UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUIA Nº 2

COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRÍA, DILUCIONES EN SERIE E
INDEPENDIENTES

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

OBJETIVOS
1. Obtener la curva espectral y la longitud de onda máxima de absorción en el espectro visible de
un estándar que se encuentra mezclado con otro compuesto.
2. Establecer los factores de dilución que se deben aplicar a un estándar para realizar una curva de
calibración con tres diluciones en serie y proporcionales que inicien en un valor de absorbancia
preestablecido.
3. Elaborar curvas de calibración micro y macro con tres diluciones en serie y proporcionales que
inicien en un valor de absorbancia preestablecido y corregirlas por mínimos cuadrados.
4. Calcular los gramos presentes y el porcentaje de una muestra problema en una mezcla, a partir de
la ley de Lambert y Beer y de los valores obtenidos por corrección por mínimos cuadrados de la
curva de calibración.
5. Establecer valores absortividad molar, específica y en L/μMol.cm de dos soluciones en el
espectro visible y UV.
6. Determinar la concentración en M/L, g/L, de una muestra problema en el espectro visible.
7. Desarrollar destrezas en el laboratorio para realizar diluciones en serie e independientes
aplicando proporciones y factores de dilución.

PREPARACION PREVIA
1. Repase unidades de conversión de masa y volumen.
2. Repase las formulas que establecen de manera rápida el factor de dilución.
3. Repase los principios de la ley de Lambert-Beer.
4. Realice un cuadro que relacione el color de la sustancia contra longitud de onda que absorbe a
fin de delimitar el barrido.
5. Investigue como se determina el factor W.
6. Lea la metodología que aplicará durante la práctica de laboratorio.

1
 MATERIALES EQUIPOS REACTIVOS
1 Gradilla 2 Espectrofotómetros 100 ml de solución de cloruro de Níquel
o Cobalto, la concentración será
indicada por el profesor.
8 Tubos de ensayo 4 Celdas para spectronic 21. 1 g Muestra problema (en estado sólido
y en mezcla con un compuesto que no
absorba en el espectro visible).

4 Pipetas de 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 2 Fotocolorimetros 1. 5 ml de estándar que absorba en el

ml. espectro UV cercano, la concentración
será indicada por el profesor

2 Beakers 50 ml y 250 ml. 4 Celdas de plástico para 1. 5 ml de muestra problema que

Fotocolorímetro. absorba en el espectro UV cercano.
I Frasco lavador con agua 2 Celdas de cuarzo para
destilada. espectrofotómetro UV-
Visible.
1 CD (alumnos). 1 Espectrofotómetro UV-
Visible.
2 Hojas de papel milimetrado 1 Estufa de calentamiento
(alumnos).
1 Pkte de toallas secantes (grupo) 1 Balanza analítica.

1 Rollo papel aluminio (grupo) 5 Micropipetas 10 μL, 50

μL, 100 μL. 250μLy 1000
μL.
3 Cajas puntas blancas, amarillas
y azules.
4 Tubos eppendorrf de 1.5 ml.

PROCEDIMIENTO
A. Curva espectral de cloruro níquel o cobalto.
1. Prepare un blanco de reactivos, que es una solución que contiene todos los reactivos a excepción
del compuesto que va a medir para determinar su concentración.
2. Calibre el equipo.
3. Efectúe el barrido de la solución estándar delimitándolo de acuerdo a su color.
4. Registre en un CD el espectro y grafique la A contra  en nm.
5. Determine en la solución estándar el rango óptimo de absorción, su lambda máxima y su
Absorbancia.

2
Tabla 1. Datos curva espectral cloruro de níquel o Cobalto.
Grupo 1 Longitud de %T A
onda
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

B. Curva calibración y diluciones independientes

1. Calcule los factores de dilución que debe aplicar a su estándar para elaborar una curva de
calibración con 3 diluciones independientes y proporcionales que partan de un máximo de
absorbancia de 062, 065, 0.72, 0.76, 0.82, 0.87, 0.92, 0.98 (el profesor asignará el valor a cada
grupo), tenga en cuenta el valor de absorbancia obtenido en el numeral 5.
2. Rotule tres tubos de ensayo y elabore las 3 diluciones independientes.
3. Lea cada dilución en la  óptima hallada en el numeral 5, registre los valores del factor de
dilución y A en la Tabla 2 de control de clase Anexo 2.
4. Calcule los valores de concentración de cada dilución en M/L, g/L y registre los valores en la
Tabla 2 del Anexo 2.
5. Grafique la absorbancia de las tres diluciones (ordenada) contra su concentración en g/L
(abscisa) sin hacer correcciones a los datos, luego corrija la curva de calibración por mínimos
cuadrados y grafique los valores obtenidos. Indique los valores de intercepto, pendiente y
coeficiente de correlación para la gráfica y procese los datos en la Tabla 2 del Anexo 2.
6. Estime la absortividad específica para la solución cloruro de níquel o cobalto despejando de la
formula de Lambert-Beer y de los valores obtenidos al corregir por mínimos cuadrados la curva
de calibración.
7. Calcule la concentración de la solución problema en g/L por despeje de los valores obtenidos al
corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración e interpole su valor en la grafica corregida
en el numeral 5.
8. Determine en la muestra problema la cantidad en gramos y porcentaje de cloruro de níquel ó
cobalto presentes en la mezcla.

