VI IBEROLAB

GUIA PARA LA VERIFICACION DE ESPECTOFOTOMETROS UV-VISIBLE UTILIZADOS EN EL ANALISIS

DE SUELO Y AGUA.

Azcarate M.P.(1); Kloster N.S. (2) ; Ostinelli M. (3); Carreira D. (3)

1
Laboratorio de Análisis Agronómicos. E.E.A. Chubut. INTA. Ex Ruta 25 Km 1480. (9100) Trelew. Chubut. Argentina. E-
Mail: mpazcarate@yahoo.com.ar
2
Laboratorio de Suelo y Agua. E.E.A. Anguil, INTA. RN Nº5 km 580. (6326) Anguil. La Pampa. Argentina. E-Mail:
nkloster@anguil.inta.gov.ar
3
Laboratorio de Suelos. Instituto de Suelos. INTA Castelar. Las Cabañas y De Los Reseros s/n (1712) Villa Udaondo.
Castelar. Buenos Aires. Argentina. E-Mail: mostinelli@cnia.inta.gov.ar; dcarreira@cnia.inta.gov.ar.

ÁREA TEMÁTICA. (Marque una opción) REQUISITOS TÉCNICOS

RESUMEN.
La espectrofotometría es una técnica ampliamente utilizada
en los laboratorios para el análisis cuantitativo de
numerosos compuestos, debido principalmente a su
sencillez operativa y a la rapidez en el análisis. La
concentración de una sustancia puede ser calculada a partir
de la cantidad de luz absorbida por una muestra, en el
rango del espectro del ultravioleta (UV) y visible (Vis)
aplicando la ley de Lambert-Beer. Por ello, para generar
datos confiables es de gran importancia la verificación
previa del funcionamiento del espectrofotómetro. Los
principales parámetros a controlar en estos equipos son: la
exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisión
fotométrica, la linealidad fotométrica y la verificación de la
luz difusa o parásita.
PALABRAS CLAVE. Espectrofotómetro. UV-Vis.
Verificación. Suelo. Agua
3. Campo de aplicación
Espectrofotómetros UV-Vis utilizados para el análisis de
muestras de suelo y agua para uso agropecuario.
4. Fundamentos
4.1. Equipamiento
La mayoría de los instrumentos espectroscópicos, como el
espectrofotómetro, están constituidos por cinco
componentes: lámpara o fuente luminosa, selector de
longitud de onda , celda para alojar la muestra, detector
de radiación, y amplificador de señal con medidor o
registrador.
4.2. Teoría

Desde hace muchos años se han utilizado las propiedades

1. Introducción
En el análisis de muestras de suelo y agua, el
espectrofotómetro constituye una herramienta fundamental
para la cuantificación de nutrientes y contaminantes. Del
correcto desempeño de este instrumento dependerá en gran
medida la calidad de los resultados obtenidos, por lo que se
considera un equipo crítico en los ensayos de laboratorio y
que necesariamente deberá ser verificado periódicamente.
2. Objetivos
de la luz y su interacción con las sustancias para
identificarlas y determinar la concentración de las mismas.
Estos estudios se basan en la estrecha relación que existe
entre la absorción de la radiación electromagnética de las
sustancias, tanto en la zona del espectro visible como en el
ultravioleta e infrarrojo, y su concentración.
Si un haz de luz monocromático paralelo (I0) atraviesa
una cubeta de b cm de paso óptico, conteniendo una
solución con una concentración (c) de una especie
absorbente. A causa de la interacción de la luz y de las
partículas absorbentes la intensidad del haz se atenúa de I0
a I.
La transmitancia (T) de la solución es entonces la fracción
de la radiación incidente transmitida por la solución:

El objetivo de ésta guía es proporcionar información útil T = I / I0 (1)

para verificar el correcto funcionamiento de los
espectrofotómetros UV-Vis del laboratorio. También puede expresarse en forma porcentual:

T (%) = I / I0 x 100 (2)

