CRIOPRESERVACIÓN DE GAMETOS Y EMBRIONES

Antecedentes históricos

Criopreservación
Procedimiento por el cual células o tejidos son almacenadas a temperaturas bajas o extremadamente
bajas, con el objeto de mantener su viabilidad y funcionalidad sin alteraciones a lo largo del tiempo.
*viabilidad y funcionalidad: aspectos morfológicos. si se mantiene bien la estructura lo mas probable es
que estas células desarrollen su función de forma normal → se busca que no hayan daños estructurales
*diferencia entre conservar espermatozoides a temperaturas de refrigeración que a temperatura de
congelación → el tiempo cambia, en congelación el tiempo de almacenamiento es ilimitado.
Fines reproductivos: espermatozoides (donde mejor resulta, mas estudios), ovocitos, embriones, tejido
gonadal.
Objetivos
- Almacenamiento (permite almacenar células)
- Transporte (transportar células en otros lugares, para procedimientos de mejora genética, semen
importado, etc.)
- Comercialización
Principales daños celulares causados por la criopreservación
- Alteraciones morfológicas
- Alteraciones químicas: se altera la concentración de iones en el citoplasma de la celula, perdida
de agua y iones.
- Alteraciones funcionales: ej. espermatozoide se mueve mas lento, perdida de motilidad
progresiva, movimiento erratico, etc.
Estos 3 tipos de alteraciones están íntimamente relacionadas. Hay un porcentaje importante de células
que experimientan estas alteraciones, es importante intentar reducir al máximo estas alteraciones.
Factores que influyen en el éxito de la criopreservación

- Material a preservar (embrión, ovocito, espermatozoide, GV, etc.). Calidad. Tener en cuenta por
ej. que tipo de ovocito se esta preservando (ovulado, de reserva ovárica), etc. son estructuras
distintas. o que tipo de embrión (dos células, 4 celulas, morula, blastocito), etc.
- Método de criopreservación → considerar la posibilidad de solo refrigerar, o criopreservar con
distintos métodos: protocolos de congelación rápida, lenta, ultra rápido, etc.
 - Crioprotectores (que tipo, concentración y tiempo de exposición). Permeables (glicerol, protegen
dentro de la celula) o no permeables (se quedan fuera de la celula).
- Velocidad de enfriamiento
- velocidad de descongelamiento
No existe un protocolo único para la criopreservación para espermatozoides y ovocitos. Hay algunos
protocolos clásicos, pero en general existen muchas variaciones.
Características celulares y moleculares
Espermatozoides:
- Alta relación superficie volumen: tiene mucha superficie y poco volumen. influye en que cuando
ponemos el espermatozoide en un medio y la interacción con los componentes de este medio será
fácil. ej. facilidad para que crioprotectores permeables interactúen con las distitntas partes de la
célula (tiempo breve)
- Celula altamente diferenciada
- Nucleo compacto y empaquetado: poco probable que este sufra alteraciones, protegido

- Fácil estimación de viabilidad. fácil de ver si sobrevivió o no al congelamiento/refrigeración (con

ovocito es más difícil, hay que esperar)
celula pequeña, con muy poco citoplasma → fundamental para el éxito de las técnicas de preservación.
En general los espermatozoides responden bien al proceso de crio preservación.
Ovocitos y embriones
- Menor relación superficie volumen: volumen alto. cualquier cosa que ponga en contacto con el
ovocito tardará mucho más tiempo en interactuar con toda la celula.
- Cromatina en diferentes estados del ciclo celular: componentes del citoesqueleto estan trabajando
de manera vertiginosa en estas distintas etapas del desarrollo embrionario temprano, por lo tanro
estos elementos son muy susceptibles a su rompimiento, etc.
- Aparato micro tubular (huso) sensible
- Cubierta extracelular: membrana plasmática rodeada por una cubierta extracelular de
glicoproteínas (zona pelúcida), barrera adicional para que puedan penetrar los componentes
crioprotectores.
volumen celular → congelar ovocito/embriones es más complicado que congelar espermatozoides
¿Porque el frio preserva las células?
Las reacciones químicas dependen de la temperatura.
- Todas las reacciones químicas tienen una curva que relaciona el tiempo de la reacción y la
formación de producto
- Si la temperatura va bajando la velocidad empieza a
disminuir → el metabolismo de la celula empieza a disminuir.
metabolismo está llegando a un estado basal (no se
consume ni gasta mucha energía)
- Metabolismo y reacciones químicas no se detienen
(preservación no es ilimitada), pero si se enlentecen.
- A 0 grado la curva de formación de producto se hace
“asíntota” con el eje de x → no hay formación de producto,
se detienen las reacciones y el metabolismo (congelación).
Métodos de preservación a bajas temperaturas
- Refrigeración (no baja de los 0 grados, 4°C)
- Congelación -196°C (la que mas se utiliza, la menor temperatura que se puede obtener, con
nitrógeno líquido)
Entre más baja la temperatura, mas baja el metabolismo, y más se puede extender la vida de las células
que se están preservando.
Ventajas de refrigeración
- Mayor margen de tiempo de utilización en comparación a células frescas. al refrigerar se extiende
este tiempo de vida hasta 1 semana
- Transporte de gametos a lugares con cierta distancia
- Bajos costos de procedimientos y materiales (no se necesita nitrógeno liquido, ni tantos elementos
crioprotectores).
- Alteraciones son menos drásticas que las alteraciones que provoca la congelación
Refrigeración y desrefrigeración
Se usa semen lavado → es importante eliminar el plasma seminal (si bien es importante para el transporte
en el tracto genital de la hembra, tiene componentes que pueden ser nocivos para los espermatozoides
si permanecen ahí por mucho tiempo). Para esto se centrifuga el semen y se elimina el sobrenadante
(que seria el plasma seminal).

