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QUÍMICA ANALÍTICA EXPERIMENTAL

II
LW1. Métodos espectrofotométricos moleculares
(UV‑Vis y fluorescencia)

30 de septiembre de 2021
Objetivos de estos trabajos de laboratorio

Para la consecución de los objetivos planteados para esta asignatura, en estos trabajos de laboratorio se
persiguen los siguientes objetivos parciales:

・ Iniciarse en la metodología de calibración de los métodos instrumentales de

análisis utilizando el método de Calibración Externa.

・ Experimentar con procedimientos analíticos basados en medidas

espectrofotométricas.

・ Comprender la metodología de los procedimientos analíticos de base instrumental.

・ Iniciarse en las tareas de reporting (cuaderno de laboratorio e informe corto o largo).

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1 LW1a: ESPECTROFOTOMÉTRICO
DETERMINACIÓN DE HIERRO TOTAL EN
VINO BLANCO

1.1 Antecedentes teóricos

1.1.1 Espectrofotometría

Las mediciones espectrofotométricas se basan en la determinación de la cantidad de energía que, a

una longitud de onda dada en el espectro ultravioleta visible, una sustancia disuelta absorbe de la
energía total emitida por una fuente de radiación externa. Estas medidas se toman con un
espectrofotómetro, cuyas partes básicas son las siguientes:
・ En primer lugar, la fuente de luz. Normalmente se trata de un filamento de wolframio cuyo haz emitido se
dirige a través de un filtro monocromático para poder trabajar en una longitud de onda seleccionada del
espectro UV‑Vis.

・ El haz de luz monocromo se cruza en una celda donde se coloca la solución que contiene el
analito a determinar. Este haz de luz recorre una longitud fija y conocida (que también se
denomina "camino óptico") y se absorbe parcialmente y el resto se transmite.
・ La parte transmitida llega al detector y produce una señal eléctrica que se amplifica y se
convierte a forma digital. Dependiendo de la electrónica del espectrofotómetro, el usuario
puede obtener esta información como% T (porcentaje de luz transmitida) o Absorbancia
(cantidad de luz absorbida) de la muestra.

Figura 1: Esquema de un modelo espectrofotómetro.

La absorbancia (A) se correlaciona linealmente con la concentración de analito en la solución (c) mediante la ley
de Beer‑Lambert:

Aλ = miantes de Cristo

donde unλ = Absorbancia a una determinada longitud de onda; mi = absortividad molar; b = camino óptico (cm); c
= concentración molar

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1.1.2 Determinación espectrofotométrica de Fe en vino blanco

En este trabajo de laboratorio, se determinará la cantidad total de hierro en un vino blanco. El

vino blanco se elabora con uvas blancas o tintas (en estas últimas se elimina inmediatamente la
piel para evitar la coloración del vino). Durante este proceso, la acidez y los compuestos
presentes en el vino varían según el tipo de uva, las características del proceso y el material
utilizado. El hierro presente en el vino debe deberse al contenido original de hierro de la uva y al
material metálico utilizado durante el proceso. El hierro total presente en el vino se puede
determinar mediante medidas espectrofotométricas basadas en la reacción química entre Fe (II)
y 1,10-fenantrolina según la siguiente reacción:

Es obligatorio que todas las especies de hierro presentes en las muestras estén en forma de Fe (II) para determinar
la cantidad total de hierro, por lo que es necesario reducir el posible contenido de Fe (III) a Fe (II). Esto se puede
hacer utilizando clorhidrato de hidroxilamina como agente reductor, de acuerdo con la siguiente reacción química:

4 Fe3+ + 2 NUEVA HAMPSHIRE2OH ⇐⇒ 4 Fe2+ + norte2O + 4 H+ + H2O

La reacción para la formación del complejo necesita un pH en el intervalo 2-9, en otras palabras, lo
suficientemente ancho para hacer frente a la cantidad de ácido liberado en la última reacción. El complejo
formado, formado por Fe (II) y 1,10-fenantrolina tiene un color rojo, y su máxima absorbancia se observa a
una longitud de onda que debe ser estudiada experimentalmente en este trabajo. En esa longitud de onda,
la intensidad del color medida sigue la ley de Beer‑Lambert, que se puede resolver para la concentración de
Fe (II) de acuerdo con:

, =

El valor de la trayectoria óptica (b) es 1 cm y la absortividad molar (mi) se calcula experimentalmente

en el proceso de calibración. Este valor es la pendiente de la curva de calibración, que debe
construirse antes de medir la concentración de Fe en la muestra de vino blanco.

