Bioquímica

Informe de laboratorio
Práctica N. 6

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNA POR METODOS ESPECTROFOTOMETRICOS

Acho Orozco Brayan Giovanni1, Torres Marulanda Diego Fernando 2, Fitatá Castaño Joan Sebastián3
1. Resumen (summary).
La espectrofotometría es un método de análisis cuantitativo-químico que usa la luz (absorbida por
un sistema) para poder determinar la concentración de una sustancia. La parte de una molécula
responsable de la absorción de la luz se llama cromóforo. Toda sustancia que absorbe luz visible
aparece coloreada cuando transmite o refleja la luz. Cuando la radiación pasa a través de la
solución se eliminan determinadas frecuencias por absorción. La absorción promueve a estas
partículas de su estado elemental a uno o más estados de excitación de energía más elevada. La
energía del fotón excitante debe coincidir con la diferencia de energía de especies absorbentes. Lo
cual brinda información cualitativa y la intensidad de esa absorción información cuantitativa. En
otras palabras, algunas moléculas son capaces de absorber (sólo ciertas longitudes de onda) y
aquellas que no lo son determinan el color que nuestros ojos pueden detectar. La
espectrofotometría utiliza dicha propiedad para identificar y cuantificar estas moléculas. Con base
en lo anterior, el objetivo de la práctica consistió en determinar cuantitativamente proteínas
mediante la técnica de espectrofotometría.
Spectrophotometry is a method of quantitative-chemical analysis that uses light (absorbed by a
system) to determine the concentration of a substance. The part of a molecule responsible for
absorbing light is called a chromophore. Any substance that absorbs visible light appears colored
when it transmits or reflects light. When radiation passes through the solution certain frequencies
are eliminated by absorption. Absorption promotes these particles from their elementary state to
one or more higher energy excited states. The energy of the exciting photon must match the
energy difference of absorbing species. Which provides qualitative information and the intensity of
that absorption quantitative information. In other words, some molecules are able to absorb (only
certain wavelengths) and those that are not determine the color that our eyes can detect.
Spectrophotometry uses this property to identify and quantify these molecules. Based on the
above, the objective of the practice was to quantitatively determine proteins using the
spectrophotometric technique.
Palabras clave (keywords).
Espectrofotometría, cuantitativo, absorción, energía, proteínas.
Spectrophotometry, quantitative, absorption, energy, proteins.
2. Objetivos.

 Cuantificar la cantidad de proteína en una muestra, usando correctamente el

espectrofotómetro, comprendiendo la relación entre absorbancia y concentración de
soluto.

1 Estudiante de regencia de farmacia, código 136104604, email bgacho@unillanos.edu.co

2 Estudiante de regencia de farmacia, código 136104603, email dftorres.marulanda@unillanos.edu.co
3 Estudiante de regencia de farmacia, código 136104601, email jsfitata@unillanos.edu.co
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3. Marco teórico.

Figura 1. Mapa conceptual sobre los aspectos relevantes de la espectrofotometría.

4. Metodología

Figura 2. Diagramas de flujo del procedimiento en laboratorio.

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4 0,6 0,4 ------- 5 0,5

5 0,5 0,5 ------- 5 0,5
4.1. Evidencias fotográficas del
M1 0,7 ------- 0,3 5 0,5
procedimiento M2 0,5 ------- 0,5 5 0,5

La ley de Lambert-Beer, aplicada desde la

óptica, refiere la capacidad de absorción de
la luz con las propiedades del material
atravesado (Fig. 4). En este sentido, relaciona
la intensidad de la luz entrante con la luz
saliente después de producirse la absorción
(Mäntele & Deniz, 2017).

