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UNAM
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán. Campo 4
PRÁCTICA 5. CINÉTICA DE LA ENZIMA UREASA
Integrantes:
Latourniere Toriz Emilia Carolina
Peralta Urrieta Sofia Jatziry
Equipo No. 2
Profesores:
MVZ Francisco Javier Cervantes Aguilar
MVZ Silvia Leticia Bonilla Orozco
Dra. Ana Elvia Sánchez Mendoza
Grupo: 2201
Fecha: 11/04/2023
ÍNDICE
Resumen…………………………………………………………………………3
Introducción……………………………………………………………………4-5
Marco teórico…………………………………………………………..………5-9
Objetivos generales……………………………………………………………..9
Material y metodología………………………………………………………..9-11
Resultados obtenidos………………………………………………………12-16
Discusión………………………………………………………………………..17
Conclusión………………………………………………………………………..18
Referencias…………………………………………………………………19-20
RESUMEN
En la práctica realizada fueron determinados los factores que influyen en la
actividad de tales enzimas, así como también pueden ser observados y medidos.
Además de contar con la influencia del Bicloruro de mercurio al 1%.
Para que se pudiera observar este procedimiento se utilizó la enzima ureasa, cuya
función es catalizar la hidrólisis de la urea, proceso mediante el cual se obtiene y
reabsorbe un ion de amonio o amoniaco para la formación de aminoácidos;
gracias a dicha propiedad, la urea suele ser utilizada en explotaciones masivas
como fuente de nitrógeno no proteico.
También se llevó a cabo el estudio de la cinética enzimática, es decir, la velocidad
de reacción de la ureasa con los factores que la modifican, tomando en cuenta
ciertas variables importantes tales como “concentración de sustrato y de producto,
temperatura y pH”, en donde la velocidad se determinó con mediciones entre la
relación de concentración y sustrato.
Para esta determinación ya mencionada, fueron utilizadas cinco muestras de urea,
en donde se aplicó un indicador de pH “rojo de metilo al 0.04%” y así obtener
como resultado “hidróxido de amonio (NH4OH)”, así de esta manera poder medir
las cuatro variables sobre la enzima.
Los resultados fueron obtenidos calculando inicialmente los mM de la urea inicial,
con formula ya descrita en el manual de prácticas, que después sirvió para
multiplicar por el valor de VTC por 50 y obtener la concentración de urea
hidrolizada. Posteriormente se realizaron los cálculos para obtener los datos y así
poder graficar, además de obtener el grado de mililitros.
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INTRODUCCIÓN
Las enzimas actúan como catalizadores biológicos, los cuales van a acelerar una
reacción química específica en una célula, la cual contiene miles de moléculas
específicas para cada reacción. Estas enzimas están constituidas de proteínas o
de ribosomas. Esto no quiere decir que afecte al producto o el equilibrio de nuestra
reacción química simplemente acelera su proceso. (Austin, s.f)
Hay que tomar en cuenta que para cada reacción existe una enzima diferente. La
cual será muy importante ya que de no existir la reacción química incluso podría
no producirse. (s.a, 2020)
De hecho, las enzimas que produce el cuerpo de un ser vivo son las proteínas.
Para poder extraer energía de los azúcares, necesita de estas enzimas para poder
acelerar este proceso. A este tipo de respuesta se le llama reacción auto catalítica.
Además pueden degradar azúcares sintetizar grasas y aminoácidos en otras
reacciones dentro del ser vivo. (Ramírez, s.f)
Para realizar el proceso de una reacción química, se tiene que pasar por
diferentes estados un estado energético: El inicial, intermedio y final. Existe una
energía que diferencia a las demás llamada energía de activación, la cual se
relaciona estrechamente con la velocidad de nuestra reacción, de tal manera que
mientras esta aumenta, la reacción química será más lenta. Resultado de que las
moléculas que participan solo completan una reacción una vez que han
completado su objetivo. Mientras más elevada la barrera, menos moléculas
alcanzan la energía suficiente. Las enzimas son muy importantes para disminuir
esta barrera. (Riofrío, s.f)
En resumen, esta enzima es de suma importancia para el tratamiento de
enfermedades en animales domésticos, así como en el ser humano, como la
obesidad, fibrosis quística, hinchazón abdominal, etc. Debido a su deficiencia en la
producción de proteínas y/o defectos en su constitución molecular. (Lugo, 1962)
Tal como se citó, existen diferentes tipos de enzimas, las cuales ayudarán a una
reacción química diferente cada una de ellas. Una muy importante y que
utilizaremos en nuestra práctica es la ureasa, la cual está altamente distribuida en
el reino vegetal. Se utiliza como un gran agente catalítico para medición
cuantitativa de la urea (localizada en la orina, sudor y materia fecal). Sin embargo,
también tendrá una gran participación el ion Ni2+ para llevar a cabo esta función.
