Métodos de conservación

de microorganismos
 Fundamento
En cualquier laboratorio de microbiología es fundamental el mantenimiento y
conservación de las colecciones de microorganismos con las que trabajamos
ya que, obviamente, son nuestro reactivo primordial.

Existen una gran variedad de métodos de mantenimiento y conservación de

los microorganismos cuya utilización va a depender en parte del tiempo
previsto [Mantenimiento → Cortos períodos de tiempo (días) o
Conservación → Largos períodos de tiempo (años)] y en parte de las
características de los diferentes microorganismos (bacterias, hongos, virus,
algas, protozoos).
Los procedimientos de conservación utilizados para
estos microorganismos deben alcanzar 3 objetivos :

• Evitar las mutaciones genéticas (estabilidad genética).

• Evitar que se produzcan contaminaciones durante el proceso.

• Conservar intacta su viabilidad (sobrevivencia de 70-80%).

 Método de conservación a largo plazo

Son los mejores por que paralizan el crecimiento de las células

microbianas sin aniquilarlas, la estabilidad genética es alta.

Congelación y Liofilización
 Conservación por congelación
Se requiere el uso de agentes crioprotectores (DMSO, glicerol, trehalosa). .

La recuperación de las células u organismos así preservados se realizan

ascendiendo la temperatura.

Las temperaturas mas utilizadas son –80 ºC y mediante nitrógeno líquido

entre –150 y –196 ºC.

Se tiene buena estabilidad genética

Notas: Suele ser caro mantener temperaturas

tan bajas
 Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad
celular empleando este método

• Edad de las células:

Para esto se emplean células maduras de inicio de la fase estacionaria de
crecimiento o estados de resistencia en los organismos que lo presenten

• Velocidad de congelación y descongelación:

Se recomienda que ambas sean rápidas.

• Temperatura de almacenamiento
Debe ser a las temperaturas más bajas posibles (en nitrógeno líquido) o
congeladores que alcancen temperaturas menores a -70ºC
• Empleo de agentes crioprotectores:
Un crioprotector es una sustancia que se utiliza para proteger un elemento
biológico de la congelación (evita daño por la formación de cristales de
hielo).

Características:
No es toxico para los organismos
Penetra fácilmente la membrana celular

Microorganismo
Ejemplos:
Uso de
➢Glicerol crioprotector
Congelación
➢DMSO
➢Trehalosa
➢Sacarosa
➢Glucosa
➢Lactosa
➢Inositol Destrucción celular Preservación
 Liofilización
• En este método no se propicia el crecimiento en las células conservadas
puesto que se les ha quitado el agua, se paraliza el metabolismo.

Propicia que el producto congelado

tenga una estructura sólida sin
intersticios en los que haya líquido
concentrado para propiciar que todo el
secado ocurra por sublimación. Microorganismo

Efecto de la congelación
después de liofilizar

Preservación
• Proporciona alta estabilidad genética.
• Es un método cómodo para el almacenamiento y envío de cepas.
 Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad
celular empleando este método
• Tipo de microorganismo:
Existen microorganismos que no resisten la liofilización debido a sus altas
cantidades de agua.

• Concentración celular:
Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden
de 108-109 células/ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso
de hongos filamentosos y levaduras

• Temperatura durante la sublimación

Debe ser lo más baja posible, sin aumentar por encima de –50ºC.
• Grado de deshidratación alcanzado:
Debe ser lo más alto posible.

• Atmósfera del oxígeno en el tubo:

Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar,
tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como
el oxígeno que puede dañar a las células

• Condiciones de almacenamiento:
La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18ºC y sin bajar de
los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad.
 Subcultivos (transferencia periódica)
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en medio de cultivo.

• Alta probabilidad de que se produzcan

mutaciones

• Alto riesgo de contaminación

De utilizar este método se recomienda retardar el envejecimiento y alargar los

periodos de resiembra.

• Disminuyendo la cantidad del inóculo.

• Disminuyendo algunos nutrientes del medio de
cultivo.,
• Almacenamiento entre 4 -8 ºC Técnica de
aislamiento

Se suele recubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril

 Conservación por suspensión en agua
Es un método alternativo muy usado con altos porcentajes de viabilidad en
diversos tipos de microorganismos, tanto (hongos filamentosos y algunas
bacterias).

• Se suspende en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se

quiere conservar.

Los hongos filamentosos que no esporulan,

se puede poner en suspensión trocitos de
agar con el crecimiento del hongo.
Métodos de desecación Papel de filtro
Paquete
cerrado

Paquetes
Papel semicerrado
15 minutos
Watman nº4 121ºC

Desecador
P
R
O Papel con
T cultivo 2-3 semanas
E 4ºC
Cultivo C Suspensión Gotas de
T celular cultivo
O Cerrado de
R Los paquetes
 Métodos de desecación Suelo

G
E
R
M
20 minutos Tierra esteril I
121ºC 4ºC N Microorganismos
A en fase
C durmiente
P
R
I
O 4-5días Ó Agotamiento
T
E
25ºC N de
C nutrientes
T
O
R
Almacenamiento
a 18ºC
Cultivo Suspensión de
esporulado esporas
Métodos de desecación Bolas de Alginato

Gotas Placa petri con

Papel secante

Alginato 3%
13 minutos
121ºC

CaCl2 0,03M Medio de Cultivo Gotas de alginato

esteril 0,75M Sacarosa con cultivo
48horas DESECACIÓN
Gotas de alginato
con cultivo Corriente de aire estéril
30 minutos ó bomba de vacío a
Cultivo Suspensión Polimerización del Temperatura controlada
en agua esteril Alginato
Pérdida del 30% del peso
 Referencias
Beech FW and Davenport RR. 1971. "Isolation, purification and maintenance of yeasts".
Methods in Microbiology. Vol 4. Academic Press. London.
Day JG and McLellan MR. 1995. "Cryopreservation and freeze-drying protocols".
Humana Press. Totowa.
Hatt H. 1980."American Type Culture Collection Methods: I. Laboratory manual on
preservation, freezing and freeze-drying". American Type Culture Collection. Rockville.
Hunter-Cevera JC and Belt A. 1996. "Maintaining cultures for biotechnology and
industry". Academic Press. London.
Juarros E, Tortajada C, García MD and Uruburu F. 1993. "Storage of stock cultures of
filamentous fungi at –80ºC.: effects of different freezing-thawing methods".
Microbiología SEM. 9.
Lapage SP, Shelton JE, Mitchell TG and Mackenzie AR. 1970. "Culture collection and the
preservation of bacteria". Methods in Microbiology. Vol. 3. Academic Press. London
Smith D and Onions AHS. 1994."The preservation and maintenance of living fungi".
International Mycological Institute. CAB International.
 ACTIVIDADES

• ¿Por qué no se emplean los mismos crioprotectores para la congelación y liofilización?

Explicar las razones y mencionar los empleados en el segundo método.
• ¿Para qué se recubre el medio con una capa de aceite mineral estéril?
• Al mencionar la temperatura del nitrógeno líquido se hacer referencia a dos de ellas
¿En que radica la diferencia entre éstas?
• Investigar tipos de siembra en tubo