PRESENTADO POR:

MARTINEZ BRAVO TERESA

MARTINEZ LOPEZ JAMER
PASTRANA ALGARIN ROSAISELA
VERONA NEGRETE NATALY

BIOQUIMICA

UNIVERSIDAD DE CORDOBA- FACULTAD DE CIENCIAS

BASICAS- PROGRAMA QUIMICA
La espectroscopía ha jugado una parte importante en
el desarrollo de la bioquímica. Se ha utilizado para
medir velocidades de reacción catalizadas por
enzimas, para medir concentraciones de compuestos,
determinar conformaciones estructurales e
interacciones moleculares

Así, existen otros métodos que nos permiten estudiar

moléculas en disolución, los cuales pueden agruparse
en la categoría de las técnicas espectroscópicas.
 Absorción atómica

Fluorescencia atómica
Espectroscopia atómica
Rayos x

Emisión atómica

Técnicas
espectroscópicas Infrarroja

Ultravioleta-visible

Espectroscopia Fluorescencia
molecular Ultravioleta-visible

RMN

Dicroísmo circular
La espectrometría de absorción se basa en la absorción de fotones por una o más sustancias presentes en una
muestra.
Se puede realizar un análisis cualitativo, comparando el espectro de absorción de la muestra problema con
espectros de patrones de composición conocida e identificar las bandas comunes de absorción, o realizar un
análisis cuantitativo, en este caso se utiliza la ecuación de Lambert-Beer para calcular la concentración de la
sustancia a estudio.
 El grupo de péptidos de la cadena principal de una proteína absorbe la luz en un rango de 180 a 230 nm.
 Las cadenas que tienen residuos aromáticos solo absorben la luz en un rango de 240 a 300 nm (tabla 1), esta
región es llamada “UV cercano” o región aromática.
 Los puentes disulfuro que se forman entre dos residuos de cisteína se muestran en bandas de absorbancia de
260 nm.
 Muchos cofactores de proteína absorben la luz en la región UV y en la luz visible.
 El NADH reducido (dinucleótido de nicotinamida y adenina) y FADH2 reducido (dinucleótido de flavina y
adenina) muestran espectros en el Uv cercano.
Figura 1
La espectrometría de infrarrojos (espectroscopia IV) es un tipo de espectrometría de absorción que
utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético.
La espectrometría infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces químicos de las sustancias tienen
frecuencias de vibración específicas, que corresponden a los niveles de energía de la molécula.

Figura 2. Espectro IR de proteína extraida a partir de una solución de

NaOH al 3% (neutralizada con solución residual de HCl).
DICROISMO
CIRCULAR
El dicroísmo circular se
expresa frecuentemente como
la propiedad que poseen
algunos materiales de absorber
la luz a diferentes grados
dependiendo de la forma de
polarización del haz incidente.
DICROISMO CIRCULAR
Las moléculas quirales tienen la
ventaja de poseer índices de
refracción diferentes para la luz
polarizada circularmente dextrógira
y levógira, es decir, los haces de luz
viajan a diferentes velocidades y son
absorbidos en diferentes grados
dependiendo de cada energía. Esto
significa que los coeficientes de
extinción molar para la luz
circularmente polarizada dextrógira
y levógira son diferentes, εL≠εR.

∆ε= εL- εR
DICROISMO CIRCULAR

La elipticidad molar es otra medida para el DC, y se define como:

Donde C y l son la concentración molar y la longitud de la trayectoria (cm) de la celda,

respectivamente. La elipticidad molar se reporta como deg. cm2. dmol o como deg.M -1.m
-1 , y estas dos unidades son equivalentes.
Los instrumentos DC (conocidos como espectropolarímetros) miden la diferencia en
absorbancia entre los componentes L y R de la luz polarizada circularmente, pero
generalmente la reportan en términos de elipticidad (θ) en grados.
Cabe señalar que θ = (b/a) donde b y a son los ejes mayor y menor de la elipse resultante.
DICROISMO CIRCULAR

La elipticidad molar es otra medida para el DC, y se define como:

Donde C y l son la concentración molar y la longitud de la trayectoria (cm) de la celda,

respectivamente. La elipticidad molar se reporta como deg. cm2. dmol o como deg.M -1.m
-1 , y estas dos unidades son equivalentes.
Los instrumentos DC (conocidos como espectropolarímetros) miden la diferencia en
absorbancia entre los componentes L y R de la luz polarizada circularmente, pero
generalmente la reportan en términos de elipticidad (θ) en grados.
Cabe señalar que θ = (b/a) donde b y a son los ejes mayor y menor de la elipse resultante.
DICROISMO CIRCULAR
Los espectros DC para proteínas se realizan en dos regiones del ultravioleta
visible de 180 a 240 nm y de 260 a 320 nm, los primeros están relacionados a la
estructura secundaria, contenido de hélice y hoja B; mientras los segundos a la
estructura terciaria, comportamiento de los aminoácidos aromáticos. Ambos
espectros permiten evaluar la integridad conformacional de las proteínas durante
los procedimientos de extracción y caracterización, en los estudios de
plegamiento y en la unión de ligandos.
DICROISMO CIRCULAR
Características espectrales
UV-Cercano

 La fenilalanina presenta una estructura bien definida en el rango de 255- 270 nm y

sus picos se observan generalmente cercanos a 262 y 268 nm (∆ε 0.3 M-1 cm-1 ).
 La tirosina generalmente tiene un máximo en el rango de 275-282 (∆ε 2 M -1 cm-1 ),
posiblemente con un hombro de unos 6 nm hacia el rojo (longitud de onda mayor).
 El triptófano, muestra con frecuencia, una estructura fina arriba de los 280 nm en la
forma de dos bandas Lb [una a los 288 a 293 y otra a 7 nm hacia el azul (de longitud
de onda menor), con el mismo signo (∆ε 5 M-1 cm-1 )] y una banda La (alrededor de
265 nm) con estructura poco fina (∆ε 2.5 M1 cm-1 ).
 El DC de la cisteina comienza a una longitud de onda larga (>320 nm) y muestra uno
o dos picos anchos arriba de 240 mn (∆ε 1 M-1 cm-1 ); el pico de longitud de onda
larga frecuentemente es negativo.
DICROISMO CIRCULAR
Características espectrales
UV-Cercano
 Todas las proteínas tienen una banda intensa negativa con dos picos (a 208 y 222 nm) y una banda muy
positiva (en 191–193 nm). Las intensidades de estas dos bandas reflejan el contenido de α-hélices. Los
valores de ∆εmrw para una proteína completamente helicoidal pueden ser del orden de -11 M-1 cm-1 (a
208 y 222 nm) y +21 M-1 cm-1 (a 191 y 193 nm).
 Los espectros de proteínas completamente β regulares son significativamente más débiles que los
espectros de las proteínas α. Estos espectros comúnmente tienen una banda negativa (a 210-225 nm,
∆εmrw: -1 a -3.5 M-1 cm-1 ) y una banda fuertemente positiva (a 190-220 nm, ∆εmrw: 2 a -6 M-1 cm-1 ).
 Los péptidos desordenados y las proteínas desnaturalizadas presentan una banda fuertemente negativa (a
195-200 nm, ∆εmrw: -4 a -8 M-1 cm-1 ) y una banda mucho más débil (que puede ser positiva o
negativa) entre 215 y 230 nm (∆εmrw: +0.5 a -2.5 M-1 cm-1 ).
 Las proteínas α+β y α/β casi siempre tienen espectros dominados por el componente α-helicoidal y por
tanto con frecuencia muestran bandas a 222, 208, y 190-195 nm. En algunos casos, puede haber un solo
espectro ancho mínimo entre 210 y 220 nm debido a las contribuciones superpuestas de αhélices y hojas
β.
ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
 La espectroscopia de fluorescencia consiste en la absorción de fotones por
parte de la molécula procedentes de la fuente de energía y pasa a un estado
más excitado; cuando vuelve a su estado inicial o estado fundamental, emite
esa energía en forma de luz, que puede ser cuantificada.
ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
 La mayoría de los compuestos
que contienen anillos aromáticos
proporcionan emisión
fluorescente. Ciertos compuestos
carbonílicos alifáticos y
alicíclicos y estructuras de dobles
enlaces también lo hacen. Sin
embargo, su número es pequeño
en comparación con el número
de compuestos fluorescentes que
contienen anillos aromáticos.
ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
 Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser
usada para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano
(un aminoácido). Cuando se realizan experimentos con
desnaturalizantes, surfactantes u otras moléculas anfifílicas, el
microambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, si
una proteína que contiene un único triptófano en su núcleo
"hidrofóbico" se desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece
un cambio de color en el espectro de emisión del rojo.