Este semen lavado se suspende en una solución (solución tipo: tris-fructosa, ácido cítrico y yema de
huevo):
- Tris sustancia buffer, propiedades osmóticas del suero pero con otros componentes que la hacen
mas compleja
- Secreciones de glándula vesicular tienen fructosa y ácido cítrico, importantes para el aporte
energético, espermatozoide debe tener esto en su medio (no detienen su movimiento).
- Yema de huevo tiene macromoléculas, para proteger al espermatozoide del shock térmico
(protegen por fuera, se vinculan con su membrana).
Depositar tubo en vaso con agua a 20°C y esto al refrigerador → agua como amortiguador térmico y que
el cambio de temperatura no sea tan brusco (baje paulatinamente). Espermatozoides refrigeraos se
siguen moviendo, aunque más lento y menos. Su metabolismo no se detiene.
Pasa el tiempo y se saca el tubo de refrigeración y se ponen en una estufa → semen listo para ser
utilizado. *Centrifugarlo solo para fecundación in vitro, IA depositarlo directo a tracto genital de la hembra.
*Refrigeración: si bien baja el metabolismo, disminuyen reacciones químicas, existe un daño denominado
“daño por frio” → lípidos en espermatozoide se mantienen con cierta fluidez y funcionalidad cuando
están a una temperatura normal con la que se desenvuelven los espermatozoides. Cuando disminuye la
temperatura estos lípidos se empiezan a agregar y se forman poros en la membrana plasmática → se
alteran los elementos de la membrana y además el citoesqueleto (por lo tanto, también el interior de la
celula).
Daño por frio ocurre cuando espermatozoides son solo refrigerados, esto se exacerba cuando hay
congelación. En ovocitos también se han hecho protocolos de refrigeración pero no han resultado exitosos
(por lo menos en spp domésticas, si en peces y anfibios → huevos muy grandes, mucho mas complicado
congelarlos, no hay otra opción más que refrigerarlos).
Congelación
Preservar un material biológico a temperatura subcero, en condiciones tales que su integridad celular se
mantenga lo menos alterada posible. Aquí es donde la integridad sufre los daños mas importantes (en
refrigeración daños morfológicos son casi imperceptibles)
Desventajas

- Costo
- Disminución fertilidad, sobrevida
- Disminución de la motilidad en el caso de los espermatozoides
- Capacitación → daños que se asemejan (específicamente espermatozoides) a lo que ocurre en el
proceso de capacitación, perdida de alguna de estas proteínas → criocapacitación, tener en
cuenta en el momento de la fecundación (ej. en fecundación in vitro no hacer procedimiento de
capacitación, pues ya ocurrió. en IA tratar de llegar lo mas cercano posible al sitio de fecundación
etc.
Esquema para congelar una celula
Para que celula pueda mantener su morfología
debe estar en un medio isotónico.
Temperatura empieza a bajar de manera
progresiva → lo primero que se congelará será el
medio (agua), no la celula. Esta agua genera
cristales de hielo.

