FUNDAMENTOS DE CRIOPRESERVACIN. CRIOPRESERVACIN DE GAMETOS Y TEJIDOS.

PROF. HAYDEE TEMOCHE GARCA

Formacin de cristales de hielo durante la congelacin del agua

Utilizacin de crio protectores

CRIO
PRESERVACIN

El hielo es dinmico

PENETRANTES NO PENETRANTES

Deshidratar la clula

CRIOPRESERVACIN: TCNICAS PARA CONSERVAR TEJIDOS VIVOS A BAJAS TEMPERATURAS

Propiedad coligativa de los solutos

Solucin eutctica (con menor punto de congelacin).

0C

0C

Solucin superenfriada.

Centros de nucleacin de hielo.

0C 0C

Solucin eutctica con ms solutos segregados (an con menor punto de congelacin).

*Lesin por congelacin

Dao mecnico
Centros de nucleacin de hielo intracelulares.

Clula sangunea. Centros de nucleacin de hielo.

Clula sangunea destruida.

*Lesin por congelacin

Dao osmtico (deshidratacin)
Espacio extracelular normosmtico.
Salida de agua intracelular.

Clula sangunea normosmolar.

Centros de nucleacin de hielo.

Clula sangunea deshidratada.

Espacio extracelular hiperosmolal.

Controlar la velocidad de congelacin

Descongelacin

CRIO PRESERVACIN

Medios

Ralentizar el metabolismo celular

*Crioprotectores
Propiedades:

*Debe ser hidrosoluble. *De baja toxicidad. *Que disminuya el punto eutctico de una
solucin dada. *La concentracin de los crioprotectores depender de la tolerancia de la clula al crioprotector.

*TIPOS DE CRIOPROTECTORES
*Penetrantes:
1,2-Propanodiol (PROH)

Dimetilsulfxido (DMSO)
Etilenglicol (EG)

Glicerol

*Crioprotectores
Glicerol y dimetilsulfxido (DMSO)

*Crioprotectores coligativos previenen la

deshidratacin y disminuyendo la cantidad de agua absorbida por los cristales de hielo.

*El DMSO es ligeramente txico. *Actualmente se utiliza DMSO al 5% con

HES al 6% y albmina srica humana al 4%.

*Crioproteccin
Mecanismo coligativo
Espacio extracelular normosmtico.

Molcula de DMSO.

Clula sangunea. Clula sangunea con poco estrs osmtico. Centros de nucleacin de hielo. Espacio extracelular ligeramente hiperosmolal.

*No Penetrantes:
Sacarosa, Glucosa, Dextrosa
Polivinilpirrolidona (PVP)

Dextrano
Polietilenglicol (PEG)

*Crioprotectores
Soluciones salino/glucosadas

*Glucosa, manitol y sorbitol a

concentraciones mayores de 0.1 molar

*Estabilizan la membrana celular durante

la congelacin o deshidratacin.

*La glucosa protege contra la citotoxicidad

celular a altas concentraciones de DMSO.

*Crioprotectores
Protenas

*Aumentan la supervivencia de las

clulas cuando se agregan a la solucin crioprotectora.

*Modifican la viscosidad

y la temperatura de la transicin hialina de la solucin crioprotectora.

*Soluciones crioprotectoras
Hidroxietilalmidn (HES)

*Sustancia polimrica con cadenas de

diferentes pesos moleculares que no penetra la clula de forma libre.

*Protege a la clula formando una capa

viscosa e hialina que retarda el movimiento de agua.

*Crioproteccin
Mecanismo de la envoltura cristalina
Espacio extracelular normosmtico.

Molcula de HES.

Clula Envoltura cristalina sangunea. de HES.

Centros de nucleacin de hielo.

Clula sangunea con ligera deshidratacin. Espacio extracelular hiperosmolal.

UNIDAD DE CONGELACIN

CMARA DE CONGELACIN

UNIDAD DE ALMACENAMIENTO

CORRIDA DE CRIOPRESERVACIN

ALMACENAMIENTO A -80C EN CUARENTENA

ALMACENAMIENTO EN NL -170C

Mtodo 1
Mtodo 2

Alicuotar en pequeos volmenes (menos de 0,5 ml) con un volumen igual de medio de congelacin. Sumergir en nitrgeno lquido (NL).