1.2 Procedimiento operativo

1.2.1 Reactivos y soluciones (para cada pareja)

・ Prepare el volumen necesario de solución madre de hierro, aprox. 2 10−4 M, a partir de sulfato de hierro
amoniacal hexahidratado (PM 392,14 g / mol) pesando la cantidad adecuada de este reactivo. Esta solución
de Fe (II) se utilizará para preparar las soluciones estándar para la calibración del método.
Calcule la concentración molar exacta de Fe (II) en esta solución.
・ Prepare el volumen necesario de aprox. 2 10−3 Solución M de 1,10-fenantrolina (MW
198,23 g / mol). Antes de agregar agua, disuelva 1,10-fenantrolina en 5 ml de metanol.
・ Prepare el volumen necesario de aprox. Solución al 10% p / v de clorhidrato de hidroxilamina (PM
69,49 g / mol).
・ Prepare el volumen necesario de aprox. Solución 0,1 M de acetato de sodio.

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1.2.2 Experimentos preliminares

Para investigar la longitud de onda en la que se observa la máxima absorbancia para el complejo Fe
(II) / 1,10-fenantrolina (λmax) y para probar su cinética de formación, es interesante realizar un pequeño
experimento en el que se miden los espectros de este complejo a intervalos de tiempo fijos.

Para ello, prepare 50 ml de una solución que contenga 10 ml de la solución madre de trabajo de Fe (II), junto
con 2 ml de solución de clorhidrato de hidroxilamina, 10 ml de solución de acetato de sodio y 5 ml de 1,10-
fenantrolina. solución. Finalmente, agregue agua hasta la marca. ComoTan pronto como haya preparado
esto, colóquelo en el soporte de muestra del espectrofotómetro de diodo y comience a registrar los
espectros a intervalos de tiempo de 1 minuto durante al menos 15 minutos.1. El examen de esta colección
de espectros debería darle una pista sobre ambosλmax y el tiempo necesario para la formación del complejo
de hierro absorbente.

1.2.3 Preparación de la muestra

Cada pareja de estudiantes medirá una muestra de vino, lo que se hará por triplicado con el fin de tener suficiente
información para aplicar procedimientos estadísticos más avanzados para verificar la cantidad total de hierro en
las muestras de vino.

Según el tipo de muestra (vino), puede ser aconsejable filtrarla antes de continuar.

1.2.4 Calibración del método analítico y medición de muestras desconocidas

・ Preparación de las soluciones estándar

Para obtener la curva de calibración, primero limpiar seis Matraces aforados de 50 mL. El volumen de
la solución madre de trabajo de Fe (II) necesario para preparar un conjunto de soluciones de
calibración (que consta de 5 niveles de concentración y el blanco) que cubre adecuadamente el rango
de concentración de Fe esperado en la muestra de vino debe calcularse previamente. Luego, agregue
2 mL de solución de clorhidrato de hidroxilamina, 10 mL de solución de acetato de sodio y 5 mL de
solución de 1,10-fenantrolina a cada uno de los 6 matraces y llénelos con agua destilada hasta la
marca. Revuelva para homogeneizar la solución y espere 10 minutos antes de medir.

・ Construcción de la curva de calibración

Una vez que el espectrofotómetro esté encendido (déjelo calentar al menos 15 minutos) y ajuste λMax nm de
longitud de onda, llene la celda espectrofotométrica con agua destilada y ajuste el instrumento a
absorbancia cero. Esto debe hacerse siempre con la misma celda utilizada para la calibración y para la
medición de las muestras desconocidas. Transfiera la porción de cada solución de calibración a la celda.
Vierta el contenido de la celda y vuelva a llenarla con la misma solución. Seque las paredes de la celda e
insértela en el espectrofotómetro para tomar la medida de absorbancia enλMax
Nuevo Méjico.