Figura 3. Tubos de ensayo rotulados. Los

tubos M1 y M2 fueron evaluados con una
muestra problema. El tubo M1, con 0,7 ml y Figura 4. Comportamiento de un haz
0,3ml de solución problema y el tubo M2, incidente sobre una celda.
con 0,5 ml de agua 0,5ml de solución
problema. La medición de absorbancia debe realizarse
mediante una celda espectrofotométrica
De acuerdo con la información consignada trasparente, la cual debe contener la
en la Tabla. 1. Fue llenado cada uno de los 8 solución del analito. La atenuación del haz
tubos de ensayo (Fig. 3). El reactivo C se resultante es de carácter sustancial. Además,
preparó con los reactivos A (NaCO3 2%), B1 la atenuación de un determinado haz, puede
(CuSO4*5H20 al 1%), Y B2 (tartrato sódico – ocurrir por dispersión de las moléculas
potásico 2%) en las siguientes cantidades: grandes y en algunos casos particulares por
Reactivo A: 50 ml, reactivo B1: 0,5ml, absorción de las paredes del recipiente
reactivo B2: 0,5ml. Una vez homogenizadas (Skoog et al., 2008).
las soluciones, la mezcla tomó una coloración
azul claro (Fig. 5).
Tabla 1. Proporciones volumétricas para
determinación espectrofotométrica.
TU AG ALBÚ MUES RAC FOL
BO UA MINA TRA TIVO LIN
(m (ml) PROB C DIL
l) LEMA (ml) UID
(ml) O
(ml) Figura 5. Reactivo C y Reactivo Follin. La
B 1 ------- ------- 5 0,5 coloración azul se pudo observar al añadir a
1 0,9 0,1 ------- 5 0,5 la mezcla el sulfato de cobre CuSO4 Fig.4a. El
2 0,8 0,2 ------- 5 0,5 reactivo Follin fue la última solución
3 0,7 0,3 ------- 5 0,5 agregada a los tubos de ensayo Fig.4b.
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Respecto a los datos presentado en la tabla método colorimétrico para la cuantificación

1, y los datos de absorbancia obtenidos por demostró ajustarse a las características de la
espectrofotometría de ultravioleta visible se Ley de Lambert-Beer (Skoog et al., 2008).
construyó una curva de absorbancia, la cual
Para la determinación cuantitativa en
permitió comparar intensidades espectrales
de las muestras presentadas, respecto a una miligramos se tomó como referencia la Ec. 1.
En donde se convierte las unidades de
longitud de onda establecida de 750
nanómetros (nm). La cual refleja una volumen en unidades de masa. Pasando de
esta forma los mililitros de la solución a
estrecha cercanía a los valores (R2= 0,9997)
teóricos esperados (Fig. 6). Lo que significa miligramos de soluto. Complementariamente
para la determinación de la pendiente de la
que es una buena curva patrón para
determinar la concentración de proteínas de ecuación de la recta (Ec.2) se empleó la Ec.3.
una muestra desconocida. Respecto a las
muestras problema. Nutricionalmente están
desarrolladas con altos niveles de diferentes 1 mg albúmina
0,1 ml solución =0,1 mg albúmina
proteínas. De acuerdo a los datos obtenidos, 1ml solución
es posible estimar que su relación de
Ecuación 1. Conversión de unidades de la
absorbancia es directamente proporcional, a
solución evaluada para la curva de
medida que incrementa la concentración de
absorbancia.
la muestra problema, incrementa su
absorbancia (Navarro et al., 2017).

a ¿ y=mx+b
( y −b)
b ¿ x=
m
Ecuación 2. Ecuación de la recta (Ec2a). Es
indispensable para encontrar el valor de la
concentración en muestras problema (Ec2b).

( y 2− y 1)
m=
(x 2−x 1)
Ecuación 3. Fórmula matemática para
Figura 6. Curva de absorbancia obtenida encontrar el valor de la pendiente.
mediante espectrofotometría. A continuación, se describen todas las
La cuantificación espectrofotométrica se conversiones realizadas con las soluciones de
llevó a cabo mediante el método de Lowry et la proteína albúmina.
al., (1951). Empleando una curva patrón (Fig. 1 mg albúmina
6). Con seroalbúmina bovina (BSA). El 0,2 ml solución =0,2 mg albúmina
1ml solución
comportamiento de la recta, corresponde a
un modelo de regresión lineal, tomando 1 mg albúmina
0,3 ml solución =0,3 mg albúmina
como referencia en el eje Y, la absorbancia y 1 ml solución
en el eje X, la concentración de solutos con la
referencia del tubo específico (Tabla. 1). Este
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1mg albúmina importancia en diferentes campos