Aadir el crioprotector y mantener 45 minutos a 4C. Sumergir en NL.

Incubar a 4C. Formar gotas sobre un bloque de CO2 slido.

Mtodo 3

Mtodo 4

Incubar a 4C. Mantener dos horas en vapores de NL.

Mtodo 5

Usar un congelador biolgico programable. Sumergir en NL.

PROGRAMAS DE REPRODUCCIN ASISTIDA

OVOCITO EN ESTADO DE PRONCLEO

OVOCITO MADURO SIN CLULAS DEL CMULUS LISTO PARA SER CRIOPRESERVADO

*Al nacimiento: ovocitos en Fase G2 de la Meiosis I. *Completar la meiosis: crecimiento folicular y

ovocitario: Competencia meitica.

*En otras especies (conejo, cerdo, mono rhesus y

vaca), competencia meitica: tamao folicular.
VITRIFICACIN DE OVOCITOS: VELOCIDAD DE 20000 C/MIN DESCONGELAMIENTO A 37 C (3000-8000 C/min) ACP: ALCOHOLES, AZCARES, SALES, PROTENAS, POLISACRIDOS ESTADOS DE MADURACIN: VG, MII CON OPG (OPEN PULLED GLASS), INTERMEDIO. SOPORTES PARA VITRIFICACIN: PAJUELAS OPG, CLOSED PULLED STRAW, CRYOLOP, MICROGOTAS, PAJUELAS DE 0,25 mL

FUNCIN ENDOCRINA

FUNNCIN REPRODUCTORA

TEJIDO OVRICO

TAMAO Y ESPESOR DE LOS FRAGMENTOS

DENSIDAD DE FOLCULOS PRIMORDIALES Y PRIMARIOS

GROSOR 1-2 mm.

350-400/mm3, antes de los 10 aos;

70-80/mm3, entre 10 y 15 aos;

SUPERFICIE 1X2 mm HASTA 5X10 mm.

30-35/mm3, entre 15 y 34 aos.

CRIOPRESERVACIN DE TEJIDO OVRICO Los folculos primordiales toleran bien la criopreservacin: Tamao. Menor actividad metablica. Carentes de zona pelcida y grnulos corticales perifricos. En los ovocitos, ms grandes, con el ncleo en metafase II de la meiosis, el huso es muy sensible al calor y estrs osmtico .

Lenta: 0,3C/min. Se consigue con la utilizacin de congeladores programables que garantizan un control sobre el proceso.

Normal: entre 1 y 2C/min. Utilizada para la congelacin de un amplio nmero de tipos celulares y tisulares. Adems de los aparatos citados en el punto anterior, se puede utilizar dispositivos pasivos para el enfriamiento, que se colocan en el interior de un congelador convencional a 80C.

Rpida: entre 100 y 200C/min. Se alcanza cuando se sumerge directamente en NL un criotubo conteniendo la corteza ovrica embebida en solucin crioprotectora. La congelacin del tejido en ausencia de lquido no modifica significativamente la velocidad de enfriamiento.

Ultra-rpida: entre 1600 y 2000C/min. Permite la vitrificacin y se puede lograr por introduccin directa del tejido en NL, despus de incubarlo en presencia de la solucin crioprotectora. Se puede conseguir estas tasas de enfriamiento con el tejido incluido en una bolsa (tipo Cryocyte o Hemofreeze, por ejemplo).

PROCEDIMIENTOS DE VITRIFICACIN
Goteo:
incluyendo pequeos fragmentos de tejido embebidos en la solucin crioprotectora en una pipeta Pasteur y depositando gotas sobre el NL, con lo que se generan esferas conteniendo el tejido.

Con soporte: empleando

materiales (lminas metlicas, por ejemplo) para sujetar los fragmentos de tejido durante la exposicin al NL. Mtodo utilizado por Wang y col, ensartando los fragmentos de tejido en una aguja de acupuntura, lo que ofrece la posibilidad de procesar varios fragmentos simultneamente.

