La criopreservación

M.Sc. Beatriz Angeles

Introducción
●Criogenia: es el conjunto de técnicas para la obtención de bajas
temperaturas.
●Criopreservación: es el proceso de enfriar y preservar células,
tejidos u órganos a muy bajas temperaturas para mantener su
viabilidad
●Criobiología: rama de la biología que se encarga de estudiar los
efectos de las bajas temperaturas en los seres vivos (adaptación
al frío, transplantes, criopreservación, criocirugía).
 Criopreservación

Descongelación

semen

Semen + Solución
crioprotectora
CONGELAMIENTO CELULAR
 ADAPTACIONES AL FRIO
Debajo 0°C
Encima 0°C

Migración Mantener
calor Evitar Tolerar
congelamiento congelamiento
Hibernación Supercool

osos, tortugas vertebrados

Bradimetabolismo
Algunos reptiles
murciélago, aves y anfibios
pequeñas, mamíferos Invertebrados
Taquimetabolismo, Homeotermia
 Animales que se sobrenfrían o congelan
durante el invierno
• Tortugas
– Chysemys picta (crías eclosionan y permanecen a -8ºC)
• Peces
– Nototénidos (NaCl + moléculas anticongelantes)
• Ranas: Glucosa, glicerol y sorbitol
– Rana sylvatica
– Hyla crucifer
– Hyla versicolor
– Pseudacris triseriata
• Salamandras:
– Hynobious keyserlingi (sobrevive a -35ºC)
• Insectos y Arañas (anticongelante: Etilénglicol, = -30ºC)
- La larva de la mosca Eurosta solidaginis
Como sobrevivir al congelamiento?
● LIBERAR GLUCOSA A LA SANGRE

● AGREGAR PROTEINAS NUCLEADORAS A LA SANGRE

● SÍNTETIZAR AFP (proteínas anticongelantes)

● DISMINUIR LA DESHIDRATACIÓN CON CRIOPROTECTORES

(Storey & Storey 1992 Ann Rev Physiol 54: 619-637)

(Storey 1997 Comp Biochem Physiol A 117: 319-326)
(Storey & Storey 1996 Ann Rev Ecol Syst 27: 365-386)
Sobreviviendo al congelamiento
Criopreservación
●Objetivos:
● reducir la formación de cristales de hielo intracelulares,
● controlar la deshidratación celular,
● Incrementar la viabilidad a bajas temperaturas

●La criopreservación considera el congelamiento controlado para

evitar los daños provocados por el ataque físico de los agudos
cristales de hielo y los efectos tóxicos de las sustancias que se
deben incorporar para evitarlos.
 METODOLOGÍAS DE CRIOPRESERVACIÓN

Crioprotectores Permeables:
- Bajo Peso molecular,
- Que atraviesan la Membrana plasmática
- Alta afinidad por el agua
Crioprotectores No permeables:
- Peso Molecular alto
- No atraviesan la MP
- Protegen arrugamiento de la MP
PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN
Determinación de parámetros para
criopreservación
1. Obtención de reproductores
2. Inducción al desove y colección de las muestras (evaluación de los
gametos: motilidad, concentrac., morfología)
3. Determinación del crioprotector adecuado (diluyente,
crioprotector y tiempo de equilibrio)
4. Determinación de la tasa de congelamiento
5. Determinación de la tasa de descongelamiento
6. Evaluación de la calidad de los gametos (motilidad, fertilización,
morfología)
1. Obtención y acondicionamiento de peces

BIC SNP 2 Red izada y luces de atracción Colecta de anchoveta

Anchoveta en LBE Peces en tanques de 300 L. Distribución de peces

Cisneros et al., 2006
2. Inducción de la espermiación y colección del semen

Anesteciado de Determinación de
peces en solución peso de pez.
de MS-222
(40 mg/L)

Extracción de muestra Inyección de

de semen 12 h post- acetato de
inyección. buserelina según
peso.

Cisneros et al., 2006

Condiciones para el almacenamiento del semen
● Baja temperatura
● Sin luz
● Diluyente (extender)= fluido
seminal (no activación)
● Reducir traumas (extracción)
● Altura de columna
● Mantener niveles de Oxígeno
Requisitos para los diluyentes espermáticos para
peces
●Los diluyentes son soluciones acuosas en la cual los
crioprotectantes y los espermatozoides son diluidos antes del
congelamiento.
●Requisitos:
● Inhibir la actividad flagelar
● Evitar el choque osmótico
● Permitir la respiración de los espermatozoides
● Evitar la proliferación bacteriana
● Mantener el pH
● Reducir las acciones mecánicas
Tanques de criopreservación con N Líquido
6. Evaluación de la calidad de los gametos (post-
criopreservación)
●determinación del % de spz mótiles y el tipo de movimiento
espermático
●Evaluación de daños estructurales de las células
●Evaluación del capacidad fecundante (pruebas de
fertilización)
●Evaluación de sobrevivencia y desarrollo larval
(deformaciones en embriones)
EFECTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN EN
ESPERMATOZOIDES

Membrana celular dañada

Curry y Watson, 1992

Reacción acrosómica Posición de mitocondrias y

Bury y Olive, 1993 disposición de microtúbulos
Billard, 1983
Lisis celular y
mitocondrial
Ruptura de
Mediavilla et al., 1995 membrana
Cambios en frecuencia del Bury y Olive, 1993
movimiento flagelar
Rana, 1995

C. Espinoza
EVALUACIÓN DE MORFOLOGÍA EXTERNA ESPERMÁTICA
SUSTRATO ADHEDERENTE

Glutaraldehido 3% Deshidratación en
5 min Alcohol etílico
SED

Secado con CO2 L en

Aparato Pto Crítico
Sandri 780A
Cuantificación de
espermatozoides
con lesiones en:
Cubierto con oro en
acrosoma, cabeza,
fine-coat Ion
pieza media, Sputter JFC-1100,
flagelo. MEB JEOL Modelo J300 JEOL
 Cabeza espermática

Flagelo

Mitocondrias
Acrosoma

Argopecten purpuratus Espinoza, 2006

Algunos ejemplos
● Trucha en la sierra ● Desarrollo embrionario
● https://youtu.be/SdkMG4zEKf ● https://youtu.be/Z2mWEPml6
0 QM