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A fin de obtener ecuaciones de ajuste lineal se utiliza su
transformada logarítmica conocida como absorbancia (A)
de una solución y definida por la ecuación
A = - log T = log I0/I (3)
La absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor es la
atenuación del haz de luz, ocurriendo lo inverso en la
transmitancia. La absorbancia es directamente proporcional
a la longitud b de la trayectoria a través de la solución, y a
la concentración c de la especie absorbente. Estas relaciones
se expresan en la ley de Lambert-Beer como:
A = εbc (4)
ε = absortividad molar expresada en L mol cm -1 -1
b = distancia recorrida a través de la solución (paso óptico)
expresada en cm
c = concentración de la solución expresada en mol L-1,
5. Desarrollo
El Responsable del Sistema de Gestión de Calidad del
Laboratorio (SGC) deberá definir el programa de
verificación del equipamiento del laboratorio, en el cual
incluirá las actividades a realizar, sus responsables y la
periodicidad de los controles. Esta última se define en
función de las condiciones de uso y el registro acumulado
de funcionamiento de los equipos.
Las principales pruebas recomendadas en la bibliografía
consultada, para verificar el correcto funcionamiento de un
espectrofotómetro incluyen: la exactitud de la longitud de
onda, la exactitud y precisión fotométrica, la linealidad
fotométrica y la verificación de la luz difusa o parásita.
5.1. Soluciones de calibración
Se encuentran disponibles en el mercado, materiales de
referencia certificados de estas soluciones, aunque las
mismas se pueden preparar en el laboratorio a partir de
reactivos de alta pureza y cuyas propiedades físicas y
químicas sean conocidas. Para materiales sin evidencia
formal de la trazabilidad (y su incertidumbre) es
responsabilidad de los laboratorios demostrar que los
mismos son aptos para el fin previsto.
5.1.1. Solución de óxido de holmio en ácido perclórico.
Disolver en un vaso de precipitados 4,0 g de óxido de
holmio (III) en 96,0 g de ácido perclórico al 10% (v/v).
Calentar y agitar para facilitar su disolución y luego dejar en
reposo por 24 hs, a temperatura ambiente.
5.1.2. Solución de sulfato de cobre en ácido sulfúrico.
Disolver en un vaso de precipitados 20,0 g de sulfato de
cobre pentahidratado, de una pureza mayor al 99,9%, en
2
suficiente agua destilada. Adicionar, con cuidado, 10 ml
de ácido sulfúrico (d = 1,84 g cm-3), y trasvasar
cuantitativamente la solución a un matraz aforado de 1
litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar.
5.1.3. Solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1
Pesar en un vaso de precipitados 0,49 g de ácido sulfúrico
(d = 1,84 g cm-3), diluir con agua destilada y trasvasar
cuantitativamente a un matraz de 1 litro. Enrasar con agua
destilada y homogeneizar.
5.1.4 Soluciones de Dicromato de potasio
a) Solución de concentración 0,10 g L-1
Secar aproximadamente 1 g de dicromato de potasio, de
una pureza mínima de 99,95%, en estufa a 105 ºC por 2
horas y enfriar en desecador. Pesar 0,10 g y disolver en un
vaso de precipitados con la solución de ácido sulfúrico
0,005 mol L-1. Trasvasar cuantitativamente a un matraz de
un litro, enrasar con la solución de ácido sulfúrico 0,005
mol L-1 y homogeneizar.
b) Serie de soluciones de Dicromato de potasio
Preparar cuatro soluciones de dicromato de potasio de
diferente concentración, requeridas para los controles, a
partir de la solución de 0,10g L-1, tal como se indica en la
tabla 1, enrasando a un volumen final de 100 ml con ácido
sulfúrico 0,005 mol L-1.
Tabla 1. Serie de soluciones de dicromato de potasio.
Concentración ml de solución
(g L-1) de concentración 0,10 g L-1
0,02 20
0,04 40
0,06 60
0,08 80
5.1.5. Solución de Nitrito de sodio
Secar aproximadamente 70 g de nitrito de sodio en estufa
a 105ºC por 2 horas y enfriar en desecador. Pesar 50 g,
disolver en un vaso de precipitados con agua destilada y
trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro.
Enrasar con agua destilada y homogeneizar.
5.2. Parámetros
5.2.1 Control de la exactitud de la longitud de onda
La desviación de la longitud de onda puede causar errores
en los resultados cuantitativos de la lectura en el UV-Vis.
En este control se verifica el grado de concordancia entre
la longitud de onda seleccionada para la máxima
absorbancia y la longitud de onda de referencia.
Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del instrumento
