Reproducción 9/3/16

Tema 8: Criopreservación de ovocitos y embriones humanos

Definición de criopreservación
“Conservación de determinados tipos celulares mediante el almacenamiento a temperaturas por debajo del
punto de congelación que inactivan de forma reversible el metabolismo celular y que son compatibles con el
mantenimiento de la integridad celular.”
Criopreservación por tanto hace referencia tanto a congelación como a vitrificación. Todavía no se ha
conseguido el crioprotector para vitrificar a los espermatozoides. Cuando se consiga, seria una maravilla por
ser sencillo, eficaz y rápido. La congelación de espermatozoides tampoco es una técnica muy larga pero con la
vitrificación son unos 5 min (vs todo lo que hicimos en prácticas de esperar en la nevera, luego en gas de N,
luego en N…). Los crioprotectores permeables a los espermatozoides no les gusta nada.

Técnicas de criopreservación
Dos tipos:
- Técnicas de equilibrio: la de toa la vida, la congelación.
o Lento y gradual
o Se mantiene el equilibrio osmótico
- De no equilibrio: la vitrificación.
o Enfriamiento ultrarrápido
o Mínimo desequilibrio osmótico
o Potentes y transgresoras
La vitrificación es la técnica estrella, de no equilibrio en que el enfriamiento es ultra-rapido. Desequilibrio
osmótico muy bestia pero muy corto. Ha revolucionado el campo, igual que lo hizo ICSI. Se inventó en
ganadería, donde no tenían pasta para congeladores programables, y encontraron una técnica que les
permitiese almacenar los embriones de forma eficaz.

Principios de la congelación
Hielo extracelular: Deshidratación.
Hielo intracelular: Daños mecánicos.
Estrategias para disminuir el hielo que suponemos que se va a producir si o si cuando congelamos:
– Ambiente hipertónico con los crioprotectores para que se produzca la deshidratación de la célula
(menos agua, menos hielo).
– Sustituir agua residual de la celula (10%) por crioprotector.
– Seeding, empieza a -6ºC : inducir formación de hielo.

Crioprotectores
Es muy importante conocer las características de los crioprotectores tanto en casos de congelación como de
vitrificación. Dependiendo del tipo se utiliza una concentración, un tiempo y una temperatura. Hay dos tipos:
– Permeables: su función es sustituir volumen residual de agua para que los cristales de hielo
interiores sean lo mas pequeños posibles.
o DMSO
o PROH
o GLYCEROL
– No permeables: Deshidratación
o Sacarosa

Protocolos de congelación
El protocolo suele consistir en la utilización de un medio comercial y de un congelador programable. La célula
se deposita en soluciones salinas y con suplementación proteica (medio hipertónico) y poco a poco se le
expone a concentraciones mayores de criprotector. Posteriormente se baja lentamente la temperatura,
utilizando el congelador programable, y al llegar a los 6ºC se induce el seeding. A partir de este punto ya se
puede congelar más rápidamente y las células son almacenadas en el banco.

Por ejemplo, en el caso de los embriones divididos:

– Solución base : PBS + 25 mg/ml HSA 5 min
– Sol 1: PROH 1.5 M en sol base 10 min
– Sol 2 : PROH 1.5 M + sacarosa 0.1 M en sol base 10 min
– Cargar pajuelas
– Congelador programable
– Almacenar en banco

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…Y en el de los blastocistos:
– 100-200 células. Glicerol mejor difusión.
– Sol base : PBS + 10 mg/ml HSA 10 min
– Sol 1,2,3,4 y 5 : 1,2,3,4,6 y 8% glicerol en sol base (10-15 min)
– Cargar pajuela.
– Programa de congelación
– Almacenar en el banco
En este caso la tasa de supervivencia es muy baja porque tienen mucha agua. En estos casos se intentaba
colocar un crioprotector que difundiera mejor y exponerlo mejor a concentraciones diferentes de glicerol de
tal forma que si lo tenias 10 minutos en cada concentración para luego llevarlo al congelador programable
pues se ajustaría mejor.