3
Tabla 2. Datos curva calibración cloruro níquel o cobalto mediante diluciones independientes.
Grupo M/L Cloruro Niquel Lambda Abs
g/L M/L g
Estándar y Diluciones Máximo Fd Abs Observada
Abs independiente donde leyó X X MP Esperada Y
1
2
3
MP 1
a
b
r

C. Curva de calibración y diluciones en serie

1. Calcule los factores de dilución que debe aplicar a su estándar de cloruro de níquel ó cobalto
para elaborar una curva de calibración con 3 diluciones en serie y proporcionales donde la
concentración máxima tenga una absorbancia de 1.1, 0.96, 0.85, 0.81, 0.75, 0.72, 0.67, 0,65 (el
profesor le asignará uno de estos valores a cada grupo), prepare un volumen de 1.5 ml para
cada una, en tubos eppendorf.
2. Lea cada dilución en el espectrofotómetro Perkin Elmer en la  óptima hallada en el numeral 5
de la curva espectral, registre los valores de factor de dilución, A y % T en la Tabla 3 de
control de clase Anexo 2.
3. Calcule los valores de concentración de cada dilución en M/L y registre los valores en la Tabla 3
de control de clase Anexo 2.
4. Grafique la A de las tres diluciones contra su concentración en M/L sin hacer correcciones a los
datos, luego corrija los datos de las curvas de calibración por mínimos cuadrados y grafique los
valores obtenidos. Indique los valores de intercepto, pendiente y coeficiente de correlación para
la gráfica y procese los datos en la Tabla 3 del Anexo 2.
5. Calcule la absortividad molar para la solución mediante el despeje de los valores obtenidos al
corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración.

Tabla 3. Datos curva calibración cloruro níquel o cobalto mediante diluciones en serie.
M/L Cloruro Níquel Lambda Abs
Estándar y Diluciones en Máximo g/L M/L Observada
Grupo Abs serie donde leyó Fd X X Abs Esperada Y
1
2
3
MP 1
a
b
r

4
 D. Curva espectral de una solución desconocida
Se tiene una solución W desconocida de peso molecular 709.4 g/Mol que presenta descomposición
rápida con la luz, por lo tanto se debe proteger de esta con papel aluminio. La solución estándar que
se entregará al grupo tiene una concentración conocida y no tiene color, cuando se realiza su barrido
espectral presenta un pico de absorción a 260 nm debido a que contiene adenina, por lo tanto no tenga
en cuenta este pico como su máximo absorción.

1. Calibre el equipo y efectúe el barrido de la solución estándar desconocida utilizando agua

destilada como blanco de reactivos.
2. Procese los valores del barrido de la sustancia W en la Tabla 4 Anexo 2 y grave el espectro en
un CD.
3. Grafique el espectro de absorción del estándar desconocido y determine el lambda máxima de
absorción y su valor de absorbancia en esta longitud de onda.
4. Calcule los valores de absortividad molar, específica y en L/M.cm del estándar desconocido.
5. Determine los mg del estándar que se tomaron para preparar 25 ml de esta solución
6. Establezca la concentración de la muestra problema en M.
7. Calcule el factor de dilución que se le realizó a la muestra problema si esta fue preparada a partir
del estándar.
8. Investigue a que compuesto corresponde de acuerdo a su espectro de absorción.

Tabla 4. Datos curva espectral sustancia desconocida.

Grupo λ A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

RESULTADOS QUE DEBE PRESENTAR.

1. Anexe la curva espectral, y los valores de la Tabla 1 indicando la longitud de onda máxima de su
estándar y el equipo que utilizó. No olvide colocar las unidades de las variables correspondientes.

