Espectrofotometría, Curva de Calibración y Determinación de Proteínas por el método de Biuret.

María José Astorga; Daniela Soto; Dayane Rivera

Fecha: 01 mayo 2012

La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución, basados en sus propiedades fisicoquímicas. Como es el caso de las propiedades de compuestos como proteínas, que absorben cierta intensidad de luz (cromóforos) en el espectro UV- visible. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución, con lo cual, a partir de ello se realiza una curva de calibración con las absorbancias medidas por el aparato a concentraciones exactamente conocidas de un tipo en un mismo volumen. Se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida. en donde las proteínas y péptidos dan positiva a esta reacción. Para colocar a prueba todo lo indicado se pretende construir una curva de calibración para la determinación de proteínas plasmáticas mediante el método de biuret. además de determinar la misma en una muestra desconocida. La absorción de las radiaciones ultravioleta. en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Los resultados esperados son demostrar que las soluciones que tienen mayor concentración de proteínas sean las que tengan un valor de absorbancia mayor en comparación a las que su concentración estándar de proteínas es menor. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro. La absorbancia que es la cantidad de luz absorbida por una solución de determinada concentración a una longitud fija. además de obtener los niveles precisos de proteínas en solución y la concentración exacta de proteínas presentes.  Espectrofotómetro La determinación de proteínas se efectuara por el método de biuret. en donde el valor de la absorbancia es proporciona a la concentración de proteínas presentes en la solución.Introducción Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. se medirá en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 546 nm. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. y es característica para cada sustancia química. . La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución.

Reactivo Biuret. Agua destilada.Materiales Espectrofotómetro ajustado a 546 nm. Muestra de suero y estándar de proteínas totales. . Timer o cronometro. Material volumétrico.  Micro-pipetas de 100µl y de 1000µl  Tubos de ensayo.5 ml. Cubetas de plástico de 1.

Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl suero normal.  Tabla 1: Tubo 1 Blanco (µl) 50 ------------------2000 Tubo 2 Normal (µl) 25 ------25 ------2000 Tubo 3 Patológico (µl) 25 ------------25 2000 Tubo 4 (µl) 30 20 ------------2000 Tubo 5 (µl) 20 30 ------------2000 Tubo 6 (µl) 10 40 ------------2000 Tubo 7 (µl) ------50 ------------2000 Agua Destilada Estándar Proteínas Suero Normal Suero patológico Reactivo Biuret 3) Mezclamos por agitación todos los tubos con sus respectivos agregados. 5) Leímos la absorbancia de cada uno de los tubos a 546 nm. Añadimos 30 µl de agua destilada y 20 µl de concentración estándar proteínas.Métodos 1) Rotulamos 7 tubos de ensayo y los situamos en la gradilla. Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl de suero patológico. . 4) Incubamos los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tubo 6: Añadimos 10 µl de agua destilada y 40 µl de concentración estándar de proteínas. 2) Preparamos los 7 tubos de ensayo tal cual se nos indico y se resumen en la tabla 1:      Tubo 1: Tubo 2: Tubo 3: Tubo 4: Añadimos 50 µl de agua destilada. Tubo 7: Añadimos 50 µl de concentración estándar de proteínas. Tubo 5: Añadimos 20 µl de agua destilada y 30 µl de concentración estándar de proteínas.   Nota: Luego de realizado el paso anterior se les agrego a todos los tubos 2000 µl del reactivo de biuret.

586 0.Absorbancia y concentración de proteínas real de tubos 4.683 0.586 0.652 0.8 18.9 18.39 (g/dl) 5 0.733  2).78 (g/dl) 7 0.3 21.Resultados de Absorbancia y Transmitancia a 546 nm tal como se muestra en tabla 2:  Tabla 2: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 T% 29.536 0.0 22..6 26.659 0.39 mg/ml 40 x 30 = x 2050 = 0.659 0.5 Absorbancia 0.59 (g/dl) 6 0.1 20.733 0.730 0. 5..652 0.59 mg/ml .Resultados  1).98 (g/dl) Tubo N° Absorbancia Concentración de proteínas (g/dl) Tubo N°4 Tubo N°5 40 x 20 = x 2050 = 0. 6 y 7 como se indica en tabla 3:  Tabla 3: 4 0.

78 mg/ml  3).05 0. 6 y 7 según se indica en tabla 4 para realización de posterior grafico.197 .05 = 0..Tubo N°6 Tubo N°7 40 x 40 = x 2050 40 x 50 = x 2050 = 0.98 mg/ml = 0.123 = 0. 5.123 0.197 Tubo N°4 Tubo N°5 = 0.116 0.116 Tubo N°6 Tubo N°7 = 0. ∆absorbancia:  Tabla 4: Tubo 4 5 6 7 ─ ∆absorbancia (∆A) 0.Calcular ∆A de los tubos 4.

05 0.05 0. 6 y 7.116 0. 5 .78 0.59 0.De acuerdo a los resultados obtenidos de ∆A para los tubos 4.78 0.59 0.15 0. realice grafico (grafico 1).2 0.39 0.123 curva de calibración ∆ Absorbancia Concentracion de Proteinas .98 0.. 4).25 0.1 0.123 0.197 0.116 0.98 ∆A (eje y) 0. según lo indicado en Tabla 5: Concentración de proteínas (eje x) vs ∆absorbancia (eje y).  Tabla 5: [ ] de proteínas (eje x) 0.05 0 0.39 0.197 Tubo 4 5 6 7  Grafico 1: Curva de calibración 0.