Como la baja de temperatura no es violenta (es progresica) cuando se forman estos cristales de hielo
fuera de la celula y no se congela todo el medio extracelular, el medio remanente que queda entre los
cristales se vuelve hipertónico (perdió el agua porque se congelo).
En un medio hipertónico el agua dentro de la celula empieza a salir. A la temperatura cero tendremos una
célula completamente deshidratada (nivel de deshidratación depende de la velocidad de congelamiento
→ debe ser lento, paulatino).
No es bueno que queden estas moléculas de agua adentro de la celula → reemplazar el agua por un
líquido que al congelarse no genere estas estructuras tan dañinas (en forma de cristales) para la celula
→ Crioprotectores permeables: sustancias que entran a la célula, reemplazan el agua, de tal forma que
cuando llega el punto de congelación estas se congelan dentro de la celula (mantienen volumen y en
forman estructuras esféricas, que no sean tan dañinas para la celula).
Para que estos crioprotectores permeables ingresen a la celula (tienen cierto nivel de semipermeablidad),
como facilitamos que salga agua de la celula sin necesidad de aplicar congelación de inmediato →
Crioprotectores no permeables: si pongo en solución al mismo tiempo crioprotectores permeables y no
permeables, los crioprotectores no permeables ejercerán el efecto osmótico fuera de la celula para que
salga el agua del interior de la celula. Crioprotectores permeables difunden al interior de la celula
(reemplazando el agua que se perdió por el crioprotector no permeables)
*En refrigeración se usan crioprotectores, pero no permeables (fructosa, etc)
Membrana plasmática → estructura semipermeable. alta permeabilidad: agua, un poco menos el glucerol
(por este nivel están los crioprotectores que se consideran permeables), menos permeable glucosa,
azucares (se consideran no permeables). baja permeabilidad: electrolitos, gasto energético para pasarlos.
Crioprotectores
Permeables: Impermeables:
- Glicerol (mas utilizado) - Sacarosa
- DMSO (dimetilsulfóxido) - Glucosa, fructosa (mas utilizada)
- Etilenglicol - Ficoll

Crioprotectores: permeables
- Bajan el punto de congelamiento de la solución intracelular. Estos componentes tienen un punto
(temperatura) de congelamiento menor al del agua → da mas tiempo para que puedan ocupar
mayor espacio dentro de la celula
- Previenen la exposición de la celula a concentraciones elevadas de electrolitos. daño químico →
perdida de agua implica un aumento de concentración de electrolitos al interior de la celula como
está ingresando otro líquido, las concentraciones de electrolitos se mantienen dentro de
parámetros normales
- Interactúan con la membrana plasmática → disminuyen los efectos provocados por el
enfriamiento (daño por frio), al integrarse a la membrana
Crioprotectores: impermeables
- Aumentan la concentración extracelular del soluto
- Aumentan el gradiente osmótico y promover deshidratación celular
Diluyentes de congelación

Lo mismo que se usa para refrigeración, hasta crioprotectores permeables.

El agua cuando se congela no deja de moverse, no queda en una estructura única. modificaciones de
los cristales de hielo entre 0 y -30°C (hielo dinámico) → modificaciones al interior de la celula.
Métodos de congelación
Lento: descenso lento, gradual y muy controlado de la temperatura, hasta alcanzar la deseada de
acuerdo al protocolo de ejecución (- 30º centígrados o - 80º centígrados comúnmente). Se requiere un
congelador programable (van regulando este descenso de la temperatura).
- congelación lenta → darle mas tiempo a la celula para que se deshidrate y se incorporen los
crioprotectores permeables.
Rápido: inmersión inmediata en nitrógeno líquido, el agua se congela en forma rápida, generando
cristales de hielo, los que causan daño en el material intracelular.
Vitrificación…
Un protocolo de congelación implica:
1. Exposición y equilibrio del material biológico a agentes crioprotectores.
2. Enfriamiento, congelación y almacenamiento.
3. Descongelamiento.
4. Dilución y eliminación del agente crioprotector (si se usa para fecundación in vitro)
Además, se debe contar con ensayos funcionales que permitan evaluar, tanto in vitro como in vivo, el
material biológico en cada etapa.
Protocolo tipo:

Semen lavado y diluyente igual a refrigeración. Luego se agrega el crioprotector permeable (o también
diluirlo directamente con crioprotector permeable). Protocolos de descongelación también pueden ser
lentos (en la maquina) o rápidos (en agua a 35 – 37° por un cierto tiempo → 37° por 37 segundos).
diferencias con refrigeración: crioprotector permeable, envasado (pajuelas) y obviamente la congelación.
Suplementos a los diluyentes de congelación
- Antioxidantes: SOD, GSH, CAT, acido ascórbico, vitamina D, trolox, etc.
- Factores de crecimiento
- Proteínas seminales (en algunas spp algunas proteinas especificas tiene una protección que
puede ser utilizada)
- Proteínas anticongelantes (propias de spp que viven en bajas temperaturas)
Criopreservación en ovocitos y embriones
Algunas funciones que se aceleran en el ovocito cuando este es sometido a criopreservación
- Reacción cortical acelerada: Bloqueo a la poliespermia → modificaciones de la zona pelúcida
→ endurecimiento de la zona pelúcida. Esto se acelera con la congelación, por lo tanto, ovocito
crio preservado tiene menos posibilidades de ser atravesado por el espermatozoide. tambien
afecta el paso de los crioprotectores permeables
- Problemas a nivel microtubular, por des ensamblaje de los microtubulos (sobre todo a nivel de
placa metafásica) → desorganización microtubular, generación de múltiples centros organizadores
de microtúbulos → segmentación defectuosa.
Agentes crioprotectores permeables → si bien ejercen efecto positivo (ocupar volumen del agua dentro
de la celula y no formas cristales de hielo), hay un problema: son componentes citotóxicos → si estan en
contacto con celula por tiempo muy prologado causan daño por toxicidad.
Por lo tanto, el tiempo de contacto de la celula con estos crioprotectores debe ser el suficiente para
proteger, pero no puede ser ilimitado → esta velocidad con que se debe vincular celula con crioprotectores
permeables fue el fundamento para el desarrollo de una técnica de crio preservación que si ha resultado
en ovocitos y embriones humanos: vitrificación
Vitrificación: un método alternativo
Es un proceso que se aumenta la viscosidad del medio interno, hasta un punto en que se hace solido
(tipo vidrio).
*La concentración de crioprotectores normalmente no supera los 10% (van por 5%), entendiendo que has
tiempos de congelación en las que es perjudicial que las células estén en contacto con el crioprotector.
Ovocitos y embriones: considerando el volumen mayor, y posibilidad de formar cristales de hielo en este
gran citoplasma es mucho mayor. Se confeccionan medios con alta concentración de crioprotectores
(llegando hasta un 60% de crioprotector permeable) → por ende debe ser muy rápido. (la celula no
puede permanecer por mucho tiempo en un medio con tanto crioprotector).
Crioprotectores en alta concentración con el propósito de que entren lo más rápido posible a la celula y
ocupen el volumen.
Ventajas de la vitrificación

como no ocurre una congelación paulatina, daño por frio no es tan evidente.
Desventajas de la vitrificación
- Daño osmótico y citotoxicidad del crioprotector → debe ser un protocolo muy rápido.
Variables que hay que tener en cuenta:

Open pulled Straw vitrification: protocolo tipo (no es el único), se provo mucho en bovinos.

Placa de cultivo con ovocitos. se prepara

otra placa de cultivo en paralelo donde se
pone el mismo liquido de cultivo del
ovocito, pero con el crioprotector al 20%,
y asi con una al 40%, otra al 60% (luego
se repite o puede aumentar aún más).

Se toman ovocitos con una pajuela abierta, se aspiran (con liquido) y se depositan en placa al 20% y se
espera un tiempo muy breve, que muchas veces no alcanza a superar los 30 segundos. Se vuelven a
aspirar y se pasan aplaca con crioprotector al 40% y se espera otros 30segundo, esto se repite con la
placa al 60%. luego de esto se sumerge inmediatamente en un termo con nitrógeno y se pasa a
congelación. Todo esto se realizó sin ningún tipo de enfriamiento, en la temperatura a la cual se
desenvuelven los ovocitos (37°C).
El riesgo es la alta concentración de los crioprotectores → son citotóxicos. por eso debe ser rápido.
Cuando esto se descongela, se saca pajuela y se deposita en capsula de cultivo a 37° y se deja ahí hasta
que se descongela y luego se cambia el medio 8para sacar todos los remanentes de crioprotector.
congelación lenta vs vitrificación: sobrevivencia, ovocitos divididos embriones de buena calidad,
blastocitos normales, mayor con vitrificación. ovocitos con anomalías mucho menor con vitrificación →
todos los antecedentes apuntan a que esta es una técnica completa, indicada para poder criopreservar
ovocitos y embriones, por el volumen que tienen → en el caso del ovocito, esta es la técnica que se
utiliza.
Criopreservación de tejido ovárico
También existen protocolos de congelación de tejidos gonadales. Programas de almacenamiento,
conservación de recursos zoogenéticos → aplicar biotecnologías reproductivas en especies en riesgo de
extinción.
- Congelación de trozos de ovarios con folículos (secundarios o antrales…), también se utiliza en
base a técnicas de vitrificación.
*¿Cuánto tiempo pueden sobrevivir congeladas las células? → nacimiento de una persona a partir de un
ovocito que estuvo criopreservado por mas de 14 años.