Uso de bolsas: ofrece resultados similares en cuanto a la tasa de

enfriamiento. No obstante, estas bolsas son caras y, actualmente, los tamaos disponibles exceden notablemente las dimensiones que la corteza ovrica requiere, por lo que hay que adecuar el tamao del recipiente, desechando la mayor parte del mismo. Por otro lado, los sellados trmicos en las de tipo Hemofreeze (Fresenius Kabi AG) hay que realizarlos con un dispositivo especial, tambin costoso; a diferencia de las Cryocyte (Baxter), que pueden sellarse con aparatos convencionales.

DESCONGELAMIENTO
El mtodo utilizado para la congelacin va a determinar el tipo de descongelacin a emplear. Tomando como punto de partida la temperatura de almacenamiento en la fase lquida del nitrgeno (-196C): 1. Si el tejido se ha congelado con la modalidad lenta o la normal, se requiere una primera etapa de calentamiento lento (a temperatura ambiente durante un minuto aproximadamente) seguida por la inmersin en un bao mara a 37C. 2. En el caso de la vitrificacin, el aumento de temperatura debe ser igualmente ultra-rpido, sumergiendo el tejido en el bao mara inmediatamente. Una vez descongelado el tejido, hay que retirar la solucin crioprotectora. Con este fin, el mtodo ms utilizado es la dilucin progresiva con concentraciones decrecientes de sacarosa e, incluso, del propio crioprotector. Finalmente, el tejido se embebe en un medio de cultivo que bien puede ser el mismo que se emplea durante el transporte al banco tras la diseccin.

Su tasa de supervivencia va a ser inferior a la de los espermatozoides.

Se considera que un embrin ha sobrevivido a la congelacin si tiene la mitad o ms de sus clulas con las que se congel intactas y si tras ponerlo en cultivo se obtiene un embrin en da 3 o da 5-6 de buena calidad.

Cuando un embrin sobrevive intacto sus posibilidades de implantarse van a ser las mismas que en fresco. En el caso de que tras la congelacin el embrin tenga ms de la mitad de sus clulas lisadas, tendr menos posibilidades de implantar.

Slo se podr llevar a cabo con un congelador programable y un buen protocolo.

TASAS DE SUPERVIVENCIA PARTICULARES Y LOS COMPONENTES PRINCIPALES DE SUS MEDIOS DE CONGELACIN:

Zigotos: 95% --> PrOH + sacarosa Embrin en da 2: 75% --> PrOH + sacarosa Embrin en da 3: 60% --> PrOH + sacarosa Embrin en da 5-6: < 50% --> Glicerol + sacarosa

CONSERVACIN A TEMPERATURA DE AMBIENTE

MEDIO DE SOLUCIN BUFFER FOSFATO + 10% SUERO. LA VIABILIDAD EMBRIONARIA DECRECE DESPUS DE 12 HORAS. (PALMA Y BREM, 1993).
REFRIGERACIN EMBRIONES BOVINOS EN MEDIO NO NUTRITIVO (0-4 C) NO MS DE 24 HORAS.(REFSDAL Y COL., 1988). EN MEDIO PBS Y EN PAJUELAS DE 0,25 ml. CONGELACIN ESTNDAR PRIMER TERNERO. (WILMUT Y ROWSON, 1973). MEDIO DE CONGELAMIENTO: PBS + GLICEROL.

MTODO DE CONGELACIN ESTNDAR

Exposicin de los embriones al medio de congelacin (PBS + G) debe realizarse a temperatura ambiente (20 - 22 C). (En un solo paso, de 10 a 30 minutos de duracin (Chupin y Procureur, 1984; Niemann, 1991). Este perodo incluye el envasado de los embriones en pajuelas plsticas. Esto permite realizar ms rpidamente y con mayor precisin la induccin de la cristalizacin o "seeding" (Maurer, 1978). Las pajuelas deben ser colocadas en un equipo de congelacin a 7 C durante 5 minutos para equilibrar la temperatura de las pajuelas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la pajuela con una placa metlica enfriada con nitrgeno lquido (NL); el agente refrigerante del equipo puede ser nitrgeno lquido, alcohol o etanol enfriado por medio de un compresor.