(Bolaños, 2003)
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Para comprender esto necesitamos de la cinética enzimática, la cual nos hará
comprender el comportamiento de una enzima. Producto de la influencia de
distintos factores que se necesitan ser controlados y optimizados, para que estas
enzimas tengan una buena actividad y reproducción. (Koolman, 2004)
MARCO TEÓRICO
Enzimas
Son catalizadores biológicos que incrementan la velocidad de una reacción
química mediante la disminución de su energía de activación. Catalizan
reacciones químicas para el mantenimiento de la vida, además de que cuentan
tanto con un pH como una temperatura óptimos para ejercer su acción catalítica
sobre el sustrato. (Bolívar, 2020).
Catalizador biológico
Las enzimas son proteínas, polímeros formados por aminoácidos covalentemente
unidos entre sí, que catalizan en los organismos una gran variedad de reacciones
químicas. La actividad catalítica de las enzimas depende de que mantengan su
plegamiento, es decir, su estructura tridimensional. En esta estructura
tridimensional se forman cavidades, llamadas “sitio activo”, las cuales muestran
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afinidad por las moléculas específicas (sustratos) que se convertirán en productos.
La combinación de grupos funcionales químicos presentes en estas cavidades
genera un conjunto de interacciones covalentes y no covalentes entre la proteína y
el sustrato, que hacen que la conversión de éste en un producto se vea
favorecida. Como cualquier catalizador, al finalizar la transformación del sustrato y
liberarse el producto del sitio activo, la enzima regresa a su estado original y
puede involucrarse en un nuevo ciclo de catálisis. Las enzimas pueden utilizarse
también fuera de las células. (Ramirez Ramirez, 2014)
Ureasa
La ureasa (EC 3.5.1.5) es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido
de carbono y amoniaco. La reacción ocurre de la siguiente manera:
(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3
En 1926, James Batcheller Sumner demostró que la ureasa es una proteína. Es
producida por bacteria, hongos y varas plantas superiores.
algunas de sus principales características son:
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Especificidad enzimática: urea e hidroxiurea
Inhibidor enzimático: metales pesados (Huang et al., 2011).
Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son
catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética de una enzima permite
explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo
es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por
fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas.
Las enzimas son proteínas (macromoléculas) con la capacidad de manipular otras
moléculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro
catalítico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo
de una serie de pasos denominados mecanismo enzimático. (Ayala Aceves, 2014)
Bicloruro de mercurio
El cloruro mercúrico o cloruro de mercurio (II) es un compuesto inorgánico de
fórmula HgCl2. Es un compuesto muy tóxico. Causa náuseas, vómitos, diarreas,
daño renal, vómitos de sangre, hemorragia del estómago, intestinos y otros
órganos (especialmente -como suelen hacerlo los compuestos derivados del
mercurio- en el cerebro debido al envenenamiento por mercurio). La ingesta de 1 o
2 gramos causan casi siempre la muerte.
La principal aplicación del cloruro mercúrico es como catalizador en la conversión
del acetileno a cloruro de vinilo, el precursor del PVC:
C2H2 + HCl → CH2=CHCl. (Hernandez, 2015)
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Juegos de Ciencias | Juego de Ciclo de la urea | Cerebriti
Ecuación de Michaelis-Menten
El modelo está basado en la acción de enzimas que actúan sobre un sustrato
simple, no es aplicable a las enzimas que tienen una región reguladora de la
actividad catalítica del sitio activo, por lo que las enzimas a una baja concentración
de sustrato presentan una actividad catalítica lineal con la concentración de
sustrato, pero a altas concentraciones de sustrato, la actividad catalítica es
independiente de la concentración de sustrato. (Blaber, 2019)
La relación de este complejo con los otros componentes del proceso enzimáticos,
así como con las constantes (K) que los relacionan se señala: Fuente (Tim
Vickers). En donde la enzima (E) se combina con el sustrato (S) para formar el
complejo enzima-sustrato con una constante de velocidad K1. El complejo E-S
puede disociarse en E y S con una constante de velocidad de reacción K-1.