...Y finalmente en el caso de los ovocitos:

– Congelación lenta y descongelación rápida
– PROH 1-2 M + sacarosa 1-2M
– Seeding manual
– FISH embriones = no más alteraciones cromosómicas
– Donación, Ttos oncológicos, retraso maternidad. Más ética y legal
– Baja eficiencia
También daban muchos problemas con la congelación. Durante el proceso de congelación se dañaba el huso
mitótico, que llevaba a alteraciones cromosómicas que luego recogía el embrión. Tanto problema había que
estaba prohibida su congelación. Se consideraba una técnica potencialmente peligrosa.

Programas de congelación
– 1a Rampa: hasta -7ºC a -2ºC/min
– Seeding y estabilizar Tª al llegar a los 6 grados mediante una pieza sumergida en nitrógeno liquido y
tocando la pajuela para que se formase la formación de un núcleo de hielo.
– 2a Rampa: hasta -30ºC a 0.3ºC/min
– 3a Rampa: hasta -180ºC a -30ºC/min
– Almacenamiento a -196ºC

Descongelación
– Eliminación del crioprotector y retorno al estado fisiológico.
– Cultivar en IVF y/o G2 y evaluar la supervivencia.
– La supervivencia a la descongelación depende de la calidad previa a la congelación. Embriones G1-2
70%; G3-4 40%.
o Dependiendo de la supervivencia variaba la tasa de gestación. Además la tasa de
supervivencia dependía de la calidad del embrión. Si eran de buena calidad puede que con
un poco de suerte sobrevivieran un 70% pero si eran de calidad media la mitad se perdían
por el proceso.
o Ademas procedimiento muy costoso.
– Tasa de gestación en función del número de blastómeras íntegras:
o <50% Blast íntegras 10-15% gestación.
o >50% Blast íntegras 30-35% gestación.
– Blastocistos: 20% gestación. 100-200 células, ZP poco permeable y blastocele con mucho contenido
en agua.

Vitrificación
Historia
– Kasai y col. 1990: 1a sol vitrificación. Posteriormente otros autores estuvieron ensayando esta
técnica con ovocitos.
– Hunter y col. 1995: vitrificación de ovocitos + ICSI y cultivo prolongado.
– Mukaida y col 1998: 1a gestación con embriones de 8 células. El padre de la vitrificación el clínica
humana. Utilizó como modelo biológico embriones de raton de 8 celulas, vitrificándolos, y
optimizando la técnica.
– Kuleshova y col. 1999: 1a gestación con ovocitos + ICSI.
– Yokota y col. 2000: 1a gestación con blastocisto.
– Mukaida y col. 2001: 1o nacido por blastocisto.
– Jelinkova y col. 2002: 1a gestación doble con embriónes en PN (3PN).
– Trounson y Moor 1983 1a gestación embrión congelado = 20 años de congelación.

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Principios de la vitrificación
– La vitrificación se define como la transición de las soluciones acuosas de un estado líquido a un
estado vítreo sólido a bajas temperaturas sin la formación de cristales.
– Solidificación. Estructura vítrea amorfa.
– Vitrificación vs congelación:
o Ausencia de cristales y daños mecánicos
o Variación osmótica en la adición y dilución.
o Concentraciones muy elevadas de crioprotector : 4- 5M. Toxicidad.

Básicamente consiste en conseguir una solución acuosa altamente concentrada de tal forma que no se
cristaliza si no que se produce una solidificación, una estructura vítrea, de características similares al vidrio sin
la formación de cristales de hielo, lo que supone ausencia de daños mecánicos. No obstante, necesitamos
concentraciones muy elevadas de crioprotector, y esto supone riesgo de toxicidad.

Por tanto, sus principios se basan en:

o Ausencia de cristales intra/extracelulares.
o Ausencia de reorganización molecular de cristales.
o Ausencia de daños mecánicos y disminución lisis celular.

Osmolaridad:
o Constante durante el enfriamiento.
o Muy elevada en las fases de adición/dilución.
Momentos en los que hay que ser especialmente cuidadosos en esta técnica.