 El no inducir la cristalizacin conduce a la formacin de cristales de hielo bajo un estado de sperenfriamiento y a una elevacin repentina de temperatura (se genera calor latente de 10 - 15 C), resultando un severo trauma fsico que puede daar las clulas (Niemann, 1995).

Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (perodo de estabilizacin) y luego se desciende a una velocidad de entre 0.1 y 0.5 C hasta -30 -35 C para establecer un adecuado balance entre deshidratacin y formacin de hielo intracelular, en este momento las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelacin y sumergidas en NL (Lehnjensen y Greve, 1982). La descongelacin se realiza de manera rpida, sumergiendo las pajuelas en bao mara a 30 35 C durante 2030 segundos.

CONGELACIN RPIDA

EMBRIONES DESHIDRATADOS 2 VECES. GLICEROL + SUCROSA. VIABILIDAD DEPENDE DEL ESTADO DE DESARROLLO EMBRIONARIO.

VITRIFICACIN

CONSERVAR CLULAS, EMBRIONES Y TEJIDOS. UTILIZAN ALTAS CONCENTRACIONES DE CRIOPROTECTORES.

CONGELACIN RPIDA
Mtodo desarrollado por Chupin (1986). Los embriones son deshidratados parcialmente como ocurre en el mtodo estndar, luego se les deshidrata nuevamente colocndolos en una solucin mixta de glicerol y sucrosa. Esta segunda deshidratacin deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rpidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello del termo de nitrgeno, durante 5 minutos, posteriormente son sumergidas al NL. Los resultados obtenidos fueron dispares, segn el estadio de desarrollo del embrin congelado. Martino y col. (1996) realizaron modificaciones, congelando ovocitos en gradillas de microscopio electrnico con 1 l de EG sumergindolas inmediatamente en NL. Obteniendo tasas de sobrevivencia semejantes a los de ovocitos expuestos al EG, pero sin congelamiento.

VITRIFICACIN

La vitrificacin es un proceso fsico de solidificacin utilizado para conservar rganos, tejidos y embriones. La solucin vitrificante (SV) lleva incorporado crioprotectores en alta concentracin. Al ser enfriada no cristaliza, sino que se torna viscosa y pasa del estado lquido a un estado slido no estructurado similar al vidrio, tomando de ah su nombre. Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersin en NL no requiere ms de 10 minutos (Fahy y col., 1984; Rall y Fahy, 1985).

VITRIFICACIN Durante el proceso de vitrificacin, el embrin est sometido a deshidratacin. Esto se debera a que a medida que desciende la temperatura, se va formando mayor nmero de cristales de hielo provenientes de agua pura intracelular, y as la concentracin del soluto va aumentando en los espacios que an no se congelan. Este choque osmtico es conocido como "efecto solucin", y puede llegar a ser daino para la sobrevivencia del embrin (Scheider y Mazur, 1984), debido a la prdida del equilibrio de las soluciones intra y extracelulares, respuestas qumicas y osmticas de las clulas a dichos efectos.

Para obtener buenos resultados se deben tomar en cuenta los siguientes factores: Volumen de la muestra, Concentracin de crioprotector, Mtodo de adicin, Temperatura y tiempo de equilibrio, Solidificacin, Tasa de enfriamiento y cambios en el volumen (Arav y col., 2000), debido a que estos factores estn estrechamente relacionados con la permeabilidad y la toxicidad del crioprotector (Miyake y col., 1993).

El mximo dao en el embrin durante el enfriamiento ocurre de -15 a -16 C debido a la fase de transicin de la membrana lipdica. Esta fase se ve afectada por la fusin de los liposomas afectando el termocomportamiento de las membranas en la transicin de lquido a gel (Zeron y col., 2000) y la velocidad de penetracin de los crioprotectores (Thompson, 1997; Pugh y col., 2000). El dao celular incluye prdida de microvellosidades, disrupcin de la membrana plasmtica, cambios mitocondriales, hinchamiento del retculo endoplsmico, prdida de uniones entre clulas as como fractura de zona pelcida (Edashige y col, 1999; Ohboshi y col., 1998).