Cada medición debe realizarse por triplicado. Una vez que se han medido las 6 soluciones de
calibración, 6x3 pares de datos (Aλmax , [Fe (II)]) estará disponible. Con estos datos, la calibración
La curva (o línea de regresión) se puede calcular de acuerdo con los criterios explicados en la clase.
Cuando se completan los cálculos, y una vez que se tiene claro que no es necesario repetir ninguna de
las mediciones, se concluye el proceso de calibración del método analítico.

・ Medida de la muestra de vino

Tomar 25 mL de muestra de vino y agregarlo a un matraz aforado de 50 mL. Luego, agregue 2 mL de

1 1Sus instructores le darán indicaciones para que disponga adecuadamente el instrumento para
estas medidas.

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 solución de clorhidrato de hidroxilamina, 10 mL de solución de acetato de sodio y 5 mL de
solución de 1,10-fenantrolina en cada matraz y llenar con agua destilada hasta la marca.
Revuelva para homogeneizar la solución y espere 10 minutos antes de medir. Enjuague la celda
espectrofotométrica, vacíela y vuelva a llenarla con la solución de muestra. Mida la absorbancia
enλMax nm por triplicado. Con esta información, calcule la cantidad total de hierro en el vino y su
incertidumbre utilizando la información de calibración.

・ Trabajo adicional

En caso de que el trabajo de laboratorio se haya completado satisfactoriamente, se puede considerar

la preparación de ciertas soluciones estándar adicionales para completar los requisitos de calidad del
procedimiento analítico. Una de estas soluciones adicionales es la preparación de 3 muestras en
blanco para estimar el límite de detección. Otro conjunto de soluciones adicionales sería preparar
patrones basados en la adición de 1, 5 y 9 ml de la solución madre de trabajo de Fe (II) y
considerarlos como un conjunto externo de soluciones para estimar la exactitud y precisión de la
curva de calibración. Los profesores dan detalles sobre estas dos tareas.

1.3 Resultados e informes

En términos generales, hay ciertas tareas que se deben realizar y habilidades que se deben enseñar antes de
ingresar al laboratorio. Estos incluyen cálculos para la preparación de soluciones estándar, el cálculo de las
recuperaciones y cómo se obtienen los resultados finales de las mediciones experimentales. En el
transcurso del trabajo experimental, es bastante difícil combinar de manera eficiente estas habilidades
requeridas y todas las tareas del trabajo de laboratorio. Esta circunstancia será analizada de cerca por los
profesores encargados de los trabajos de laboratorio.
En primer lugar, el cuaderno de laboratorio es donde se debe completar el esquema del trabajo antes de
ingresar al laboratorio, donde se deben anotar todos los datos experimentales y observaciones, así como los
resultados intermedios y finales. Este cuaderno también será evaluado.
Según los datos recopilados, sus informes deben contener información sobre los siguientes temas (si
corresponde):

・ Calibración

螈 ٦H Rango de calibración (la línea de regresión más confiable)

螈 ٦H Cálculo de la incertidumbre de la concentración obtenida por la línea de regresión

・ Análisis

螈 ٦H Resultados finales (media y desviación estándar, teniendo en cuenta todo el procedimiento)

螈 ٦H 螈 ٦ 卐 ٨CLa concentración final del analito al 95% de confianza.

螈 ٦H Comparación de resultados (entre parejas y / o valor real)

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2 LW1b: DETERMINACIÓN FLUOROMÉTRICA DE
AGUA INTÓNICA QUININA

2.1 Antecedentes teóricos

2.1.1 Espectrofotometría de fluorescencia

La luminiscencia implica la emisión de fotones de átomos o moléculas excitados. La fluorescencia y la

fosforescencia, ambos procesos luminiscentes, implican la emisión de fotones de sistemas que han
sido excitados por la absorción de fotones. En la espectroscopia de fluorescencia molecular, la
molécula del analito absorbe primero un fotón (excitación,∆miexcitar) que deja al analito en un estado
de excitación electrónica y vibratoria.
En este punto, la molécula pierde rápidamente el exceso de energía vibratoria al relajarse de manera no radiativa al nivel
vibratorio básico del estado electrónico excitado. Esto ocurre porque la energía se transfiere a las moléculas de
disolvente a medida que el analitochoca contra ellos. Este proceso de relajación es muy eficaz y muy rápido. Finalmente,
la molécula puede emitir fluorescencia (∆mirelajarse). Este proceso se representa esquemáticamente en la Figura 2.1.