Crioprotectores en concentración 4-8M:

o Variación osmótica (choque).
o Elevada toxicidad celular. Para evitarlo disminuimos mucho el volumen y el tiempo de enfriamiento.

Toxicidad
o La toxicidad depende del tiempo de exposición al crioprotector.
o Una forma de minimizar la toxicidad es disminuyendo la cantidad, por eso la vitrificación se realiza
en microvolúmenes. También se utilizan en combinación los crioprotectores, buscando la mezcla
óptima que permita la menor toxicidad para nuestras células.
o Permeables: PROH, DMSO, Gly, EG.
o No permeables
o Azúcares: sacarosa, lactosa, trealosa...
o Ficoll, PVP (alteran propiedades físicas)

Momentos clave: cuando ponemos el protector y cuando lo quitamos. El tiempo que el ovocito esta en
contacto pero esta vitrificado ahí no hay daño toxico. Este se produce cuando yo pongo el protector y cuando
desvitrifico. Por tanto las estrategias siempre van encaminadas a la adición y eliminación.

Vitrificación en microvolúmenes
Cuanto menos volumen impliquemos, mejor. Es por esta razón que cuando la vitrificación se puso de moda se
empezaron a elaborar nuevos contenedores, algunos de los cuales son:

- Open pulled straws (OPS): pajuelas abiertas y estiradas para la decumulación de ovocitos. Al estar
estiradas poseen un calibre muy pequeñito, consiguiendo así células en el menor volumen posible.
- Rejillas de MET: EM grids
- Otro contenedor muy ingenioso fue el Cryoloop, como un lazo formado con un filamento muy fino,
como los cacharros de las pompas de jabón: por tensión superficial se formaba una membrana y
sobre ella se depositaba un embrión.
- También se crearon Cryotop: lamina de plástico donde dejamos la célula. Luego quitamos el
crioprotector que podamos y la célula queda totalmente aplastada. Este es el contenedor que
menos volumen de medio utiliza.
- Cryotip

Se fue comercializando todo esto y al final se han desarrollado varios métodos de vitrificación. Cryotop y
Cryotip son los mas utilizados.

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Proceso de vitrificación
Sirven para todo tipo de células, utilizando los mismos medios. Lo único que varia es el tiempo de exposición.
Con ovocitos más tiempo. Con embrión dividido disminuimos el tiempo de exposición.

– Para empezar, los embriones se colocan en la solución de equilibrio (ES) donde permanecerán entre
8-12 minutos hasta que la rehidratación sea completa (recuperen su volumen inicial). Entre 1-1.5M.
Explicación: colocamos los embriones en esta solución y vemos como se van deshidratando por
efecto de los crioprotectores. Llega un momento determinado en que la célula empieza a re-
hidratarse y vuelve a su tamaño inicial. En ese momento se pasa a la solución de vitrificación.
– Los siguientes pasos son pases sucesivos por 4 gotas de solución de vitrificación (VS) permaneciendo
un total de 90 segundos desde que se introducen en la primera gota hasta que se cargan en el
contenedor y se sumergen en N2 líquido. Ese es el tiempo en que nuestra célula esta expuesta a altas
concentraciones de crioprotector.

Adición del crioprotector

Los contenedores tienen que ser fáciles de utilizar para añadir rápidamente las
soluciones. Pasamos las células de una gota de solución de equilibrio (1) y la pasamos
por las 4 gotas de solución de vitrificación hasta cargarlo en nuestro contenedor y
congelando.

Vitrificación en CryoTip
El CryoTip: pajuelas de plástico estiradas que almacenan un volumen muy pequeño
(0.4µL) de solución de vitrificación, lo que permite una rápida transferencia de calor, y
evita la formación de cristales.

Además, están selladas por ambos extremos, por lo que, quedan aisladas del nitrógeno líquido y de cualquier
otra fuente posible de contaminación.

Para la vitrificación se utiliza en este caso el kit comercial de Irvine

Scientific. El protocolo de vitrificación se lleva a cabo en un tiempo
aproximado de 12 minutos a temperatura ambiente (22- 27 °C). Se desliza
la funda de metal para exponer el extremo de la punta. Observando bajo
lupa binocular se aspira SV hasta la marca #1. Se aspira la muestra con
VS hasta la marca #2. Se aspira hasta la marca #3 y las células quedaron
situadas próximas a la marca #3.

