VAGINA ARTIFICIAL

DILUCIÓN
DE SEMEN
El semen recién recolectado puede ser utilizado
inmediatamente para inseminar (semen fresco),
sin embargo para favorecer su preservación
durante el manejo y el almacenamiento, puede
mezclarse con diferentes medios denominados
“diluyentes”.

Siendo indispensable si el semen será

preservado en refrigeración o congelación.
Objetivos de dilución del semen:

• Añadir substancias nutritivas (azúcares), crioprotectoras

(yema de huevo, glicerol, etilenglicol, DMOSO) y
amortiguadoras que evitan cambios de pH (Tris, citrato de
sodio, fosfato de sodio, etc.), para incrementar la vida
media de los espermatozoides una vez fuera del
organismo.

• Restringir el crecimiento de microorganismos al agregar

antibióticos y otros antimicrobianos.
• Aumentar el volumen para preparar la cantidad de dosis
calculada.
Los diluyentes pueden clasificarse como de
corto, mediano y largo plazo, dependiendo del
tiempo que se requiera conservar al semen.

La tasa de dilución dependerá de la

concentración espermática del eyaculado.

Ejemplo: En el bovino, la concentración final

deberá ser de 15-20 x106 millones de
espermatozoides en 0.25 o 0.5 ml (tamaño de la
pajilla).

Si el semen va a refrigerarse o prepararse para

ser congelado, la temperatura del semen
diluido debe descender paulatinamente a una
tasa de 0.5 °C/min hasta alcanzar los 5º C
(curva de descenso de temperatura).
El semen de la mayoría de especies animales; sin diluir y
mantenido a temperatura ambiente se conserva algunas
horas.

1. Si la muestra se mantiene en un baño María a 37 °C, el

semen fresco puede mantener su viabilidad hasta 24 horas
tras la obtención.

2. La refrigeración del semen a 4ºC prolonga su vida fértil

durante varios días e incluso una semana, antes de refrigerar
el eyaculado obtenido debemos mezclarlo con un diluyente
isotónico para aumentar el tiempo de vida del semen y para
protegerlo contra el choque térmico y la acción de
contaminaciones bacterianas.
Mecanismo de acción de los componentes de los
diluyentes

• Agentes crioprotectores: sustancias hidrosolubles y de baja

toxicidad que disminuyen el punto eutéctico (punto de
solidificación) de una solución dada, previniendo de esta forma el
estrés osmótico.
El descenso del punto eutéctico implica que se alcanzará la
máxima concentración de solutos a una menor temperatura, de
forma que los espermatozoides estarán más deshidratados y el
estrés osmótico al que estarán sometidos será menor.

Es decir: los agentes crioprotectores previenen la formación de

hielo intracelular debido a la mayor deshidratación celular.

Los crioprotectores pueden clasificarse también en agentes no

penetrantes y penetrantes de acuerdo a la permeabilidad
celular.
Crioprotectores no penetrantes
Sustancias de alto peso molecular, efectivas a
velocidades altas de congelación.

Actúan promoviendo la rápida deshidratación

celular y suelen usarse asociados a los agentes
penetrantes.

Ejemplos más utilizados: sacarosa, glucosa,

dextrosa y dextrano.

Algunos son polímeros que forman puentes de
hidrógeno con el agua, reduciendo la actividad de
agua a una magnitud mucho mayor.
Las células inicialmente se deshidratan
para compensar la fuerza osmótica
inducida por la presencia de los
crioprotectores y después se hidratan. La
definición de los parámetros biofísicos
de cada célula y el estudio de la
interacción con los crioprotectores
Crioprotectores penetrantes

Sustancias permeables a través de la membrana debido

a su de bajo peso molecular.

Protegen a la célula de las lesiones producidas por

las congelaciones a velocidad lenta.

*El espermatozoide es permeable a estos agentes,

pero su permeabilidad no es de la misma magnitud
a la del agua. Atraviesan la membrana plasmática
reemplazando el volumen de agua que se
encuentra dentro de la célula.

Evitan los daños producidos por la formación de

cristales de agua en el interior de la célula y mantienen
el volumen celular, evitando el colapso de los
espermatozoides por una deshidratación excesiva.
Criopreservación
Tecnología empleada desde hace aproximadamente 50 años.

Las diferencias fisiológicas de las células espermáticas entre las especies e

incluso entre individuos, aún representa un problema sin resolver.

Por ello pocas técnicas permiten supervivencias elevadas.

Ventajas: apoyo a la conservación de las poblaciones vivas; siendo

complemento de un programa de conservación más amplio. El material
genético es una seguridad en caso de catástrofe, o si un problema
genético aparece como consecuencia de la acumulación de genes
recesivos nefastos para la población viva.

El primer requisito para la criopreservación es la disponibilidad de

instalaciones que permitan el almacenamiento de las muestras en
nitrógeno líquido.
Vitrificación
La vitrificación es un método de criopreservación ultra
rápida que consiste en la exposición directa de la célula en
nitrógeno líquido o a sus vapores, evitando así la
cristalización del agua intracelular y el crio daño.