La intensidad fluorescente es proporcional a la potencia radiante absorbida por la muestra y teniendo en cuenta la
Ley de Beer‑Lambert, que establece que la intensidad absorbida es proporcional a la concentración de la muestra.

se podría concluir que la intensidad fluorescente es proporcional a la concentración del

analito:

dónde: IF = intensidad fluorescente k = constante y C = concentración molar.

Figura 1: El proceso de fluorescencia.

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Los métodos fluorométricos son muy sensibles y selectivos. Debido a la alta sensibilidad del
enfoque, es importante trabajar con cuidado y con cristalería limpia para evitar la
contaminación.

La quinina (ver Figura 2.2), originalmente derivada de la corteza del árbol de Cinchona, es una cura eficaz para la
malaria. Tradicionalmente, por su sabor amargo, la quinina se mezclaba con ginebra, dando lugar al cóctel Gin
and Tonic. La quinina se utiliza como agente aromatizante en el agua tónica, el limón amargo y el vermú. Su
concentración está limitada por la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. A 83 mg / L; con la mayoría de
las preparaciones comerciales a un nivel de 25 a 60 mg / L. En este trabajo de laboratorio se medirá la cantidad
presente en un producto comercial.

Figura 2: Estructura molecular de la quinina.

2.1.2 Determinación fluorométrica de quinina en agua tónica

En este trabajo de laboratorio, se determinará la cantidad de quinina en el agua tónica. El análisis de

quinina en agua tónica se simplifica aprovechando la alta sensibilidad y selectividad del método utilizado.
La quinina es un fluorescente muy eficaz, con una longitud de onda de excitación de 350 nm.1. La emisión
ocurre a 450 nm. A lo largo de este trabajo de laboratorio, es importante recordar configurar el
espectrofluorómetro en la escala de sensibilidad 'Baja' para obtener un rango de calibración adecuado.2. La
matriz de agua tónica puede considerarse relativamente compleja, pero cualquier efecto de matriz se
elimina esencialmente mediante la dilución del agua tónica en una solución acuosa ácida. Esto se puede
hacer porque, incluso después de una dilución significativa, la quinina permanece en una concentración
detectable. La selectividad del enfoque también significa que otros componentes en el agua tónica no
generan una señal y, por lo tanto, no se detectan.

2.2 Procedimiento operativo

2.2.1 Reactivos y soluciones (para cada pareja)

・ Prepare el volumen necesario de aprox. 0,5 MH2ASI QUE4 solución para cada grupo.
・ Preparar el volumen necesario de solución madre de quinina a una concentración de 100 mg / L en 0,5
MH2ASI QUE4. Es importante registrar la concentración real de esta solución madre en el cuaderno de
laboratorio. Esta solución de quinina se utilizará para preparar las soluciones de calibración estándar
para la calibración del método. Calcule la concentración molar exacta de la quinina en su solución. La
quinina está en forma de sulfato deshidratado 2C20H24norte2O2.H2ASI QUE4.2H2O (MW
782,96 g / mol)

También se pueden utilizar 1250 nm.

2Configurarlo en 'Alto' (el estado predeterminado del instrumento) forzará el uso de al menos una dilución de 5 veces de los estándares
de calibración para evitar la saturación de la señal instrumental.

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2.2.2 Preparación de agua tónica

・ Cada pareja de estudiantes debe medir una muestra de agua tónica por triplicado a fin de obtener suficiente
información para aplicar procedimientos estadísticos más avanzados para verificar la cantidad total de quinina en
el agua tónica.

・ Limpiar y enjuagar cuidadosamente un matraz aforado de 25 mL.

・ Pipetee 0.25 mL de agua tónica desgasificada3 en el matraz aforado de 25 mL y diluir con

0,5 MH2ASI QUE4. Prepare tres muestras para analizar la precisión.