 Determinar fármacos, algunos marcadores de enfermedades y proteínas

a partir de la determinación de los aminoácidos aromáticos que
contengan, ya que estos presentan fluorescencia.
ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
 También se han desarrollado pruebas que incorporan donadores
fluorescentes, aceptores no fluorescentes y combinaciones para
detectar proteólisis.
RESONANCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR (RMN)
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
La espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) estudia
el comportamiento de ciertos núcleos atómicos (aquellos que poseen
spin nuclear distinto de cero) en presencia de un campo magnético
externo. Si se aplica un campo magnético externo a una muestra que
contenga estos núcleos, las distintas orientaciones del spin nuclear
tendrán energías diferentes.
La radiación de microondas puede hacer pasar a estos núcleos de un
estado energético a otro.
 ¿Porqué estudiar RMN?

•Elucidación Estructural •Estudio de procesos dinámicos

•Productos Naturales •.Cinética de Reacciones

•Síntesis Orgánica •Procesos de Equilibrio

• Estudios Estructurales en 3D • Diseño de Drogas

•Proteínas •Relación estructura - actividad

• ADN – complejos
•Polisacáridos • Control de Calidad

•Análisis “de orígen” de

alimentos
•Medicina – Diagnóstico por Imágenes
• Falsificación de
patentes
 Como en otros métodos espectroscópicos…

El fenómeno de RMN consiste en la absorción de

energía de radiación electromagnética por parte de
núcleos que tienen un momento magnético

La absorción ocurre a frecuencias característica

que dependen del tipo de núcleo (1H, 13C, 31P, etc)
del entorno molecular en que se encuentra.
La RMN es una técnica transversal que ha experimentado un espectacular desarrollo
gracias a la contribución de numerosas áreas de conocimiento que abarcan desde las
ciencias experimentales clásicas hasta ciencias de la salud o tecnológicas.

La RMN es una técnica transversal que ha experimentado un espectacular desarrollo

gracias a la contribución de numerosas áreas de conocimiento que abarcan desde las
ciencias experimentales clásicas hasta ciencias de la salud o tecnológicas.

El núcleo es el corazón de los átomos donde se acomodan la mayoría de las masas

elementales (neutrones y protones). Los núcleos con un número impar de protones o
neutrones, poseen un momento magnético característico y un campo magnético asociado.
 La RMN presenta dos vertientes de estudio, por un lado la espectroscopía, quizá la más
RMN
conocida en el campo de la química y la bioquímica, y por otro la imagen más
extendida en la medicina y la biomedicina.

Las aplicaciones bioquímicas de la RMN probablemente comenzaron en 1972 cuando por

espectroscopía de carbono 13 (13C RMN) se siguió el metabolismo de la glucosa,
marcada con dicho isótopo, en una suspensión
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
 La resonancia dentro del campo bioquímico, tiene un amplio poder
discriminador, como por ejemplo el uso de RM ₃₁P para mostrar lo
que hacen los grupos fosfato en una molécula de acido nucleico.
 Los espectros de RM ₁₃C ayudan a diferenciar los tipos individuales
de átomos de carbono en diferentes polipéptidos.
 Cuando los átomos solo pueden moverse lentamente en solución, las
líneas de RM se ensancha.
 El contraste de definición de picos entre las formas de hélice y el
ovillo aleatorio de este polipéptido. Permite estudiar de modo mas
directo la transición hélice ovillo aleatorio
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

 RMN bidimensional permite obtener información potencialmente de la

molécula completa, de las correlaciones entre átomos adyacentes y sus
protones (COSY), y por otra parte (NOESY) que permite averiguar que
protones están cerca espacialmente, y proporciona una ruta para la
determinación estructural tridimensional.
 BIBLIOGRAFÍAS

 Métodos espectroscópicos para el estudio de la conformación macromolecular

en solución, capitulo 6, BIOQUIMICA, segunda edición- Mathew Van Holde.

 Técnicas aplicadas en el laboratorio de bioquímica clínica, Análisis

bioquímico, editorial síntesis s.a. www.sintesis.com, María Amorós Sánchez,
Laura Barrero Cuevas.
 file:///C:/Users/Lesli%20Carolina/Desktop/Quimica/BIOQUIMICA/art32.pdf
Articulo.