Reproducción Animal 2021 1
CRIOPRESERVACIÓN
GAMETOS Y EMBRIONES
La criopreservación es una técnica que permite mantener las células a baja temperatura sin perder su viabilidad y
utilidad, tiene como objetivo inhibir la actividad metabólica del semen, garantizando su vitalidad y función a través
del tiempo, conservándolo indefinidamente (Cruz et al., 2006).
La criopreservación del semen se constituye como una herramienta importante que mejora las tecnologías
reproductivas en el campo de la ciencia animal (Benson et al., 2012).
Barker and Garnier (1957) primera preñez y cría nacida con semen descongelado.
Polge y Minotakis (1964), con un diluyente a base de yema de huevo y glicerol.
Krause y Grove (1967) evaluaron diluyentes a base de glucosa, lactosa y rafinosa con yema de huevo y
glicerol, 50% Movilidad. Cría de una mula
La criopreservación cual se atribuye a la alteración de la integridad de las macromoléculas de los
espermatozoides (Guasti et al., 2012).
LIPIDOS PROTEINAS
ACIDOS NUCLEICOS
REPRODUCCIÓN ASISTIDA
PRESERVACIÓN DE
GERMOPLASMA
INGENIERÍA GENÉTICA
Conservar
Almacenar
Transportar
Diseminar
Clonación
Transgénesis
Industria
Investigación
PIVE OOCITOS MADUROS E INMADUROS
TE
Potencial
reproductivo
Reducción en la
calidad (bovinos,
equinos, porcino)
• Congelación lenta
• Congelación rápida
• Congelación ultrarrápida o vitrificación
Reemplazar el agua
Crioprotector
Sustancias crioprotectoras
– Disminuyen la T° formación de núcleos de hielo.
– Formación de agua superfría.
– Deshidratación celular
– Vídeo
PERMEABLES......REEMPLAZAR EL AGUA
– Alcoholes
Glicerol, etilenglicol, propilenglicol o sorbitol
– Aminas
Acetamida, betaína, formamida, lisina o taurina,
metilformamida, dimetilformamida
NO PERMEABLES
– Elevan la presión osmótica
– Menor cantidad de crioprotector y toxicidad
– Favorecen la deshidratación de la célula
– Azucares
(glucosa, fructosa, sucrosa 0.1-0.5 M)
– Macromoléculas
(albúmina)
– Sintéticos
(ficoll, dextrano, polivinilpirrolidona, polivinilalcohol)
Exposición a crioprotectores
Congelación a temperaturas por debajo de 0 ºC
Almacenamiento a T° -196 ºC
Calentamiento y descongelación
Dilución y remoción de crioprotectores
m
Diluyente
Glicerol (membrana)
Yema de huevo
Tris (buffer)
Antibióticos
Las LDL presentes en la yema de huevo se adhieren a la membrana plasmática de la célula espermática,
dotando al espermatozoide de una mayor protección ante los cambios en la temperatura por la
congelación (Morillo-Rodríguez 2013).
La DMF se ha estudiado como agente crioprotector, debido a sus propiedades
físico-químicas que permiten una alta difusión a través de la membrana celular
(Restrepo et al., 2012), además no se comportan como una sustancia toxica para
el espermatozoide durante el proceso de congelación (Alvarenga et al., 2005).
EQUINOS
El GLC genera toxicidad para los espermatozoides (Fahy et al., 1990) y esta toxicidad
genera alteraciones que involucran la fertilidad de las células espermáticas (Amann
y Pickett, 1987; Squires et al., 2004). EQUINOS
Alta variabilidad en
Calidad seminal
(Kankofer et al., 2005; Cocchia et al.,
2011)
30-40%
Semen de
Reducción de
buena Parks y Graham, 1992; fertilidad
Congelabilidad Brum et al., 2008
(Ángel y Bran,
2010)
Movilidad
Morfología
Vitalidad
Criopreservación
HOS
ADN Actividad
Mitocondrial
Tipos de vagina
Modelo Colorado / Cambridge
Modelo Missouri
Modelo Hannover
Limpieza y secado del pene
Preparación de la Vagina Artificial
Temperatura agua aprox. 50 °C
Temperatura vagina 42°C
MANIQUÍ O DUMMY
Volumen
pH
Concentración
Movilidad
Criterios de selección:
➢100, 500 millones cel/
ml,
➢Movilidad : ≥ 60%
• Permiten reducir los spz inmóviles, inmaduros y anormales.
• Concentrar las células con mayor movilidad
• Eliminar otras células, detritos, contaminantes, plasma seminal y diluyentes de
transporte.
• Centrifugación convencional produce alteraciones de movilidad, integridad de
membrana y acrosomas (600 x g)
• Fuerza de centrifugación vs. Recuperación Spz vs. Alteraciones
• Métodos
– Centrifugación de una capa (SLC)
– Centrifugación con gradientes de densidad (DGC)
– Swim-up
– Filtrado
Androcoll
(SLC)
CushionFluid (SLC)
EquiPure (SLC)
Percoll (DGC)
PureSperm (DGC)
SpermFilter
(Diaz-Jimenez et al.,2018)
SAC 0,25M - GLY
MT% (45.8 ± 15.6 vs 40.2 ± 12.7)
MT% (31.0 ± 13.2 vs 28.5 ± 9.8)
IMP% (42.7 ± 12.6 vs 37.5 ± 13.6)
.