0,4 ml solución =0,4 mg albúmina
1 ml solución económicos a nivel mundial. Su sensibilidad,
economía y sencillez la han destacado sobre
1 mg albúmina
0,5 ml solución =0,5 mg albúmina otras técnicas de absorción como la de luz
1 ml solución infrarroja. Desde la identificación de
A través de la ecuación de la recta, se contaminantes en cuerpos de agua, realizado
despejó el valor de x para determinar la por Arévalo en el año 2006. Donde encontró
concentración de las muestras rotuladas M1 a una longitud de onda de 480 nm
y M2, los valores obtenidos están en la tabla determinados hidrocarburos presentes en
2. una muestra de agua. También en el campo
de la agricultura ha sido ampliamente usada
Tabla 2. Concentraciones en unidades de esta herramienta. Siendo el caso de estudios
mg/ml para las muestras problema. relacionados con la determinación
Obtenidas del complemente proteico. cuantitativa de Aloe vera (Saavedra et al.,
2010), en líquenes (Castro, 2010), en la
Muestra industria vinífera (Martelo, 2014). De igual
problema Absorbancia Concentración [] forma, en aplicaciones médicas en la
M1 1,584 1,101133167 detección y viabilidad de células de cáncer de
M2 1,906 1,343672542 mama (Cubas et al., 2018). Finalmente, esta
técnica demuestra una alta efectividad para
la determinación cuantitativa de muestras
5. Análisis de resultados.
proteicas.
6. Conclusiones
Los valores espectrofotométricos obtenidos
mediante luz ultravioleta (750nm), son útiles
para la detección de grupos cromóforos. Los análisis químicos cuantitativos requieren
Dado que las moléculas grandes, una cuidadosa preparación para obtener un
estructuralmente complejas. Son resultado confiable.
transparentes a la radiación superior a
180nm (Anexo. 1). Sin embargo, el valor final La determinación cuantitativa de Lowry et
de la absorbancia tiene cierto grado de al., (1951), se ajustó al modelo de
incertidumbre. La confianza del resultado comportamiento descrito por la Lay de
depende en gran medida de la calidad del Lambert-Beer.
instrumento, de las condiciones durante la Este protocolo, permitió un análisis
medición, etc. Sin lugar a dudas, de la cuantitativo de bajo costo, confiable,
habilidad del operador del sencillo, sensible y rápido.
espectrofotómetro.
7. Bibliografía.
Para la preparación de la técnica, es
necesario realizar una calibración del
espectrofotómetro, con una solución patrón Mäntele, W., & Deniz, E. (2017). UV–VIS
sin ningún elemento detectable o con absorption spectroscopy: Lambert-Beer
absorbancia del 0%, en nuestro caso reloaded. Spectrochimica Acta Part A:
particular, la calibración se llevó a cabo con Molecular and Biomolecular Spectroscopy,
una celda al 75% del volumen final de agua 173, 965-968.
destilada. Esta técnica ha sido de gran
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Navarro, Y. M. C., Salazar, L. M. B., Giraldo, J. Latin-American Journal of Physics Education,

D. R., González, J. P. P., & Osorio, J. I. T. 12(2), 7.
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extracción y la cuantificación de proteínas
totales en semillas germinadas de maíz (Zea
mays L.). Revista Facultad De Ciencias
Básicas, 13(1), 65-68.
Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. y
Randall R.J. 1951. Protein measurement
with the Folin phenol reagent. The
Journal of Biological Chemistry, 193: 265-
275.
8. Anexos.
Skoog D.A. Holler F.J. y Crouch S.R. 2008.
Principios de análisis instrumental. Sexta
edición. Cengage Learning Editores. México
D.F.
Hidalgo, A. G. A. (2006). EVALUACIÓN DE UN
MÉTODO POR ESPECTROSCOPÍA UV-VIS
PARA LA DETECCIÓN DE CONTAMINANTES
ORGÁNICOS EN AGUA.
Saavedra Nizama, F., Ale Borja, N., Gordillo
Rocha, G., Apesteguía Infante, A., Jurado
Teixeira, B., & Revilla Casalino, A. (2010).
Análisis por espectroscopía UV y FTIR de
macerados acuosos y alcohólicos de Aloe
vera L. y Aloe barbadensis Miller. Interacción
con sales inorgánicas. Revista de la Sociedad
Química del Perú, 76(3), 242-260. Anexo 1. Características de absorción de
algunos cromóforos comunes. Fuente:
Castro Mandujano, O. N. (2010). Aislamiento Skoog. Douglas & Donald M. West. Análisis
del ácido úsnico de Flavoparmelia caperata y Instrumental, página 178.
su determinación cuantitativa por
espectroscopía UV, en diez líquenes. Revista
de la Sociedad Química del Perú, 76(4), 389-
399.
Martelo Vidal, M. J. (2014). Desarrollo de
métodos rápidos basados en espectroscopía
UV-VIS-NIR para el análisis de vinos.
Cubas, J. M., Pimentel, R. G. C., Merlín, I. E.
M., & Martínez, E. S. M. (2018). La
espectroscopia UV-Vis en la evaluación de la
viabilidad de células de cáncer de mama.
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