 Calculo de la pendiente: Utilizando los datos extremos medidos de absorción y concentración del patrón.Determinación de nivel de proteínas y muestras de suero a través de la ecuación de la recta con los datos conocidos de los patrones. Tubo 4: Tubo 7: . n: coeficiente de posición. m: pendiente. x: concentración.  Calculo del coeficiente de variación: Reemplazando los datos determinados de manera experimental en la ecuación de los valores extremos.  Ecuación de la recta: Siendo la ecuación de la recta: Donde: y: absorbancia.

730 .683  Calculo de concentración de proteínas para la muestra con el suero patológico: -Absorbancia del suero patológico: 0.Por lo tanto. la ecuación de la recta para la curva de calibración es:  Calculo de concentración de proteínas para la muestra suero normal: -Absorbancia del suero normal: 0.

 Preguntas guía: 1. y obtener resultados para la determinación de proteínas totales en solución. Tal como se ha realizado con anterioridad en nuestro trabajo y en trabajos anteriores se ocupo en particular el “reactivo de biuret” a pesar de la existencia de otros para los mismos fines. se emplean reactivos (reactivo de Biuret) que le proporcionen color a estas sustancias para que puedan ser estudiadas y así realizar la curva de calibración. ya que los tubos con mayor concentración de proteínas fueron los que obtuvieron valores de absorbancia mayor. su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración.Discusión Al concluir este trabajo y obtener los resultados. 2. La elaboración de la curva de calibración es la fase principal al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. pero si se presentan sustancias no coloreadas. Una vez ensayadas las soluciones problemas. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir? Una curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A. ya que nos permitió cuantificar de manera muy precisa. . es importante señalar que tal como se pensaba. efectivamente la lectura de la absorbancia y la relación absorbanciaconcentración es directamente proporcional. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloradas? No se podrá construir una curva de calibración. Se emplea en trabajos cuantitativos en los cuales hay que calcular la concentración del absorbente. Al realizar la curva de calibración nos muestra una representación ascendente en cuanto a la concentración de proteínas y la variación de absorbancia de una solución. lo que se traduce en lo antes ya señalado. que es una recta. construyéndose la curva de calibrado.

Sus valores normales oscilan entre 3. es la proteína más abundante en el plasma (50% aprox.3. ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante? La Albúmina. si bien en menor cantidad. Presenta un máximo de absorción a 540 nm. Otra de sus funciones consiste en el transporte de sustancias. 5. Al unirse con las hormonas. La intensidad de este color se mide en el espectrofotómetro y es proporcional a la cantidad de proteínas presentes. y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta).5 y 5 g/100 ml. medicamentos. ¿Cuál es el fundamento del reactivo de Biuret? Por el método de Biuret se puede determinar la presencia de proteínas totales en una mezcla. siendo este tubo una base (solución tipo) de absorbancia que presenta esta técnica. etc. vitaminas. pero también. en otros tejidos. Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos. las lleva por la circulación a sus órganos efectores. bilirrubina..) se forma predominantemente en el hígado. llegando a establecer por una diferencia el valor real de la absorbancia de la muestra y poder realizar los cálculos pertinentes a exponer. 4. con aparición de una coloración azulada (cambia a violeta luego en presencia de proteínas. Es responsable principalmente por la presión coloidoosmótica del plasma. . En fin. existe una comparación colorimétrica con la muestra tratada. Las soluciones deben prepararse simultáneamente. ¿Cuál es objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas? El fin de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas se debe a comparaciones que se logran realizar.

ar/contratapa/calibracion/calibracion. es por eso que se prefiere.ar/catedras/bioquimica/pdf/proteinas. en cuanto a que la absorbancia es proporcional a la concentración de proteínas en una muestra.fcen. no siendo difícil manipular los materiales y trabajar con el espectrofotómetro para obtener dichos resultados.pdf http://mazinger. y además mediante este método obtuvimos valores exactos de la contracción de proteínas real en cada tubo. lo cual podría modificar los resultados.pdf http://adolfoneda.es/spanish/practicas/p29.edu.med.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE %20PROTE%C3%8DNAS.wanadoo. y además muestra pocas interferencias.unne.edu.com/proteinas-plasmaticas/ http://www3. Referencias y Bibliografía http://catedras.cl/FacultadesInstitutos/laboratorio/colorT3.uba.unlp.uchile.htm http://perso.htm .sisib.htm http://www.pdf http://www.ucn.ar/qo3/Apuntes/Biuret.panreac. Que si pensamos en ocuparlos para fines de mayor índole como puede ser en el área de salud es primordial evitar los posibles errores que mas que nada podrían ser de manipulación.uco.pdf http://www.Conclusión El método ocupado en esta oportunidad es tan efectivo como preciso para la determinación de proteínas en solución.htm http://www. este nos permitió obtener lo que se pensaba.es/sergioram1/espectrofotometria.quimica.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/steinera/part e02/07b.quimicaviva.qb.

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