Espectrofotometra, Curva de Calibracin y Determinacin de Protenas por el mtodo de Biuret.

Mara Jos Astorga; Daniela Soto; Dayane Rivera

Fecha: 01 mayo 2012

La espectrofotometra es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin, basados en sus propiedades fisicoqumicas. Como es el caso de las propiedades de compuestos como protenas, que absorben cierta intensidad de luz (cromforos) en el espectro UV- visible. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin, con lo cual, a partir de ello se realiza una curva de calibracin con las absorbancias medidas por el aparato a concentraciones exactamente conocidas de un tipo en un mismo volumen. Se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

Introduccin
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante. La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

Espectrofotmetro

La determinacin de protenas se efectuara por el mtodo de biuret, en donde las protenas y pptidos dan positiva a esta reaccin. La absorbancia que es la cantidad de luz absorbida por una solucin de determinada concentracin a una longitud fija, se medir en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 546 nm; en donde el valor de la absorbancia es proporciona a la concentracin de protenas presentes en la solucin. Para colocar a prueba todo lo indicado se pretende construir una curva de calibracin para la determinacin de protenas plasmticas mediante el mtodo de biuret; adems de determinar la misma en una muestra desconocida. Los resultados esperados son demostrar que las soluciones que tienen mayor concentracin de protenas sean las que tengan un valor de absorbancia mayor en comparacin a las que su concentracin estndar de protenas es menor; adems de obtener los niveles precisos de protenas en solucin y la concentracin exacta de protenas presentes.

Materiales

Espectrofotmetro ajustado a 546 nm. Cubetas de plstico de 1,5 ml. Material volumtrico. Micro-pipetas de 100l y de 1000l Tubos de ensayo. Muestra de suero y estndar de protenas totales. Reactivo Biuret. Timer o cronometro. Agua destilada.

Mtodos
1) Rotulamos 7 tubos de ensayo y los situamos en la gradilla. 2) Preparamos los 7 tubos de ensayo tal cual se nos indico y se resumen en la tabla 1: Tubo 1: Tubo 2: Tubo 3: Tubo 4: Aadimos 50 l de agua destilada. Aadimos 25 l de agua destilada y 25 l suero normal. Aadimos 25 l de agua destilada y 25 l de suero patolgico. Aadimos 30 l de agua destilada y 20 l de concentracin estndar protenas.

Tubo 5: Aadimos 20 l de agua destilada y 30 l de concentracin estndar de protenas. Tubo 6: Aadimos 10 l de agua destilada y 40 l de concentracin estndar de protenas. Tubo 7: Aadimos 50 l de concentracin estndar de protenas.

Nota: Luego de realizado el paso anterior se les agrego a todos los tubos 2000 l del reactivo de biuret.

Tabla 1:
Tubo 1 Blanco (l) 50 ------------------2000 Tubo 2 Normal (l) 25 ------25 ------2000 Tubo 3 Patolgico (l) 25 ------------25 2000 Tubo 4 (l) 30 20 ------------2000 Tubo 5 (l) 20 30 ------------2000 Tubo 6 (l) 10 40 ------------2000 Tubo 7 (l) ------50 ------------2000

Agua Destilada Estndar Protenas Suero Normal Suero patolgico Reactivo Biuret

3) Mezclamos por agitacin todos los tubos con sus respectivos agregados. 4) Incubamos los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. 5) Lemos la absorbancia de cada uno de los tubos a 546 nm.

Resultados
1).- Resultados de Absorbancia y Transmitancia a 546 nm tal como se
muestra en tabla 2: Tabla 2: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 T% 29,1 20,8 18,6 26,0 22,3 21,9 18,5 Absorbancia 0,536 0,683 0,730 0,586 0,652 0,659 0,733

2).- Absorbancia y concentracin de protenas real de tubos 4, 5, 6 y 7 como se indica en tabla 3: Tabla 3: 4 0,586 0,39 (g/dl) 5 0,652 0,59 (g/dl) 6 0,659 0,78 (g/dl) 7 0,733 0,98 (g/dl)

Tubo N Absorbancia Concentracin de protenas (g/dl)

Tubo N4

Tubo N5

40 x 20 =

x 2050 = 0,39 mg/ml

40 x 30 =

x 2050 = 0,59 mg/ml

Tubo N6

Tubo N7

40 x 40 =

x 2050

40 x 50 =

x 2050 = 0,98 mg/ml

= 0,78 mg/ml

3).- Calcular A de los tubos 4, 5, 6 y 7 segn se indica en tabla 4 para realizacin de posterior grafico.

absorbancia:
Tabla 4: Tubo 4 5 6 7

absorbancia (A) 0.05 0.116 0.123 0.197

Tubo N4

Tubo N5

= 0.05

= 0.116

Tubo N6

Tubo N7

= 0.123

= 0.197

 4).- De acuerdo a los resultados obtenidos de A para los tubos 4, 5 , 6 y 7, realice grafico (grafico 1); segn lo indicado en Tabla 5: Concentracin de protenas (eje x) vs absorbancia (eje y). Tabla 5: [ ] de protenas (eje x) 0.39 0.59 0.78 0.98 A (eje y) 0.05 0.116 0.123 0.197

Tubo 4 5 6 7

Grafico 1:

Curva de calibracin
0,25 0,197 0,2 0,15 0,1 0,05 0,05 0 0,39 0,59 0,78 0,98 0,116 0,123 curva de calibracin

Absorbancia

Concentracion de Proteinas

Determinacin de nivel de protenas y muestras de suero a travs de la ecuacin de la recta con los datos conocidos de los patrones.