 Antes de la vitrificacin, los embriones deben ser equilibrados con el crioprotector a temperatura ambiente. La metodologa descrita por Sheffen y col. (1986) indica que la exposicin a la solucin de equilibrio (SE) (10% G + 20% PG en PBS) debe realizarse a temperatura ambiente (20 C), durante 10 minutos y la exposicin a la SV (25% G + 25% PG) a 4 C. Dobrinsky y col. (1991) deshidrataron al embrin en SE (10% G y 25% PG) por 7 minutos a 20 C, pasando a SV (25% G y 25% PG) manteniendo la misma temperatura hasta introducirlo al NL.

 Dochi y col. (1990) y Kasai (1996) equilibraron mrulas y blastocistos bovinos (10% G + 20% 12 Propanodiol) durante 10 minutos, luego los expusieron a SV (25% G + 25% 1-2 Propanodiol + sucrosa 1M en PBS), inmediatamente despus de cerrada, la pajuela se introdujo lenta y progresivamente en el NL para que se produzca simultneamente la vitrificacin de los compartimentos extra e intracelulares, lo que posibilit transferir los embriones a campo. Utilizando estas soluciones se obtuvo porcentajes de preez del 50%, demostrando que son soluciones estables con poca tendencia a cristalizar durante el enfriamiento.

Sommerfeld y Niemann (1999) vitrificaron embriones bovinos producidos in vitro (IVP) con EG 1.5 1.8 M, teniendo porcentajes de desarrollo del 42%.

Dochi y col. (1995) utilizaron 40% EG, 20% PVP y 11,3% trealosa, para determinar la toxicidad de la vitrificacin con relacin a la temperatura y tiempo de exposicin. El tratamiento fue llevado a cabo a 20 C, durante 5 minutos, en PBS, obteniendo tasas de desarrollo del 84%.

Rall y Fahy (1985) y Massip y col. (1987) vitrificaron embriones de ratn de 8 clulas, stos se equilibraron progresivamente a 4 C, con DMSO 20.5%, acetamida 15.5%, PG 10% y PEG 6% en PBS Dulbeco modificado, luego se sumergieron en NL.
Los embriones sobrevivieron despus de ser cultivados in vitro y se obtuvieron nacimientos vivos en un 39.1%.

 Vajta y col. (1996) equilibraron embriones de 7 das en SE al 50% (12.5% EG y 12.5% DMSO + 75% PBS) a temperatura ambiente durante 5 minutos, fueron transferidos a SV al 100% (25% EG y 25% DMSO) a 4 C durante 20 segundos y posteriormente sumergidos en NL, obteniendo altas tasas de preez con blastocistos tempranos.
Dhali y col. (2000) utilizaron una combinacin de EG 3.5M y DMSO 3.4M con un tiempo de equilibrio de 3 minutos obteniendo tasas de desarrollo del 69%.

Yang y col. (2000) probaron la adicin de PVP (10%) y Trealosa (0.3M) obteniendo porcentajes de preez del 50% en embriones producidos in vitro y 55% en embriones producidos in vivo.

La tcnica descrita por Vajta y col. (1996) ha sido usada para vitrificar embriones posterior a la biopsia, para un eventual uso en el sexaje de embriones (Vajta y col., 1996b; Vajta y col., 1997a), sin afectar el desarrollo hasta blastocisto sobre los controles.

La misma tcnica se ha usado tambin para vitrificar embriones posterior a una eclosin asistida de los blastocistos (Vajta y col., 1997) sin afectar el desarrollo posterior sobre los controles.

Saito (1994), Saito e Imai (1997), Donnay y col. (1998) vitrificaron blastocistos de bovinos en tres formas: 1) 5 minutos (Sucrosa 0.1M, Xilosa 0.1M, PG 1%, G 10%,.); 2) 5 minutos (Sucrosa 0.1M, Xilosa 0.1M, PG 1%, Glicerol 10%, EG 10%); 3) 1 minuto (Sucrosa 0.1M, Xilosa 0.1M, PG 1%, G 10%, EG 20%), en Dulbeco-PBS a temperatura ambiente y posteriormente sumergidos en NL. Obteniendo tasas de desarrollo del 72%, 88,9% y 71% respectivamente.

