Espectrofotometría, Curva de Calibración y Determinación de Proteínas por el método de Biuret.

María José Astorga; Daniela Soto; Dayane Rivera

Fecha: 01 mayo 2012

La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución, basados en sus propiedades fisicoquímicas. Como es el caso de las propiedades de compuestos como proteínas, que absorben cierta intensidad de luz (cromóforos) en el espectro UV- visible. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución, con lo cual, a partir de ello se realiza una curva de calibración con las absorbancias medidas por el aparato a concentraciones exactamente conocidas de un tipo en un mismo volumen. Se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

Para colocar a prueba todo lo indicado se pretende construir una curva de calibración para la determinación de proteínas plasmáticas mediante el método de biuret. Los resultados esperados son demostrar que las soluciones que tienen mayor concentración de proteínas sean las que tengan un valor de absorbancia mayor en comparación a las que su concentración estándar de proteínas es menor. La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. La absorción de las radiaciones ultravioleta.  Espectrofotómetro La determinación de proteínas se efectuara por el método de biuret. y es característica para cada sustancia química. La absorbancia que es la cantidad de luz absorbida por una solución de determinada concentración a una longitud fija. en donde el valor de la absorbancia es proporciona a la concentración de proteínas presentes en la solución. además de obtener los niveles precisos de proteínas en solución y la concentración exacta de proteínas presentes. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.Introducción Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. . además de determinar la misma en una muestra desconocida. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. se medirá en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 546 nm. visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas. en donde las proteínas y péptidos dan positiva a esta reacción.

5 ml. . Muestra de suero y estándar de proteínas totales. Agua destilada. Reactivo Biuret.Materiales Espectrofotómetro ajustado a 546 nm. Material volumétrico. Cubetas de plástico de 1.  Micro-pipetas de 100µl y de 1000µl  Tubos de ensayo. Timer o cronometro.

Tubo 5: Añadimos 20 µl de agua destilada y 30 µl de concentración estándar de proteínas. 4) Incubamos los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl suero normal. 2) Preparamos los 7 tubos de ensayo tal cual se nos indico y se resumen en la tabla 1:      Tubo 1: Tubo 2: Tubo 3: Tubo 4: Añadimos 50 µl de agua destilada. 5) Leímos la absorbancia de cada uno de los tubos a 546 nm.   Nota: Luego de realizado el paso anterior se les agrego a todos los tubos 2000 µl del reactivo de biuret. Tubo 6: Añadimos 10 µl de agua destilada y 40 µl de concentración estándar de proteínas.  Tabla 1: Tubo 1 Blanco (µl) 50 ------------------2000 Tubo 2 Normal (µl) 25 ------25 ------2000 Tubo 3 Patológico (µl) 25 ------------25 2000 Tubo 4 (µl) 30 20 ------------2000 Tubo 5 (µl) 20 30 ------------2000 Tubo 6 (µl) 10 40 ------------2000 Tubo 7 (µl) ------50 ------------2000 Agua Destilada Estándar Proteínas Suero Normal Suero patológico Reactivo Biuret 3) Mezclamos por agitación todos los tubos con sus respectivos agregados. . Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl de suero patológico. Tubo 7: Añadimos 50 µl de concentración estándar de proteínas. Añadimos 30 µl de agua destilada y 20 µl de concentración estándar proteínas.Métodos 1) Rotulamos 7 tubos de ensayo y los situamos en la gradilla.

Resultados  1).Resultados de Absorbancia y Transmitancia a 546 nm tal como se muestra en tabla 2:  Tabla 2: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 T% 29.683 0.59 mg/ml .59 (g/dl) 6 0.Absorbancia y concentración de proteínas real de tubos 4.730 0..1 20.586 0.659 0.659 0.39 mg/ml 40 x 30 = x 2050 = 0.78 (g/dl) 7 0.0 22.536 0.652 0.98 (g/dl) Tubo N° Absorbancia Concentración de proteínas (g/dl) Tubo N°4 Tubo N°5 40 x 20 = x 2050 = 0..5 Absorbancia 0. 5.586 0.8 18.9 18.6 26.652 0.733 0.39 (g/dl) 5 0.733  2).3 21. 6 y 7 como se indica en tabla 3:  Tabla 3: 4 0.

78 mg/ml  3).05 = 0. 5..Tubo N°6 Tubo N°7 40 x 40 = x 2050 40 x 50 = x 2050 = 0.116 0.197 Tubo N°4 Tubo N°5 = 0.Calcular ∆A de los tubos 4.116 Tubo N°6 Tubo N°7 = 0.123 0. 6 y 7 según se indica en tabla 4 para realización de posterior grafico.05 0. ∆absorbancia:  Tabla 4: Tubo 4 5 6 7 ─ ∆absorbancia (∆A) 0.123 = 0.197 .98 mg/ml = 0.

realice grafico (grafico 1).39 0.1 0.98 ∆A (eje y) 0.59 0.15 0.05 0. según lo indicado en Tabla 5: Concentración de proteínas (eje x) vs ∆absorbancia (eje y).197 0..78 0.59 0.98 0.123 curva de calibración ∆ Absorbancia Concentracion de Proteinas . 6 y 7.116 0. 4).De acuerdo a los resultados obtenidos de ∆A para los tubos 4.05 0.  Tabla 5: [ ] de proteínas (eje x) 0.25 0.05 0 0.123 0.116 0.2 0.78 0.39 0. 5 .197 Tubo 4 5 6 7  Grafico 1: Curva de calibración 0.