Ecuacin de la recta:

Siendo la ecuacin de la recta: Donde: y: absorbancia. m: pendiente. x: concentracin. n: coeficiente de posicin. Calculo de la pendiente:

Utilizando los datos extremos medidos de absorcin y concentracin del patrn.

Calculo del coeficiente de variacin:

Reemplazando los datos determinados de manera experimental en la ecuacin de los valores extremos.

Tubo 4:

Tubo 7:

Por lo tanto, la ecuacin de la recta para la curva de calibracin es:

Calculo de concentracin de protenas para la muestra suero normal: -Absorbancia del suero normal: 0.683

Calculo de concentracin de protenas para la muestra con el suero patolgico: -Absorbancia del suero patolgico: 0.730

Discusin

Al concluir este trabajo y obtener los resultados, es importante sealar que tal como se pensaba; efectivamente la lectura de la absorbancia y la relacin absorbanciaconcentracin es directamente proporcional, ya que los tubos con mayor concentracin de protenas fueron los que obtuvieron valores de absorbancia mayor. Al realizar la curva de calibracin nos muestra una representacin ascendente en cuanto a la concentracin de protenas y la variacin de absorbancia de una solucin, lo que se traduce en lo antes ya sealado. Tal como se ha realizado con anterioridad en nuestro trabajo y en trabajos anteriores se ocupo en particular el reactivo de biuret a pesar de la existencia de otros para los mismos fines, ya que nos permiti cuantificar de manera muy precisa, y obtener resultados para la determinacin de protenas totales en solucin. Preguntas gua:
1. Qu es una curva de calibracin? Qu caractersticas debe cumplir?

Una curva de calibracin es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de abcisas). Se emplea en trabajos cuantitativos en los cuales hay que calcular la concentracin del absorbente. Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A, construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de las A de las soluciones problema en la curva de calibracin. La elaboracin de la curva de calibracin es la fase principal al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotomtrico.
2. Se puede construir una curva de calibracin con sustancias no coloradas?

No se podr construir una curva de calibracin; pero si se presentan sustancias no coloreadas, se emplean reactivos (reactivo de Biuret) que le proporcionen color a estas sustancias para que puedan ser estudiadas y as realizar la curva de calibracin.

3. Cul es objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimtricas?

El fin de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimtricas se debe a comparaciones que se logran realizar; siendo este tubo una base (solucin tipo) de absorbancia que presenta esta tcnica, llegando a establecer por una diferencia el valor real de la absorbancia de la muestra y poder realizar los clculos pertinentes a exponer. Las soluciones deben prepararse simultneamente. En fin, existe una comparacin colorimtrica con la muestra tratada.
4. Cul es el fundamento del reactivo de Biuret?

Por el mtodo de Biuret se puede determinar la presencia de protenas totales en una mezcla. Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una solucin de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de una coloracin azulada (cambia a violeta luego en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta). Presenta un mximo de absorcin a 540 nm. La intensidad de este color se mide en el espectrofotmetro y es proporcional a la cantidad de protenas presentes.

5. Cul es la protena plasmtica ms abundante?

La Albmina, es la protena ms abundante en el plasma (50% aprox.) se forma predominantemente en el hgado, pero tambin, si bien en menor cantidad, en otros tejidos. Es responsable principalmente por la presin coloidoosmtica del plasma. Otra de sus funciones consiste en el transporte de sustancias. Al unirse con las hormonas, vitaminas, bilirrubina, medicamentos, etc., las lleva por la circulacin a sus rganos efectores. Sus valores normales oscilan entre 3,5 y 5 g/100 ml.

Conclusin

El mtodo ocupado en esta oportunidad es tan efectivo como preciso para la determinacin de protenas en solucin, y adems muestra pocas interferencias, es por eso que se prefiere; este nos permiti obtener lo que se pensaba, en cuanto a que la absorbancia es proporcional a la concentracin de protenas en una muestra, y adems mediante este mtodo obtuvimos valores exactos de la contraccin de protenas real en cada tubo, no siendo difcil manipular los materiales y trabajar con el espectrofotmetro para obtener dichos resultados. Que si pensamos en ocuparlos para fines de mayor ndole como puede ser en el rea de salud es primordial evitar los posibles errores que mas que nada podran ser de manipulacin, lo cual podra modificar los resultados.

Referencias y Bibliografa
http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Biuret.pdf http://adolfoneda.com/proteinas-plasmaticas/ http://www3.ucn.cl/FacultadesInstitutos/laboratorio/colorT3.htm http://www.panreac.es/spanish/practicas/p29.pdf http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometria.htm http://www.med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/proteinas.pdf http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE %20PROTE%C3%8DNAS.pdf http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/steinera/part e02/07b.htm