2.2.3 Calibración del método analítico y mediciones de muestras desconocidas

・ Preparación de las soluciones estándar

Para obtener la curva de calibración, primero limpie seis matraces aforados de 25 mL. Prepare seis
estándares de aprox. 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 mg / L diluyendo la solución estándar madre. Comience
con el estándar de concentración más bajo. Utilice la micropipeta adecuada para introducir el
volumen calculado adecuado de la solución madre en el matraz aforado y diluya a 25,0 ml con 0,5 MH.
2ASI QUE4.

Calcule las concentraciones reales de estos estándares y registre los valores en el cuaderno de
laboratorio.
・ Construcción de la curva de calibración
Una vez que el espectrofotómetro esté encendido (déjelo calentar al menos 15 minutos) y ajustado a
la excitación (250 o 350 nm) y la longitud de onda de emisión (450 nm), llene la celda
fluorofotométrica con agua destilada y ajuste el instrumento a cero absorbancia. Esto debería ser
siempreSe realiza con la misma celda utilizada para la calibración y para la medición de las muestras
desconocidas. Transfiera una porción de cada solución de calibración a la celda. Vierta el contenido
de la celda y vuelva a llenarla con la misma solución. Seque las paredes de la celda e insértela en el
espectrofluorómetro para tomar la medida de absorbancia a 450 nm. Cada medición debe tomarse
por triplicado.
Una vez que se hayan medido las 6 soluciones de calibración, estarán disponibles 6x3 pares
de datos (emisión, [quinina]). Con estos datos se puede calcular la curva de calibración (o
línea de regresión) según los criterios explicados en clase. Cuando se completan los
cálculos y una vez que está claro que no es necesario repetir ninguna de las mediciones, se
concluye el proceso de calibración del método analítico.
・ Medida de la muestra de agua tónica
Enjuague la celda fluorofotométrica, vacíela y vuelva a llenarla con la solución de muestra. Mida
la absorbancia a 450 nm por triplicado. Con esta información, calcule la cantidad total de
quinina en el agua tónica y su incertidumbre utilizando la información de calibración.
・ Trabajo adicional

En caso de que el trabajo de laboratorio se haya completado satisfactoriamente, se puede considerar

la preparación de ciertas soluciones estándar adicionales para completar los requisitos de calidad del
procedimiento analítico. Una de estas soluciones adicionales es la preparación de 3 muestras en
blanco para estimar el límite de detección. Otro conjunto de soluciones extra sería preparar patrones
de 0,1, 0,5 y 0,9 mg / L siguiendo el procedimiento antes mencionado, y considerarlos como un
conjunto externo de soluciones para estimar la exactitud y precisión de la curva de calibración. Los
detalles de estas dos tareas son dados por los profesores.

3Este proceso se puede realizar en el baño de ultrasonidos, pero debes tener mucho cuidado. Es aconsejable
abrir la botella con anticipación y transferir el contenido de un vaso a otro para eliminar gran parte del gas
antes de usar el baño ultrasónico.

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2.3 Resultados e informes

En términos generales, hay ciertas tareas que se deben realizar y habilidades que se deben enseñar antes de
ingresar al laboratorio. Estos incluyen cálculos para la preparación de soluciones estándar, el cálculo de las
recuperaciones y cómo se obtienen los resultados finales de las mediciones experimentales. En el
transcurso del trabajo experimental, es bastante difícil combinar de manera eficiente estas habilidades
requeridas y todas las tareas del trabajo de laboratorio. Esta circunstancia será analizada de cerca por los
profesores encargados de los trabajos de laboratorio.
En primer lugar, el cuaderno de laboratorio es donde se debe completar el esquema del trabajo antes de
ingresar al laboratorio, donde se deben anotar todos los datos experimentales y observaciones, así como los
resultados intermedios y finales. Este cuaderno también será evaluado.

Según los datos recopilados, sus informes deben contener información sobre los siguientes temas (si
corresponde):

・ Calibración

螈 ٦H Rango de calibración (la línea de regresión más confiable)

螈 ٦H Cálculo de la incertidumbre de la concentración obtenida por la línea de regresión

・ Análisis

螈 ٦H Resultados finales (media y desviación estándar, teniendo en cuenta todo el procedimiento)

螈 ٦H 螈 ٦ 卐 ٨CLa concentración final del analito al 95% de confianza.

螈 ٦H Comparación de resultados (entre parejas y / o valor real)

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