n: coeficiente de posición.  Calculo de la pendiente: Utilizando los datos extremos medidos de absorción y concentración del patrón.  Ecuación de la recta: Siendo la ecuación de la recta: Donde: y: absorbancia. m: pendiente. x: concentración.Determinación de nivel de proteínas y muestras de suero a través de la ecuación de la recta con los datos conocidos de los patrones. Tubo 4: Tubo 7: .  Calculo del coeficiente de variación: Reemplazando los datos determinados de manera experimental en la ecuación de los valores extremos.

la ecuación de la recta para la curva de calibración es:  Calculo de concentración de proteínas para la muestra suero normal: -Absorbancia del suero normal: 0.683  Calculo de concentración de proteínas para la muestra con el suero patológico: -Absorbancia del suero patológico: 0.730 .Por lo tanto.

ya que los tubos con mayor concentración de proteínas fueron los que obtuvieron valores de absorbancia mayor. que es una recta. 2.Discusión Al concluir este trabajo y obtener los resultados. . ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir? Una curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). construyéndose la curva de calibrado. La elaboración de la curva de calibración es la fase principal al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. y obtener resultados para la determinación de proteínas totales en solución.  Preguntas guía: 1. su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración. Una vez ensayadas las soluciones problemas. efectivamente la lectura de la absorbancia y la relación absorbanciaconcentración es directamente proporcional. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloradas? No se podrá construir una curva de calibración. pero si se presentan sustancias no coloreadas. lo que se traduce en lo antes ya señalado. Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A. es importante señalar que tal como se pensaba. Se emplea en trabajos cuantitativos en los cuales hay que calcular la concentración del absorbente. ya que nos permitió cuantificar de manera muy precisa. se emplean reactivos (reactivo de Biuret) que le proporcionen color a estas sustancias para que puedan ser estudiadas y así realizar la curva de calibración. Al realizar la curva de calibración nos muestra una representación ascendente en cuanto a la concentración de proteínas y la variación de absorbancia de una solución. Tal como se ha realizado con anterioridad en nuestro trabajo y en trabajos anteriores se ocupo en particular el “reactivo de biuret” a pesar de la existencia de otros para los mismos fines.

Es responsable principalmente por la presión coloidoosmótica del plasma.3. las lleva por la circulación a sus órganos efectores.) se forma predominantemente en el hígado. existe una comparación colorimétrica con la muestra tratada. 4. Al unirse con las hormonas. Presenta un máximo de absorción a 540 nm. medicamentos. siendo este tubo una base (solución tipo) de absorbancia que presenta esta técnica. ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante? La Albúmina. etc. vitaminas. En fin. ¿Cuál es el fundamento del reactivo de Biuret? Por el método de Biuret se puede determinar la presencia de proteínas totales en una mezcla. en otros tejidos. 5. si bien en menor cantidad. Las soluciones deben prepararse simultáneamente. bilirrubina. pero también. . ¿Cuál es objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas? El fin de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas se debe a comparaciones que se logran realizar. es la proteína más abundante en el plasma (50% aprox. Otra de sus funciones consiste en el transporte de sustancias. Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos. con aparición de una coloración azulada (cambia a violeta luego en presencia de proteínas. Sus valores normales oscilan entre 3. La intensidad de este color se mide en el espectrofotómetro y es proporcional a la cantidad de proteínas presentes.. y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta). llegando a establecer por una diferencia el valor real de la absorbancia de la muestra y poder realizar los cálculos pertinentes a exponer.5 y 5 g/100 ml.

quimicaviva.ar/qo3/Apuntes/Biuret.ucn. es por eso que se prefiere.fcen.htm http://www.pdf http://adolfoneda.wanadoo.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/steinera/part e02/07b.unne.Conclusión El método ocupado en esta oportunidad es tan efectivo como preciso para la determinación de proteínas en solución.edu.pdf http://mazinger. lo cual podría modificar los resultados.pdf http://www.sisib. en cuanto a que la absorbancia es proporcional a la concentración de proteínas en una muestra.htm .htm http://perso.uco. y además mediante este método obtuvimos valores exactos de la contracción de proteínas real en cada tubo.uba. Referencias y Bibliografía http://catedras.pdf http://www. este nos permitió obtener lo que se pensaba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.cl/FacultadesInstitutos/laboratorio/colorT3.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE %20PROTE%C3%8DNAS.edu. no siendo difícil manipular los materiales y trabajar con el espectrofotómetro para obtener dichos resultados. Que si pensamos en ocuparlos para fines de mayor índole como puede ser en el área de salud es primordial evitar los posibles errores que mas que nada podrían ser de manipulación.panreac.es/sergioram1/espectrofotometria.com/proteinas-plasmaticas/ http://www3.quimica.qb.uchile.ar/catedras/bioquimica/pdf/proteinas. y además muestra pocas interferencias.med.unlp.htm http://www.es/spanish/practicas/p29.

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