Se termosella (Sellado #1) se desliza la funda

metálica para proteger la punta. Se sacan el
conector y se termosella el extremo en la marca
#4 y se sumerge directamente en nitrógeno
líquido.

Vitrificación en CryoTop
Se realiza en una lámina de plástico sobre la que
se depositan las células y posteriormente se
cubre con una funda de metal. Las células entran
en contacto con el nitrógeno líquido. Esto permite aumentar las tasas de enfriamiento. Para la vitrificación se
utiliza en este caso el kit comercial de Kitazto.
El protocolo de vitrificación se lleva a cabo en un tiempo aproximado de 12 minutos a temperatura ambiente
(22- 27 °C). Bajo lupa se deposita la célula sobre la lámina de plástico y se elimina el exceso de SV (menor
volumen). Se introduce en N2 liquido y luego se cubre con la funda.

Break it down: Las velocidades de enfriamiento funcionan muy bien para embriones divididos, aunque
funcionan bien con casi todo. Sin embargo en caso de ovocitos o con blastocistos necesitamos velocidades
mayores. En estos casos tenemos que recurrir a contenedores abiertos como el CrioTop, que presentan la
ventaja de la cantidad de medio. Es una lamina de plástico y en el extremo colocamos la célula. Le quitamos el
medio que le sobre y la célula queda aplastada en el fondo de la lamina. Luego la ponemos en contacto con el
nitrógeno liquido, directamente, y este es el mayor inconveniente. El nitrógeno liquido no es estéril, entonces
el hecho de utilizar estos contenedores es un problema.

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Desvitrificación en CryoTip
- Se extrae de la bombona del banco y se coloca en un baño de agua a 37°C durante 3 segundos.
- Se corta el extremo grueso y se ajusta a una pipeta, se abre el extremo fino deslizando primero la
cubierta metálica.
- Se dejan las células en los medios de desvitrificación.
- Las células se pasan a la Gota 1, donde permanecen durante un minuto.
- Posteriormente se transfieren a la Gota 2, donde permanecen durante dos minutos.
- Finalmente se realizaran pases secuenciales de las células por las gotas 3 y 4, permaneciendo
durante tres minutos en cada una de ellas.

Desvitrificación en CryoTop
- Se extrae de la bombona del banco, se quita la funda del Cryotop y se introduce en la solución de
desvitrificación a 37°C.
- Las células se pasan al medio 1, donde permanecen durante un minuto.
- Posteriormente se transfieren al medio 2, donde permanecen durante dos minutos.
- Finalmente se realizaran pases secuenciales de las células por losmedios 3 y 4, permaneciendo
durante tres minutos en cada una de ellas.

Vitrificación de embriones divididos

Las tasas de gestación similar a embriones frescos. Se trata del estadio embrionario más sencillo para la
criopreservación. Criterios de clasificación morfológica eficaces para predecir gestación.

Vitrificación de ovocitos y blastocistos

Ovocitos: Elevado contenido en lípidos. Mas sensibles a los cambios de Ta. Mas tiempo de exposición a la SE.
Blastocistos: Mayor número de células y mucho líquido en el blastocele. Mas tiempo de exposición a la SE.

Vitrificación de ovocitos
Elementos citoesqueleto ondulados y flexibles. Endurecimiento lipídico: no daño permanente.

Vitrificación de blastocistos
o Zona pelúcida poco permeable.
o Blastocele con gran contenido en agua
o Pinchar blastocele en D+6. Disminuir el volumen de agua.
o Blastocistos: poco permeables
o mayor velocidad de enfriamiento
o Microvolúmenes (10-15 microl.).
o Aumentar las concentraciones de crioprotector y disminuir el volumen del contenedor para
aumentar la tasa de enfriamiento (Cryotop)
o % Gestación en blastocisto vitrificado similares a los de blastocistos frescos.