DESCONGELAMIENTO 1. Exponiendo las pajuelas a temperatura ambiente durante 10 segundos antes de colocarlas en bao Mara 30-35 C, 20-30 segundos (Rall y Meyer, 1986). 2. En sta debe estar presente un agente permeable extracelular como la albmina srica bovina (BSA) que proteja y estabilice las membranas celulares para que no se detenga el transporte de agua a travs de stas, evitando que la clula sufra lisis durante la difusin del crioprotector y dao en la capa trofoblstica (Saha y col., 1996; Massip y col., 1987).

REMOCIN DEL CRIOPROTECTOR

1. Los crioprotectores pueden ser removidos de los embriones en tres y seis pasos en forma escalonada, hasta lograr una concentracin final de PBS sin crioprotector. 2. Saito (1994) utiliz dos pasos sucrosa 0.5M. y 0.25M, manteniendo al embrin durante cinco minutos en cada una.

REMOCIN DEL CRIOPROTECTOR

3. El embrin tambin puede transferirse en forma directa. Leibo (1984) desarroll tcnicas que permiten extraer el Glicerol dentro de la pajuela, modificacin conocida como "mtodo de un solo paso en pajuela", donde la variacin radica en la disposicin de las distintas soluciones (0.24M sucrosa, 1.4M G con el embrin y 0.25M sucrosa en PBS divididas las soluciones por columnas de aire).

Esta tcnica permite transferir embriones congelados a campo sin necesidad de equipos y laboratorios muy costosos, obteniendo tasas de preez que oscilan entre el 30 y el 50 %. Cuando el Glicerol es extrado dentro de la pajuela, los porcentajes de preez se pueden ver afectados por prescindir de la evaluacin morfolgica (Niemann, 1991).

SOPORTES PARA EL CONGELAMIENTO

En los ltimos trabajos realizados en vitrificacin se ha intentado reducir al mximo el dao celular, por los crioprotectores, su concentracin y su volumen. Esto llev a Vajta y col. (1997, 1998) a ensayar una tcnica de vitrificacin denominada OPS (Open Pulled Straw) que consiste en adelgazar una pajuela plstica de 0.25 ml, calentndola sobre una platina y estirndola en su parte central hasta que su dimetro interior llegue a 0.7- 0.8 mm. Luego de enfriada la pajuela es cortada en su parte ms delgada. El embrin es recogido por la parte ms fina de la pajuela mediante capilaridad y luego esta es inmediatamente sumergida en NL. Embriones de 8 das sobrevivieron al cultivo en un 81% utilizando este mtodo.

SOPORTES PARA EL CONGELAMIENTO

Kong y col. (2000) vitrificaron en una ultra mini pajilla (1.0 0.8 mm de dimetro) para reducir el dao por el alto volumen de la SV, obteniendo tasas de desarrollo a la descongelacin y cultivo del 72%.
Se utilizan diferentes tipos de contenedores para vitrificacin de embriones, como son las gradillas de cobre para microscopio electrnico (Martino y col., 1996) y las mallas de nylon (Matsumoto y col., 2001). En estos contenedores se logr vitrificar de 15 a 65 embriones a la vez. Los resultados obtenidos utilizando estas tcnicas de vitrificacin fueron similares a sus controles y ofrecen una nueva alternativa para criopreservar gran nmero de embriones.

TENER EN CUENTA QUE.

El resultado de la vitrificacin est condicionado previamente por dos factores. La calidad del embrin y el estado de desarrollo embrionario. Cuando se congelan embriones de calidades muy buena y buena se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular. La etapa del desarrollo ms apropiada para la vitrificacin de embriones es mrula compacta a blastocisto expandido, siendo ms sensibles a las bajas temperaturas los embriones producidos in vitro.

TENER EN CUENTA QUE.

Para elegir el mejor mtodo de vitrificacin se deben tomar en cuenta diferentes factores como son los siguientes: crioprotectores a utilizar, estos deben manejarse en adecuada concentracin, adicionarse al embrin en forma creciente y a tiempos determinados, en combinacin con otros crioprotectores que sean de baja toxicidad, para que sean utilizados con el menor volumen posible, temperatura de adicin y con tasas de enfriamiento lo suficientemente rpidas para evitar la prdida del equilibrio osmtico y causar dao celular que comprometa la viabilidad embrionaria.