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con la solución de ácido perclórico al 10%. valores y confrontándolos con los valores de
Se recomienda medir según el rango espectral una longitud referencia.
de onda para el espectro UV y tres longitudes de onda para
el espectro Vis.
Dependiendo del ancho de banda del equipo, la máxima 5.2.3. Control de la precisión fotométrica
absorción de la solución de óxido de holmio en ácido
perclórico se detectará a las longitudes de onda indicadas en Se denomina precisión fotométrica a la medida de la
la tabla 2. dispersión de una serie de mediciones de absorbancia
alrededor de la media, y se expresa como coeficiente de
Tabla 2. Longitudes de onda (λ) de máxima absorción de la variación porcentual. Para la determinación, utilizar los
solución de óxido de Holmio en ácido perclórico. datos obtenidos en la prueba de exactitud fotométrica
(5.2.2), con la solución de dicromato de potasio de 0,06 g
L-1 a las siguientes longitudes de onda: 235, 257, 313, 350
λ de máxima absorción
Ancho
de nm.
banda (nm)
(nm)
Rango UV 5.2.4. Control de la linealidad fotométrica
1 241,1 249,9 278,1 287,2 333,5 345,4 361,3
2 241,0 250,1 278,1 287,6 333,5 345,5 361,1 El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer
Rango Vis el rango de absorbancia en el que el instrumento tiene
1 385,6 416,3 451,4 467,8 485,2 536,6 640,5 respuesta proporcional a los cambios de concentración.
2 386,0 416,9 451,3 468,1 485,2 537,2 641,1
Para ello se determina la respuesta del espectrofotómetro
a diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla
5.2.2. Control de la exactitud fotométrica con la ley de Lambert-Beer.
Se evalúa la linealidad fotométrica realizando lecturas de
La exactitud fotométrica se determina comparando la absorbancia de la serie de soluciones de dicromato de
absorbancia de una solución de referencia (Tabla 3) con la potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1), utilizando la
lectura de ésta, obtenida en el espectrofotómetro. Para solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 para realizar el
cubrir satisfactoriamente el rango UV-Vis del espectro, se ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las longitudes de
utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de potasio, onda a que se realizan las lecturas serán: 235, 257, 313 y
para el espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro Vis. 350 nm.
Tabla 3. Absorbancias de referencia de las soluciones en el 5.2.5. Control de Luz difusa o parásita
rango UV-Vis
Se denomina así a toda radiación electromagnética de
Longitud de Absorbancia de
onda (nm) Referencia
longitud de onda distinta a la seleccionada por el
235 0,748 monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto
Rango UV
Solución de 257 0,865
queda registrada por el instrumento. Este control se basa
dicromato de potasio 313 0,292
en la medida del porcentaje de transmitancia de una
en ácido sulfúrico 350 0,640 solución de nitrito de sodio 50 g L-1. Esta sustancia tiene
Rango Vis 600 0,068 la propiedad de que sus soluciones absorben toda la
Solución de sulfato 650 0,224 radiación incidente de longitudes de onda menores a los
de cobre en ácido 700 0,527 390 nm, es decir, que es ópticamente opaca a la luz. Por lo
sulfúrico 750 0,817
tanto, la transmitancia a 340 nm de esta solución debe ser
igual a cero, y toda transmitancia detectada corresponde a
Con una misma cubeta ajustar el 0 de absorbancia del luz parásita.
instrumento con la solución de ácido sulfúrico de El ajuste del equipo a 0 de transmitancia se realiza con
concentración 0,005 mol L-1, utilizada para preparar las aire, luego se mide la transmitancia de la solución de
soluciones de referencia. nitrito de sodio a una longitud de onda de 340 nm.
•
Realizar las lecturas por triplicado.
Control en el rango UV:
Realizar 6 lecturas consecutivas de la solución de
dicromato de potasio en ácido sulfúrico de 6. Resultados
concentración 0,06 g L-1 a las longitudes de onda de
235, 257, 313 y 350 nm, registrando los valores y En la tabla 4 se muestran los cálculos y los resultados
•
confrontándolos con los valores de referencia. aceptables en la verificación del funcionamiento del
Control en el rango Vis: espectrofotómetro. Estos valores de aceptabilidad de los
Realizar 6 lecturas consecutivas de la solución de parámetros, fueron tomados de bibliografía relacionada
sulfato de cobre en ácido sulfúrico a las longitudes de con la industria farmacéutica y de lineamientos de la
onda de 600, 650, 700 y 750 nm, registrando los farmacopea de diferentes países.