Ventajas de la vitrificación:
– Eliminación completa de los cristales de hielo. Mínimos daños osmóticos.
– Mayores porcentajes de supervivencia, división, gestación e implantación.
– Sencilla, segura, eficaz , barata y reproducible

Tema 9: Preservación de la fertilidad en la mujer

Introducción
La preservación de la fertilidad en la mujer es algo que no se ha podido realizar hasta la vitrificación. La
preservación es muy importante porque las tasas de supervivencia a los tratamientos oncologicos han
aumentado muchísimo, pero la quimio trabaja a nivel ovárico y te quema todos los ovocitos: todos los
folículos primordiales ovulan y se van a la porra. Es por esto que este tema ha tenido tanta importancia.

La quimio/radioterapia aumenta la supervivencia y efectos sobre las gónadas. El 42% de las mujeres que han
recibido QT y/o RT desarrollarán un fallo ovárico precoz antes de los 30 años. Lo más importante la
quimioterapia, la terapia más dañina para la fertilidad de la mujer.

Indicaciones
Las indicaciones en el caso de la preservación de la fertilidad en la mujer son en:
1. Pacientes oncológicas
2. Enfermedades benignas del ovario
3. Ooforectomia profiláctica

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 4. Lupus eritematoso sistémico y otras enfermedades autoinmunes
5. Trasplante de progenitores hematopoyéticos

Estrategias
Las primeras estrategias incluían el empleo de análogos de la GnRH (QT) o la transposición quirúrgica de los
ovarios (como ponerte ovarios en el sobaco, Y AU).

Cuando empezamos a tener una mejor idea de lo que hacíamos llego la criopreservacion del tejido ovárico al
rescate. Esto permite que dentro de las técnicas de la reproducción asistida se criopreserven embriones,
ovocitos maduros o el propio tejido para su futuro uso.

Protocolo de actuación en la paciente oncológica

– Diagnóstico calidad y reserva ovocitaria:
o FSH: Respuesta ovárica a la HOC
o AMH: Envejecimiento ovárico
– Mala: Ovodonación/Adopción.
– Buena:
o Valorar situación de la Enfermedad
o Indicación de la HOC (Cánceres hormonodependientes: mama y ovario)
– Buena reserva folicular y HOC no contraindicada
o Sin pareja
! Vitrificación de ovocitos maduros
o Con pareja
! Vitrificación de embriones
! Vitrificación de ovocitos maduros
– Buena reserva folicular, HOC contraindicada y/o preservación urgente: Congelación corteza ovárica.

Tras diagnostico acerca de la calidad y reserva ovocitaria: si es buena, hay que saber si se puede hacer una
hiperestimulación ovárica o no. En el caso de un cáncer por ejemplo no se puede hacer esto. Se ve como está
la calidad de la reserva ovárica y luego se ve la situación de la enfermedad. Luego se ve si tiene pareja o no
tiene pareja.

Lo mejor suele ser la vitrificación de ovocitos, no vaya a ser que te divorcies o algo. Almacenar embriones es
más problemático. Esto obviamente se realiza en pacientes con función ovárica, en ciclo natural o tras HOC.
Siempre que la hiperestimulación ovárica no esté controlada podemos vitrificar ovocitos para sucesivos
intentos de técnicas de reproducción asistida. Se considera una técnica eficaz dentro de los TRA (tasa de
gestación 20-30%). Existen medios comerciales ue permiten desarrollar esta metodología en las URH. La ley
de RA ha regulado ya su utilización en España. El inconveniente es que el HOC en canceres
hormonodependientes como que no.

Vitrificación de embriones
Mantiene la fertilidad de la pareja pero no de la mujer sin pareja. Solo es posible en pacientes con actividad
ovárica en las que no este contraindicada la HOC. TRA con mejores resultados en el momento actual (TG 30-
40%).
Congelación de corteza ovárica
Se considera una técnica experimental y su practica tiene que estar siempre tutelada. Cada vez hay mas
avances. Tiene la ventaja de que puedes congelar corteza ovárica en niñas sin actividad ovárica. También se
puede realizar sobre mujeres adultas con neoplasia en la que se desaconseja la HOC.