Este método no utiliza crioprotectores permeables, que

pueden implicar riesgo mutagénico, y se realiza en
espermatozoides obtenidos por métodos de selección
espermática, lo que garantiza una alta motilidad, y al estar
desprovistos de plasma seminal disminuye el riesgo de
transmisión de infecciones virales y bacterianas .
CRIOPRESERVACIÓN

DILUCIÓN Y ADICIÓN DEL DESCONGELACIÓN

CRIOPROTECTOR CONGELACIÓN ALMACENAJE E INSEMINACIÓN
ENFRIAMIENTO
Y ENVASADO

Proporción de
Uso reservado Características
Sensibilidad al colesterol
del semen estructurales de
congelado según enfriamiento respecto a los
las membranas
la especie fosfolípidos
Daños causados por el proceso de congelación
La liofilización (freeze- drying; FD) es un método
de preservación en el cual el material es
congelado por sublimación.

El principal objetivo es remover el agua evitando

el crecimiento biológico de agentes
contaminantes o sus recciones químicas.

Inicialmente el proceso se probó con bacterias,

virus y hongos. Después fue empleado con
tejidos animales, fármacos, plasma sanguíneo y
antibióticos.

A partir de 1958 el proceso fue empleado en la

industria de los alimentos, especialmente la
leche, huevos, levadura, café sopa y jugos.
Para la conservación de células espermáticas se empleó desde
hace al menos 60 años con espermatozoides de aves, seguido de
células humanas y de bovino.
Sin embargo el primer éxito obtenido fue en 1998 utilizando
espermatozoides de ratón siendo empleado en conjunto con ICSI.

Ventajas de la liofilización vs la crio-

preservación.

La técnica fue desarrollada en búsqueda de eliminar el

inconveniente del uso del nitrógeno líquido, reduciendo los costos
de conservación a largo plazo (almacenamiento), menor espacio
ocupado, la prevención del daño térmico y la facilidad de
transportarlo ya que en algunos casos es posible no requerir de un
equipo especializado y hacerlo a temperatura ambiente además
de ser más estable durante su comercialización.
Cuando los espermatozoides de mamífero son
liofilizados, pierden su capacidad motil, siendo
incapaces de fertilizar a los ovocitos in vivo e in
vitro. Sin embargo, la habilidad de fertilización es
suplida a través de la técnica de ICSI (Inyección
espermática intracitoplasmática).
Recientemente se ha empleado en
espermatozoides de conejos, rata, primates,
perro, gato, caballo, hámster, ratón, cerdo, toro y
animales de fauna silvestre.
El éxito de obtener crías vivas derivadas de ICSI con esperma liofilizado
es reciente en ratones, ratas, hámster, conejo y caballo, mientras que
en las otras especies los resultados no fueron más allá del blastocisto.
El principal problema es el daño en el ADN que se produce durante el
proceso por la acción de las endonucleasas y las especies reactivas de
oxígeno (ROS). Por lo tanto, se han realizado investigaciones para
refinar el protocolo con el fin de proteger el ADN y mantener la
funcionalidad del espermatozoide.
Las principales fases del proceso de liofilización espermática
Preparación de la muestra con el medio de liofilización
Las muestras de semen pueden ser frescas (semen epididimario o eyaculados completos) o congeladas.
En la especie porcina se utilizan eyaculados completos, en equinos se emplean eyaculados libres de gel, en conejos
se re-suspende el eyaculado directamente en el diluyente de liofilización y en la especie canina utilizan la segunda
fracción del semen recogido, mientras que en bovinos las muestras se obtienen a partir de semen congelado.
Puntos críticos que afectan a la eficacia
de la liofilización de los espermatozoides
La protección del ADN espermático es uno de los puntos
más importantes para el posterior desarrollo de los
cigotos tras la fecundación.
Los protocolos de liofilización se basan en controlar la
interacción entre la temperatura, la presión de vacío, el
tiempo de secado y el periodo de almacenamiento.
Solución de secado
Medio protector de la integridad espermática.
Disminuyendo la fragmentación del ADN espermático
por la actividad de las nucleasas endógenas que
pueden aparecer por daño en la membrana
espermática.
1. Agentes quelantes, como EDTA o EGTA, inactivan la
DNA´asa del espermatozoide.
2. Antioxidantes para bloquear o prevenir el estrés
oxidativo.
3. Azúcares: trehalosa (disacárido no reductor que exhibe
una alta temperatura de transición a hielo y una gran
estabilidad durante el procesado y almacenamiento
brindando protección a las biomoléculas como proteínas,
organelos y cromatina).
4. pH alcalinos para contribuir por la inactivación de las
DNA´asas.
De forma general los medios contienen 50 mM EGTA, 50
mM NaCl, 10 mM de Tris-HCl y 1 mM de EDTA con el pH
ajustado a 8.
*Las endonucleasas que se activan durante la
liofilización o en la previa congelación sin
crioprotectores, son activadas por cationes
divalentes como son Ca2+ y Mg2+, por ello se
emplean secuestradores de cationes (agentes
quelantes) como el EGTA (ethylene glycol-bis (β
aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) y el
EDTA (2,2',2'',2'''-(ethane-1,2diyldinitrilo)
tetraacetic acid).
La primera fase (congelación) está relacionada directamente con
la cantidad de agua presente en la muestra.
El método más sencillo es la inmersión de los viales con la
muestra en nitrógeno líquido durante 20 s o bien
introducirlos en un congelador de -45°C o de -80°C.
Durante la congelación, el agua forma cristales y los solutos
quedan confinados a la región intersticial entre los cristales
de hielo. La temperatura necesaria para congelar
completamente la muestra depende de las características
del solvente y de los componentes de la muestra.
1. El secado primario es cuando el material congelado se
somete a la acción de vacío produciéndose la
sublimación para eliminar el agua residual, perjudicial
para la conservación.