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 2. Grafique las curvas de calibración y adjunte: los datos procesados en Tabla 2 del Anexo 2,
factores de dilución aplicados, los valores de coeficiente de correlación, pendiente e intercepto
obtenidos por mínimos cuadrados, los valores de absortividad en las unidades solicitadas, la
concentración de la MP en Mol/L y g/L interpolando sobre la curva de calibración, despeje los
Mol/L y g/L de la MP de de los valores de intercepto y pendiente obtenidos al corregir por
mínimos cuadrados la curva de calibración (Y = a + b X) o de la formula de Lambert y Beer e
indique los gramos presentes y el porcentaje de la muestra problema en la mezcla.
3. Grafique las curvas de calibración para las diluciones en serie y adjunte: los datos procesados en
Tabla 3 del Anexo 2, factores de dilución realizados, los valores de coeficiente de correlación,
pendiente e intercepto obtenidos por mínimos cuadrados y los valores de absortividad en las
unidades solicitadas.
4. Indique los cálculos y factores de conversión que obtuvo para establecer los mg de muestra del
estándar en 25 ml y para la muestra problema W la absortividad molar, específica,
L/µMol/cm, el factor de dilución que se aplicó, la concentración en µMol.
5. Anexe la Tabla 4 y el espectro que identifica a que sustancia corresponde la muestra problema W
analizada en el numeral D. sustente su respuesta con un espectro que halla sido reportado
previamente en un artículo de aplicación en Bioquímica.

BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTAR

1. BENDER, G. T. (1987). Métodos Instrumentales de Análisis en Química Clínica. Zaragoza:
Acribia. p 37-85

6
 ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria
Tabla 1 Datos curva espectral cloruro de níquel o cobalto
Grupo 1 Longitud de %T A Grupo Longitud de %T A Grupo Longitud de %T A
onda 4 onda 7 onda
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10
11 11 11
12 12 12
13 13 13
14 14 14
15 15 15

Grupo 2 Longitud de %T A Grupo Longitud de %T A Grupo Longitud de %T A

onda 5 onda 8 onda
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10
11 11 11
12 12 12
13 13 13
14 14 14
15 15 15

Grupo 3 Longitud de %T A Grupo Longitud de %T A Grupo Longitud de %T A

onda 6 onda 9 onda
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10
11 11 11
12 12 12
13 13 13
14 14 14
15 15 15

7
 ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria
Tabla 2. Datos curva calibración Cloruro níquel o cobalto por diluciones independientes.
Grupo M/L Cloruro Niquel Lambda Abs Abs
g/L M/L g
Estándar y Diluciones Máximo Fd Esperad Observada
Abs independientes donde leyó X X MP a Y
1
2
3
1 MP 1
a
b
r
1 513nm 1/10 8,85 0,037 0,1625 0,137
2 513nm 1/5 17,13 0,072 0,325 0,322
3 513nm 1/2,5 34,595 0,1454 0,65 0,654
2 MP 2 ---------
a -0,0313 -0,0299
b 0,01992 4,72462
r 0,9999 0,9999
1
2
3
3 MP 3
a
b
r
1
2
3
4 MP 4
a
b
r
1
2
3
5 MP 5
a
b
r
1
2
3
6 MP 6
a
b
r

8
 ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria
Tabla 3. Datos curva calibración Cloruro níquel o cobalto por diluciones en serie.
M/L Cloruro Niquel Lambda Abs
g/L M/L
Grupo Estándar y Diluciones en Máximo Fd Observada
Abs serie donde leyó X X Abs Esperada Y
1
2
3
1 MP 1
a
b
r
1 513nm 1/2 13,04 0,0548 0,24 0,248
2 513nm 1/2 26,08 0,1098 0,48 0,509
3 513nm 1/1,044 52,16 0,2192 0,96 0,98
2 MP 2 513nm 1/2 0,298
a 0,0124 0,0124
b 0,0186 4,43065
r 1 1
1
2
3
3 MP 3
a
b
r
1
2
3
4 MP 4
a
b
r
1
2
3
5 MP 5
a
b
r
1
2
3
6 MP 6
a
b
r

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 ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria
Tabla 4 Datos curva espectral sustancia desconocida.
Grupo 1 Longitud de A Grupo Longitud de A Grupo 7 Longitud de A
onda 4 onda onda
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10
11 11 11
12 12 12
13 13 13
14 14 14
15 15 15

Grupo 2 Longitud de A Grupo Longitud de A Grupo8 Longitud de A

onda 5 onda onda
1 260 nm 0.023 1 1
2 266 nm 0,025 2 2
3 275 nm 0.024 3 3
4 284 nm 0.571 4 4
5 293 nm 1.000 5 5
6 302 nm 0.589 6 6
7 311 nm 0.335 7 7
8 320 nm 0.296 8 8
9 329 nm 0.322 9 9
10 338 nm 0.345 10 10
11 347 nm 0.331| 11 11
12 356 nm 0.29 12 12
13 13 13
14 14 14
15 15 15

Grupo 3 Longitud de A Grupo Longitud de A Grupo9 Longitud de A

onda 6 onda onda
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10
11 11 11
12 12 12
13 13 13
14 14 14
15 15 15

10