(Blaber, 2019)
El complejo ES puede originar un producto (P) y la separación de la enzima, la
cual puede ser reciclada para cumplir otro ciclo de actividad enzimática. Se puede
alcanzar una situación de equilibrio para el estado [ES] en el cual su velocidad de
formación es igual a su velocidad de descomposición. (Blaber, 2019)
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Ecuación de Michaelis Menten (trabajosmedicos.blogspot.com)
OBJETIVOS GENERALES
Determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas
y la manera en que pueden ser observados y medidos en el laboratorio,
tomando como ejemplo a la ureasa producida por el frijol de soya.
Determinará la influencia del inhibidor Bicloruro de Mercurio (HgCl2), en la
reacción catalizada por la ureasa.
MATERIAL Y METODOLOGÍA
Material y equipo Reactivos y soluciones
5 tubos de ensaye grande Urea 0.25 M
3 pipetas (1,5 y 10 mL) Amortiguador de fosfatos 0.05 M, pH
2 matraces Erlenmeyer de 250 Ml 7.2.
1 bureta de 25 o 50 mL Amortiguador de fosfatos de pH
1 soporte universal diferentes
1 pinzas de bureta Bicloruro de Mercurio al 1%
1 propipeta Ácido clorhídrico 0.1 N
Gradilla para tubos de ensaye Vórtex Rojo de metilo al 0.04%
1 piseta
Baño María Muestra biológica
Termómetro Extracto de ureasa proveniente de
frijol de soya
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Metodología
Para la determinación del efecto de la variación en la concentración
del sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa, se
prepararon seis tubos, los cuales eran
Tubo 1 2 3 4 5
Urea 0.25 M 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Amort. Fosfatos pH 7.2 1 1 1 1 1
Agua destilada 8 7.5 6.5 3.5 1
Incubar en baño María durante 5min a 50°C
Ureasa 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Incubar en baño María durante 30min a 50°C
HgCl2 al 1% (gotas) 4 4 4 4 4
Cada volumen agregado a los tubos fue en mL, excepto donde se indicó gotas.
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Determinación del efecto de la variación de la temperatura sobre la
velocidad de reacción de la ureasa.
Tubo 1 2 3 4
Urea 0.25 M 7.5 7.5 7.5 7.5
Amort. Fosfatos pH 7.2 2 2 2 2
Incubar por 5 min a: 0 20 50 80°C
Ureasa 0.5 0.5 0.5 0.5
Incubar por 5 min a: 0 20 50 80°C
HgCl2 al 1% (gotas) 4 4 4 4
Cada volumen agregado a los tubos fue en mL, excepto donde se indicó gotas.
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RESULTADOS
1. Determinación del efecto de la variación en la concentración de
sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa
Tubo mL de urea μM de urea mL gastados μM de urea
inicial en cada hidrolizada (y)
tubo (x)
1 0.5 12.5 5 ml 250 μM
2 1 25 6.3 ml 315 μM
3 2 50 4.2 ml 210 μM
4 5 125 3.9 ml 195 μM
5 7.5 187.5 2.3 ml 115 μM
Para calcular la μM de urea inicial, se debe considerar que está se preparó a 0.25
M, es decir, hay 250 μM por cada mL y cada tubo tendrá un volumen final de 10
mL.
(250 μM) (0.5 mL de urea) = 12.5 μM
(10 mL)
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μM de urea hidrolizada = (mL gastados) (50)
( 5 mL ) (50) = 250 μM
Sustrato (urea)
350
300
250
200
150
100
50
0
12.5 μM 25 μM 50 μM 125 μM 187.5 μM
13
μM de urea hidrolizada = (mL gastados) (50)
( 0.3 mL ) (50) = 15 μM
( 1 mL) (50) = 50 μM
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3. Determinación del efecto de la variación de la temperatura sobre la
velocidad de reacción de la ureasa.
temperatura
35
30
25
20
15
10
0
0° 20° 50° 80°
15
4. Determinación del efecto de la variación del pH del medio sobre la
velocidad de reacción de la ureasa.