La corteza ovárica es la estructura funcional del ovario. La criopreservacion de corteza ovárica permite la
supervivencia de folículos primordiales con una población similar a la del injerto de tejido ovárico fresco.
Cuando criopreservamos la corteza conseguimos almacenar los folículos primordiales, y tenemos la
posibilidad de luego re-implantarlos sobre el lecho ovárico residual una vez finalizada la quimio.

La obtención del tejido ovárico es independiente de la edad o del estado del ciclo menstrual. Se aproxima al
método ideal para preservar un gran numero de ovocitos con carácter urgente. El problema es que los
folículos preovulatorios se van a la mierda.

Sobre todo, la gran ventaja es que permite restaurar la fertilidad por autotransplante, y es una alternativa a la
terapia hormona sustitutiva ya que restaura la función ovárica. Se pueden conseguir gestaciones
espontaneas.

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Hay muy pocas publicaciones sobre recién nacidos vivos tras congelación de corteza ovárica, pero no pueden
haber muchos trabajos debido que tiene que pasar que la mujer quiera ser madre para utilizar el tejido o que
sobreviva al tratamiento.

Qué hacen en La Fe?

o Extracción 3⁄4 partes del ovario por laparoscopia.
o Procesado de la muestra, una parte se remite a anatomía patológica para descartar la presencia de
células malignas. Una parte se envía a congelar y otra se evalua para descartar la presencia de células
malignas.
o Las piezas de corteza ovárica y las muestras de sangre se remiten al Banco de Tejidos del Hospital
General de Valencia donde se congela la corteza y las muestras de sangre se almacenan en la
seroteca.

Parte teórica práctica de campo

Práctica FIV-ICSI en La Fe
Torre B Primer Piso a las 4

Nota: Esto está muy desorganizao. La mujer fue bastante rápido, pero dio a entender que esto era básicamente
para entender lo que haríamos en la práctica de campo.

La primera porción de la práctica va a consistir en preparar las cajitas necesarias para FIV-ICSI.

Se preparan las cajas como si se fuese a realizar una FIV y una ICSI (no sabes cual vas a realizar ese día así que
te lo preparas todo POR SI LAS MOSCAS). Al recuperar los ovocitos (inyección transvaginal) y evaluarlos, los
vamos a ir colocando en distintas cajas secuencialmente, tal que así:
o Primera caja tiene medio tamponado
(flashing médium), y solo se necesita
mantener la temperatura porque
mantiene el pH el propio medio.
Pregunta de examen: cuales son los
medios que utilizamos para trabajar
fuera del incubador/que medios
permiten mantener el pH sin necesidad
de intercambiar CO2 para mantener el pH: flashing.
o Luego se pasan a la segunda, que es igual: una caja de lavado con flashing médium. De esta forma
“lavamos” los ovocitos, eliminando hematíes que pueden estar adheridos.
o De aquí ya los pasamos a medio de IVF, que es un medio que para mantener el pH tiene que
intercambiar CO2 dentro del incubador. En este caso utilizamos macrogotas de medio IVF cubiertas
de aceite mineral. Las macrogotas son de aprox 200 microlitros y sirve para colocar el ovocito tras el
lavado. Estas cajas se llaman de 8+1 por tener 8 gotas en los lados y una en medio. Cuando
esperamos en una captación muchos ovocitos en lugar de una caja se preparan 2 o 3 (en la imagen
por ejemplo se han preparado 2). Una vez tenemos los ovocitos en las gotas se pasa al incubador
para que se estabilicen y se libren del estrés de la puncion folicular.
o A continuación tendremos cajas preparadas con hialuronidasa, y pasamos los ovocitos aquí, para
romper las uniones de la granulosa (decumulación). Esto durante un minuto, y también en medio
flashing puesto que estamos fuera del incubador.
o A continuación los pasamos a gotas con IVF y otras cosas puesto que los volvemos a meter en el
incubador hasta que se da la IVF en si; también denominada caja 1-3-3-1 (por la disposición de las
gotas de nuevo). La caja de IVF: microgotas cubiertas en aceite. Las gotas son de 5 microlitros. Una
vez decumulados los ovocitos y clasificados según su fase vamos a colorcarlos organizadamente en
la caja. Metafase I, Metafase II… Luego los pasamos a las siguientes gotas.
o Finalmente la caja de IVF. Los ovocitos están fuera del incubadora si que también medio flashing.