1. El secado secundario corresponde a la desorción o

liberación de gran parte del agua adsorbida. Esta
operación se realiza a temperatura constante y a vacío, lo
que permite especialmente en el secado secundario
eliminar el oxígeno, lo que garantiza la conservación de
productos oxidables, si se guardan en envases
herméticos.
Temperatura y tiempo de almacenaje
Se han mantenido las muestras a 4°C, 25°C, -80°C o
-196°C.

Se ha observado que la conservación a 25°C

reduce la tasa de división y se asocia a un mayor
número de aberraciones cromosómicas y una
mayor incidencia de daño en el ADN que el
mantenimiento a 4°C o a -196°C. Los protocolos
actuales consideran los 4°C como la temperatura
óptima para la conservación a largo plazo de
espermatozoides liofilizados. Algunos
investigadores sugieren que se pueden almacenar
durante al menos 3 meses a temperatura
ambiente.

Los tiempos de almacenamiento de los

espermatozoides liofilizados pueden ser muy largos
(años).
Reconstitución del semen (hidratación de
semen liofilizado)
La muestra se rehidrata con agua de alta calidad (agua milliQ)
observándose que los espermatozoides están inmóviles y
presentan un elevado número de cabezas sueltas, colas dobladas
o con aspecto fragmentado.

Se deben evaluar los posibles daños del ADN así como las
alteraciones de los cromosomas. Aunque las estructuras
generales del espermatozoide se pueden dañar por la
liofilización, el ADN y los factores intracelulares que activan al
ovocito se pueden preservar.
Para evaluar el grado de fragmentación del ADN se han
utilizado distintas técnicas como TUNNEL Assay
observándose un daño del ADN inferior al 5% en los
espermatozoides liofilizados.
El análisis de Birefringencia que permite determinar el
estado del acrosoma; Halomax Kit, donde el tamaño de los
halos indica el nivel más acelerado de la fragmentación del
ADN; Acridine Orange test (AOT) para observar la
estabilidad de la cromatina.
Inyección espermática
intracitoplasmática (ICSI)

Es la introducción directa de un espermatozoide en el

ovocito después de atravesar la zona pelúcida y la
membrana plasmática.
La primera vez que se aplicó la ICSI, se hizo
microinyectando espermatozoides de erizos de mar en
huevos de la misma especie (1962). Posteriormente
Uehara y Yanahimachi (1976), al trabajar con hámster, se
les atribuye la primera experiencia de ICSI en mamíferos.
No fue hasta 1988 cuando se obtuvo por primera vez
descendencia viva como producto de la ICSI en conejos)
y dos años más tarde se consiguió el nacimiento de Los espermatozoides rehidratados tras una centrifugación son
terneros vivos. re suspendidos en el medio para realizar la microinyección.
Realizada la maduración ovocitaria, los ovocitos son
microinyectados con un sólo espermatozoide.

La posición del cuerpo polar (CP) sirve como referente para

evitar dañar la placa metafásica (algunos estudios han
demostrado que la posición del CP durante la inyección afecta
a la fertilización y/o al desarrollo embrionario).
En la mayoría de los mamíferos, para que se lleve a cabo la descondensación nuclear del
espermatozoide y la formación de pronúcleos se necesita la activación del ovocito, sin embargo
existen diferencias entre especies.

Durante la fertilización in vivo, la activación es iniciada por el espermatozoide y es acompañada

por aumentos transitorios en la concentración intracelular de Ca2+..

Los espermatozoides liofilizados son capaces de movilizar el Ca2+ por lo que el proceso de
fecundación está garantizado.

Los distintos métodos que se han empleado para la activación ovocitaria han sido: mecánicos,
químicos o por estimulación eléctrica, dando como resultado un aumento en la concentración de
Ca2+ intracelular