CENTRÍFUGA 12 MIN. A
800 g
SEMEN
RETIRAR - REDILUIR
EMPAQUE EN PAJILLAS 0.5 NEVERA 5° 1H
VAPORES 15 MIN. NEVERA 20 MIN.
• Funciones
– Proveer energía
– Proteger del estrés térmico
– Mantener el balance osmótico y electrolítico
– Estabilizar el pH
– Neutralizar productos metabólicos tóxicos (ERO)
– Inhibir el crecimiento bacteriano.
– Crioprotector(es) permeable(s)
– Componentes origen animal (yema de huevo, leche, caseinatos)
• Alternativa con Lecitinas de soya
– Crioprotector(es) no permeable(s)
– Antibióticos
– Antioxidantes (vitaminas, quercetina, ergotioneina, isoespintanol)
– Sustancias buffer
Con yema de huevo (3 - 5%)
ALTERNATIVAS: Libres de componentes animales
• Lecitinas de soya
• Yema centrifugada
• Plasma de yema de huevo
m
CENTRIFUGACIÓN YEMA DE
HUEVO 3420 X g, 100 mIn.
EMPAQUE EN
PAJILLAS
NEVERA 30 MIN.
m
Movilidad
Morfología
Vitalidad
Criopreservación
HOS
Actividad
Mitocondria
AD l
N
4 °C/ 10 min
Congelación
Vapores / 10 min
Convencional
-196 °C
m
Congelador automático
Descenso gradual T°
Crioprotector 1 - 1.5M
Equilibrio osmótico-
deshid-cristales
Curva de descenso de temperatura
m
0.5 a 2°C/min hasta -7ºC.
0.3 a 0.5ºC/min hasta –40ºC
10ºC/min hasta –150ºC
Nitrógeno liquido a –196ºC
Alta concentración de crioprotectores (5 a 7 M)
Exposición inicial a vapores de nitrógeno
Luego a LN2
Estado vítreo (cristal)
2000 a 20000ºC/min
Volúmenes mínimos
1 a 3 pasos
Inmersión en LN2
Congelador programable No (menor costo)
Descenso gradual T° Descenso ultrarrápido T°
10ºC/min Hasta 20.000 ºC/min
Pajilla cerrada tradicional OPS, CPS, Crioloops….
[Crioprotectores] =1-1.5M [Crioprotectores] = 5-7M
.
CENTRÍFUGA 12 MIN. A
800 g
SEMEN
RETIRAR - REDILUIR
EMPAQUE EN PAJILLAS 0.5 NEVERA 5° 1H
VAPORES 15 MIN. NEVERA 20 MIN.
Empaque, sellado y marcado
PVP
m
Membranas
Defectos morfológicos
Afecciones metabólicas
Interacción tracto genital
femenino
Open pulled straw
Closed pulled straw
Microgotas
nylon mesh
Cryoloops
Desarrollo in vitro de oocitos criopreservados
– Congelación lenta 3 - 8%
– Vitrificación 4 - 25 %
El efecto de la tasa de cambio de la temperatura
Cada célula tiene una tasa
de enfriamiento
• Lenta: recristalización, unión y crecimiento de cristales.
• Rápida: derretimiento del hielo
“Las células difieren en sus requerimientos de congelación y calentamiento”
“La tasa de enfriamiento interactúa con la tasa de calentamiento”
Efecto de la densidad de células
“Células densamente empaquetadas
tienen más probabilidad de daño”
• Por tensiones mecánicas
• Recristalización del hielo que se
forma de sus límites.
“La velocidad de cambio de volumen y el volumen de equilibrio deben ser
optimizados en los procedimientos de crioconservación”
El volumen final de equilibrio depende de la concentración de solutos no
permeables
Crioprotector ocupa el espacio en la célula…. volumen de agua inferior al
fisiológico
El grado final del contracción de la célula depende de la concentración de
crioprotector
“Las células son generalmente más sensibles al hinchamiento que a la contracción, por lo que la
eliminación de los crioprotectores tiende a ser más peligrosa que su adición”
Remoción del crioprotector
– Se elimina por exposición a una concentración más baja.
– Absorción osmótica de agua hace que las células se hinchen sobre su volumen inicial.
– Se encogen si el crioprotector sale acompañado por suficiente agua…equilibrio osmótico.
– Vuelve al volumen fisiológico si los solutos no permeables no se pierden o se ganan.
Concentración intracelular de crioprotectores
• Después del sometimiento a
soluciones nV y VS.
• Uso de diferentes concentraciones
de sacarosa.
• Variaciones en volumen según
Osmolaridad.
• Ej. 2.14 M equivalente a condición
iso-osmótica en los cigotos después
de las soluciones.
• Alta ICCP en calentamiento:
– Menos posibilidad de recristalización y lisis celular (Según la tasa de calentamiento).
– Mayor probabilidad de “sobre-hinchamiento” por la entrada rápida de agua.
El Experimento:
Primera
congelación, 85%
(Pursel y Johnson,
1975)
No es nuevo,
pero si poco
usado, afecta
IMP, RA, MOV,
DIF. EN LA DESC
Los protocolos
Macropajillas 5ml
usados en toros,
Minipajillas
ovinos y equinos
• Congelación semen a nivel mundial 1%
• Proporción colesterol/fosfolípidos
• Ovinos 0.85, Humanos 0.83, Equinos 0.36, Toros 0.51,
Porcinos 0.2
• Buenos y malos congeladores
Guimarães et al., 2017