Tambien caja de inseminación donde tenemos gotas con una concentración de 200mil espermatozoides
donde colocaremos los ovocitos.

Resumiendo: dos tipos de cajas: cajas de macrogotas cubiertas de aceite mineral o cajas de microgotas
cubiertas de aceite mineral.

o Cajas de macrogotas: para cultivar al ovocito y para inseminarlo y decumular.

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 o Cajas de microgotoas: para colorcar los ovocitos antes de microinyectarlos (después de
decumualrlos) y después de microinyectarlos, y también para microinyectar. (Esto no lo va a
preguntar). Microinyectar en microgota para encontrar el ovocito mas fácilmente.

Además distinta serie de cajas dependiendo de lo que vayamos a realizar:

o Si es FIV: caja donde vamos a cultivar a los ovocitos y la caja donde los vamos a inseminar y NADA
mas, porque ahí se quedan hasta el dia siguiente. Al dia siguiente los decumulamos, los pasamos
todos a la gota central y ahí veremos el numero de ovocitos fecundados y prepararemos la caja con 6
gotas para poner esos 6 ovocitos fecundados.

o Si es ICSI: colocaremos la caja para cultivar ovocitos, para decumular y para colocar los ovocitos
después de decumular y microinyectar. Una caja para los ovocitos cuando los hemos recuperados
donde los cultivamos. Una caja para decumularlos. Otra caja donde vamos a ponerlos antes de
microinyectos (M1, M2 y vesículas) y la caja para microinyectar. Al día siguiente cuando veamos los
que hayan fecundado prepararemos la caja para los microinyectados.

En casos en los que no sabemos la fertilidad de la mujer por no tener historial pasado no podemos destinar
todos los ovocitos a una sola técnica, asi que los dividimos y hacemos las dos técnicas.

En el caso de la FIV lanzamos lo menos 200.000 espermatozoides al ovulo para fecundarlo. En la práctica
prepararemos las gotas y calcularemos el volumen de semen capacitado necesario para tener 200000
espermatozoides capacitados, y otras cosas.

Segunda parte de la práctica: microinyeccion. Aprenderemos a utilizar los materiales y manejarnos por el
campo. Luego iremos a la gota de los espermatozoides y los inmovilizaremos y posteriormente intentaremos
microinyectarlos.

Nota random: Si la muestra de semen es normal y tenemos 4 ovocitos normales no queremos arriesgarnos a
que el semen no tenga capacidad fecundante, entonces sin son pocos microinyectaremos.

Preguntas posibles:
- Para que sirve la polidilpilurodilina(¿? LUL, imagino que estará en los apuntes de otro dia).
- Para que sirve la hialuronidasa?
- IVF dentro o fuera del incubador?
- Medio fuera del incubador?
- Con cuantos espermatozoides inyectamos el ovocitos?
- Basandose en el historial de la señora x, que practica le harias?
- Quizas alguna pregunta de diagnostico genético pre-implantacional: estadio en el que se realiza la
biopsia " solución, el dia 3.
- El medio de biopsia para el diagnostico genético preimplantacional es un medio sin calcio ni
magnesio para disminuir las uniones intracelulares o es un medio que lleva mas potasio o es un…
bla bla. Solucion: medio de biopsia es un medio sin calcio ni magnesio puesto que lo que hacia era
disminuir las uniones intercelulares y permitir a la celula biopsiada salir mas fácilmente del embrión
sin dañarlo.
- A la hora de clasificar los embriones nos basamos en el numero de células y en el % de
fragmentación. El % de fragmentación nos indica: supervivencia, calidad, estadio de desarrollo…
Solución: nos habla de su calidad. Cuanto mas fragmentado menos calidad.
- Un embrión en dia 5 o 6 estará en 2 cel, 4 cel, blastómero… Sol: blastocisto.

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