UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Facultad de Industrias Alimentarias

Curso: Análisis de Instrumentación de Alimentos

I. INTRODUCCIÓN

El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas

analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización
físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es
la espectroscopía, y la espectroscopía ultravioleta-visible.

Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el

empleo de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un
producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas de reactivos específicos que
reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo
en muestras complejas.

El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber

radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV visible. Las longitudes de onda
de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben
dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza
iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la
determinación y caracterización de biomoléculas.

En esta práctica se determinará la longitud de onda de máxima absorción del azul de metileno,
y el rango lineal para la determinación de azul de metileno (desviación de la Ley de Lambert-
Beer.

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II. REVISIÓN DE LITERATURA

En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación

electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectofotometría
de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el
visible (400-780 nm).

Figura 1. Espectro electromagnético : En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite.

Para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que

absorbe luz la solución coloreada.

Figura 2.

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica muy utilizada en química y

bioquímica para determinar la concentración de un compuesto en solución. La absorción de la
radiación electromagnética por las moléculas depende de su estructura y de la longitud de onda
de la radiación, por lo que la espectrofotometría se basa en la medición de la cantidad de luz
absorbida por una solución a diferentes longitudes de onda.

LEY DE LAMBERT-BEER

Expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y
concentración de un cromóforo en solución:

A = log I/Io = ε·c·l

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La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –a mayor

número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución –a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz
por la muestra más moléculas se encontrará-; y por último, depende de ε, una constante de
proporcionalidad -denominada coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo.

CURVAS DE CALIBRADO
Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de diferentes
concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor de absorbancia a λ
max.

Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisa y los de concentración en el eje

de ordenadas. Se observará que, a bajas concentraciones, el aumento de concentración
corresponde con un incremento lineal en la absorbancia. A concentraciones altas la linealidad
se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables. La
representación de Lambert-Beer, nos permitirá calcular el valor del coeficiente de extinción
molar, que corresponde a la pendiente de la recta.

El espectrofotómetro es un instrumento que permite seleccionar la longitud de onda de la

radiación, controlar la intensidad de la luz y medir la cantidad de luz que pasa a través de la
solución.

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES:

A) REACTIVOS
 Azul de metileno (MW = 319.89 g/mol)

 Etanol grado reactivo

B) MATERIALES Y EQUIPO
 Fiola de 25 ml.
 Vasos de precipitado
 Micropipetas
 Propipetas
 Cubetas quarzo para espectrofotómetro
 Tubos de ensayo
 Rejilla
 Espectrofotómetro Genesys 10S – Manual de operación -

3.2 MÉTODOS

1. Para preparar una solución 0,1 g/L de azul de metileno, se puede pesar 0,1 g de azul de
metileno y disolverlo en agua destilada para obtener 1000 mL de solución. Esta solución se
puede utilizar como una solución madre para preparar disoluciones de concentraciones más
bajas.

2. Para preparar una solución 10 mg/L de azul de metileno, se puede tomar 1 mL de la solución
madre (0,1 g/L) y transferirlo a un matraz aforado de 100 mL. Luego, se agrega 20 mL de
etanol y se completa el volumen con agua destilada.

3. Para preparar soluciones de concentraciones más bajas, se puede tomar una alícuota de la
solución de 10 mg/L y diluirla con agua destilada.
A partir de la solución patrón realizar cinco a seis diluciones seriadas:

C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6
Soluciones 0 0.5 1 2 3 4 5
estándares (mL)
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4. Calibrar el espectrofotómetro en cero con agua destilada antes de realizar cada lectura y leer
consecutivamente las soluciones de azul de metileno.

Para medir la longitud de onda máxima de absorción del azul de metileno, se puede seguir los
siguientes cálculos:

1. Preparar una solución de azul de metileno en el rango de concentraciones de interés.

Realizar un barrido de espectro en el espectrofotómetro, utilizando un rango de longitudes de
onda de 400 a 800 nm y midiendo la absorbancia de la solución en cada longitud de onda.

- Medir la absorbancia en el intervalo de longitudes de onda fijado tomando valores

cada 20 nm. Se repite la operación de manera más fina en la región donde se haya
observado una mayor absorbancia, esta vez tomando valores cada 10 nm.

2. Identificar la longitud de onda en la que se observa la mayor absorbancia. Esta longitud

de onda es la longitud de onda máxima de absorción del azul de metileno.

Para determinar el rango de concentración lineal para que se cumpla la Ley de Lambert-Beer,
se puede seguir los siguientes cálculos:

1. Preparar una serie de soluciones de azul de metileno en el rango de concentraciones de

interés.

2. Medir la absorbancia de cada solución en la longitud de onda máxima de absorción

determinada anteriormente.

3. Graficar la absorbancia en función de la concentración y verificar si la relación es lineal

en el rango de concentraciones estudiado.

4. Determinar el rango de concentración lineal como aquel en el que la relación entre la

absorbancia y la concentración es lineal y la desviación de la Ley de Lambert-Beer

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IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Punto Concentración FD Vol. Sol. STOCK Vol. Etanol

1 0.5 20 0.25 4.75
2 1 10 0.5 4.5
3 2 5 1.0 4.0
4 3 3.33 1.5 3.5
5 4 2.5 2.0 3.0
6 5 2 2.5 2.5

V. CONCLUSIONES

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VI. BIBLIOGRAFÍA

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