Tubo pH del medio (x) mL gastados μM de urea
hidrolizada (y)
1 5 3.3 mL 165 μM
2 5 2.4 mL 120 Μm
3 5 2.8 mL 140 μM
4 5 2.5 mL 125 μM
5 5 5.3 mL 265 μM
pH
300
250
200
150
100
50
0
5 5 5 5
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DISCUSIÓN
Al agregar el indicador se observaron que todos los tubos viraron a amarillo, así
que hubo productos en ellos y por lo tanto cada uno procedió a titularse
Se corrobora con la titulación utilizando HCl (ácido clorhídrico), la metodología es
la misma que en la práctica 1; esto nos permite verificar los cambios que existieron
con las cuatro variables y las modificaciones que fuimos haciendo paso a paso.
De manera general pudimos conocer la manera en la que esta reacción pudo ser
observada gracias al rojo de metilo y calculada para así poder obtener el gráfico
correspondiente. Así mismo pudimos ver la curvatura de cada una de estas
reacciones, para determinar su eficiencia siendo sometida a ciertos cambios. Se
determinó que el bicloruro de mercurio nos ayudó a que la reacción no ocurriera
de manera inmediata, sino que la retrasó para así poder observar y obtener los
datos de cada una de las muestras sometidas.
En la tesis realizada por Taimi de la Caridad Boffill Morrell, habla del “Empleo de
un extracto acuoso de ureasa obtenido a partir de la soya en la determinación de
urea en sangre”. Menciona en una parte, que para la medición correcta de la
actividad enzimática es necesario tener en cuenta un grupo de factores que la
modifican, y que pueden provocar la desnaturalización de la enzima. Estos
factores son el pH, la temperatura y el efecto de la concentración de sustrato, que
varían en cada enzima, e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la
cual haya sido extraída, puede presentar diferencias en estos factores, de ahí la
importancia de su medición.
Una práctica de Propiedades catalíticas de la Ureasa realizada en el libro
“Química de Alimentos:Manual de Laboratorio”(Bolaños,N.et al 2003), tiene por
objetivos extraer la enzima ureasa del frijol de soya y evaluar los parámetros
cinéticos de la enzima, llevando a cabo una serie de procedimientos con base en
la extracción de la enzima así como en el efecto de la temperatura, pH,
concentración de sustrato, concentración de la enzima y el tiempo en la velocidad
de la reacción catalizada por la ureasa. Con algunos factores diferente cuenta con
resultados similares que en esta práctica, uno de ellos es que al someter a los
tubos en la incubación a 50°C en un tiempo de 5min los resultados de la ureasa
(mL) son de 0.5 en los cinco tubos (en el caso de la otra práctica se realizaron en
diez tubos pero los resultados fueron iguales en los tubos A) y 30 min la disolución
de HgCl₂ al 1% en gotas es de 4.
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CONCLUSIÓN
Tras realizar los procedimientos indicados en la práctica, observar y analizar los
resultados obtenidos durante esta, podemos decir que la enzima ureasa en
importante para la alimentación de rumiantes y su adecuada acción considerando
su cinética enzimática también ya que degrada la urea en amoniaco que es usado
para la producción de aminoácidos en el organismo del individuo.
Considerándose que esta se encuentre en situación de óptimo desarrollo, ya que
durante esta práctica también analizamos el desempeño de esta tras ser sometida
a cambios de ph, temperatura y la presencia de inhibidores como amortiguador
fosfato, cambiando el desempeño y alterando la estructura de esta.
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BIBLIOGRAFÍA
19
Koolman, Jan. (2004). Bioquímica Texto y Atlas. EDITORIAL MÉDICA
panamericana. Recuperado 9 de abril de 2023, de Bioquímica: texto y atlas
- Jan Koolman, Klaus-Heinrich Röhm - Google Libros
M en C Ma. del Carmen Barrón García, (et al.) (2023). Manual de Prácticas
de Bioquímica para la carrera de MVZ. Recuperado el 5 de abril de 2023.
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