3
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Duymovich, C., Acheme, R; Sesini, S; Mazziotta, D. (2005)

Espectrofotómetros y fotocolorímetros: Guía práctica de actualización.
Tabla 4. Cálculos y evaluación de resultados de verificación Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 39: 529-539
de espectrofotómetros. Herington ERG (1977) Recommendes Reference Materials for the
realisation of physicochemical properties. Absorbance and
Parámetros Cálculos Resultados wavelength. Pure and Applied Chemistry Vol. 49, 661-674.
Herman, L. (2004) Performance verification of UV-Vis
E = λm- λref
Exactitud de Aceptable:
la longitud UV ± 1 nm spectrophotometers. Analytical method validation and instrument
de onda Vis ± 3 nm performance verification. (Ed.) C.C. Chan, H Lam, Y.C. Lee,
X.M.Zang. John Wiley&Sons, Inc., Hoboken, New Jersey,
Exactitud %Error = Am – Aref 100 Error entre ± 2% Optima USA.Capítulo 10,153-172.
fotométrica Aref Error entre ± 3% Aceptable IRAM 301/ISO 17025 (2005) Requisitos generales para la competencia
Precisión CV% = SD .100 CV%<0,5% optima de los laboratorios de ensayo y calibración.
fotométrica x CV%< 1% aceptable Manual de Uso Metrolab 330. Espectrofotómetro 330-1000 nm. Marca
Graficar Am vs Aref. Metrolab.
Calcular con una Manual de Uso Metrolab Plus 1600. Espectrofotómetro 330-1000 nm.
Linealidad r ≥0,999 Aceptable Marca Metrolab.
regresión lineal el
fotométrica Mavrodineanu R, Baldwin JR (1980) Metal-on-quartz filters as a
coeficiente de regresión
(r). standard reference material for spectrophotometry SRM 2031., NBS
Special Publication 260–68 , NIST, Gaithersburg, MD, USA.
Luz difusa o
T<0,01 ó A >2 Varcoe J.S. (2001) Clinical biochemistry: techniques and
parásita
instrumentation. A Practical Course. (Ed) Word Scientific Publishing
E = exactitud; m= longitud de onda medida; ref = longitud de onda de Co.Pte. Ltd. Capítulo 1, 1-63.
referencia; Am = Absorbancia medida; Aref = Absorbancia de referencia;
CV% = coeficiente de varianza; SD = desvío estándar; x = media de los
datos; T = tramitancia; A = absorbancia.

7. Conclusiones

En la bibliografía consultada, la mayoría de las

verificaciones se realizan en el rango del espectro UV (200 -
400 nm), ésto se debe a que la información disponible está
orientada a la verificación de espectrofotómetros destinados
al análisis de muestras farmacéuticas y bioquímicas.
También esto influye sobre los valores de aceptabilidad de
los resultados obtenidos para los equipos. La región del
espectro utilizada en la mayoría de los análisis químicos de
muestras de suelo y agua para uso agropecuario, es la región
del Vis (400 - 800 nm), por lo que es necesario proponer
soluciones de referencia, que puedan preparse en el
laboratorio, y demostrar, además, que las mismas pueden
ser utilizadas para evaluar en éste rango del espectro.
Asimismo debería evaluarse la posibilidad de modificar los
rangos de aceptabilidad de los parámetros propuestos. Esto
se debe a que, al tratarse de muestras para uso agropecuario,
tal vez pueda permitirse una mayor flexibilidad en los
valores aceptados para los espectrofotómetros utilizados en
ésta disciplina.

BIBLIOGRAFIA
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Procedures. International Accreditation New Zealand (IANZ).
http://www.ianz.govt.nz/publications2/pdfs/ASTG4_UV-
VIS_Spectro.pdf
Blázquez, J. (2005) Calibración de espectrofotómetros para la medida
directa de absorbancias. III Congreso Virtual Iberoamericano. Gestión de
Calidad en Laboratorios.
http://www.iberolab.org/opencms/opencms/congreso/IberolabIII2005/ind
ex.html
Burke, R.W. y Mavrodineanu, R. (1977) Certification and use of acidic
potassium dichromate solutions as an ultraviolet absorbance standard—
SRM 935. NBS Special Publication 260–54, NIST, Gaithersburg, MD,
USA.
Clare J.L. (2005) Calibration of UV-vis spectrophotometers for chemical
analysis. Accreditation and Quality Assurance 10: 283-288.