¿Qué limitaciones presenta la ley de Beer?

R/
 La concentración. Sólo es aplicable a disoluciones diluidas (menor 10-2 M); en
disoluciones concentradas la distancia entre partículas absorbentes es tan
pequeña que se produce en la distribución de cargas de estas, lo que se traduce
en una alteración en la capacidad de absorción a una longitud de onda
determinada. Este efecto se puede eliminar mediante dilución.

 La interacción entre el soluto y la radiación debida a mecanismos diferentes a la

absorción pero que producen alteraciones en la intensidad de la luz, tales como
la dispersión, reflexión, la fluorescencia, etc.

 Utilización de radiación no monocromática, puesto que la ley está definida para

radiaciones con una sola longitud de onda. Sin embargo, si la calidad del equipo
no es buena, se obtienen bandas de radiaciones con un estrecho intervalo de
longitudes de onda.

 Falta de uniformidad de la muestra o especie absorbente, o presencia de

impurezas.

 Desviaciones químicas, debidas a reacciones del absorbente con el

disolvente[ CITATION Sug \l 3082 ]
4. Consulte que aplicaciones de la espectrofotometría en su carrera

La espectrofotometría en la enfermería es aplicada para contribuir al desarrollo de mejores

medicamentos, tratamientos más eficaces de intoxicaciones y la prevención de reacciones
indeseables, Esta técnica es obtenida por diferenciación de espectros ultravioleta y visible
permite una medición muy exacta de la longitud de onda de máxima absorbancia y una
perfecta resolución de los espectros, suministrando una información de la sustancia
analizada mucho más completa que el espectro original, al tiempo que permite eliminar las
interferencias en las medidas, causadas por la presencia en el medio de la matriz biológica,
de excipientes, disolventes. [ CITATION Ran02 \l 3082 ]
CONCLUSIÓN

En este trabajo se realizó una práctica experimental haciendo utilización del

espectrofotómetro, Teniendo en cuenta que la base de este trabajo fue aplicar los
conocimientos adquiridos en la teoría, cumpliéndose nuestro objetivo aplicando los
conocimientos teóricos adquiridos en la teoría para la realización de la espectrofotometría y
comprendiendo y exponiendo la importancia de esta en los procedimientos de laboratorio
que aquí se realizaron tales como; Determinar la concentración de una solución, el cual
realizamos con las soluciones propuestas haciendo los cálculos correspondientes y
resolviendo las incógnitas despejando las formulas. Aplicar la Ley de Lambert Beer en los
ejercicios propuestos permitiéndonos hallar la concentración molecular con solo utilizar los
cálculos correspondientes. Establecer la relación entre la absorbancia y la Transmitancia
con la concentración de una solución mediante fórmulas.

Esto con la finalidad de resolver cualquier tipo de inquietudes sobre los temas tratados en
las actividades que se realizaran en un futuro en esta asignatura, llenándonos de
conocimientos previos y realizar un trabajo provechoso. La espectrofotometría es usada
para identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de un
material o sustancia, esto último nos permite conocer la concentración de compuestos,
seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas, así como determinar enzima y
proteínas incluso ácidos nucleicos.

BIBLIOGRAFÍA

Farhat, R. (2002). Dialnet. Obtenido de https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=12144

Herráez., A. (Septiembre de 2021 Ver.). Biomodel. Obtenido de

http://biomodel.uah.es/lab/abs/espectro.htm

Sugetita. (s.f.). Scribt. Obtenido de https://es.scribd.com/doc/155980553/Limitaciones-de-La-Ley-

de-Lambert#:~:text=La%20ley%20de%20Lambert-Beer%20tiene%20unas%20limitaciones
%20que,se%20pone%20en%20marcha%20las%20interacciones%20electrostticas%20