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Laboratorio de biocatálisis: Determinación de actividad enzimática

PRÁCTICA DE LABORATORIO # 2: DETERMINACIÓN DE LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA
LABORATORIO DE BIOCATÁLISIS 19-01
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

OBJETIVOS

Determinar la actividad enzimática en UI.

Reconocer los efectos de factores ambientales como el pH y la temperatura sobre la actividad

catalítica de las enzimas.

1. Introducción.

Las enzimas son proteínas con actividad catalítica encargadas de acelerar la velocidad de las
reacciones biológicas. Su actividad puede ser medida de acuerdo a la cantidad de sustrato
convertido por una unidad de tiempo, lo cual va a estar directamente relacionado con las
condiciones en las que se lleve a cabo la reacción. Factores físicos y químicos tales como la
temperatura y el pH resultan claves para garantizar el buen funcionamiento de una enzima.

Una de las enzimas más utilizadas a nivel pedagógico para la comprensión de los mecanismos en
biocatálisis es la invertasa, la cual se encarga de transformar la sacarosa en glucosa y fructosa. El
principal objetivo de la presente práctica es aprender a determinar la actividad enzimática de una
enzima y comprender el efecto de diferentes factores ambientales, tales como la temperatura y el
pH, sobre su capacidad de catalizar la transformación de un sustrato en un producto.

2. Requerimientos preliminares a la práctica.

2.1. Elabore un diagrama de flujo esquemático donde se describa el procedimiento a realizar

durante el desarrollo de la práctica. Señale los puntos críticos que considere en las diferentes etapas
del proceso.

2.2. Lea de manera comprensiva el contenido de la guía antes de la sesión de trabajo y consulte
sobre los aspectos que no comprenda. Comparta estas inquietudes con sus compañeros y con el
docente hasta que haya claridad conceptual.

2.3. Consulte sobre cómo se hacen los cálculos para la preparación de soluciones.

2.4. Revise la ficha técnica y el certificado de análisis de la enzima invertasa.

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2. Laboratorio de biocatálisis: Determinación de actividad enzimática

2.5. Revise previo a la práctica de laboratorio la hoja de seguridad de los siguientes materiales: (1)
Reactivo DNS (ácido 3,5-dinitrosalicilico), (2) Enzima invertasa, (3) Azul de Coomasie G-250.

2.6. Se recomienda traer para la práctica: Sharpie, cinta de enmascarar, calculadora y tijeras.

3. Fundamento teórico.

Las enzimas son polímeros biológicos con actividad catalítica que posibilitan la coexistencia de un
elevado número de reacciones químicas dentro de la célula. En la mayoría de los casos las enzimas
son de naturaleza proteica, pero también existen casos en que están compuestas de RNA (Murray, et
al 2009; Alvarez, Arenal, Cea, Fernandez, Milan, Morales & Sanchez, 2009).

Las enzimas al ser polímeros con actividad catalítica poseen características y funciones que las
hacen diferentes de los catalizadores químicos; entre las que se encuentran principalmente: (Álvarez
et al, 2009; Voet, Voet & Prat, 2009).

 Mayor velocidad de reacción. Las reacciones catalizadas enzimáticamente alcanzan

velocidades de reacción de 106 a 1012 veces mayores que las reacciones no catalizadas, y
además presentan órdenes de magnitud mayores que las catalizadas químicamente.
 Condiciones de reacción moderadas. Las reacciones enzimáticas son llevadas a cabo a
temperaturas relativamente bajas (inferiores a 100°C), a presión atmosférica y en condiciones
de pH casi neutro. Por el contrario, la catálisis química generalmente requiere temperaturas
elevadas y pH extremo.
 Mayor especificidad de reacción. Lo anterior se da porque las enzimas presentan una gran
selectividad por la identidad de los grupos químicos de sus sustratos y productos; de tal manera
que rara vez se obtienen productos colaterales o secundarios.
 Capacidad de regulación. La actividad de algunas enzimas varía de acuerdo con la
concentración de otras moléculas diferentes de sus sustratos. Los mecanismos de regulación
incluyen la inhibición, control alostérico, modificación covalente de la enzima y variación en la
cantidad de enzima sintetizada.

La actividad catalítica de una enzima (E) involucra la unión de esta con su sustrato (S) para formar
un complejo enzima-sustrato (ES) y formar producto (P).

𝐸 + 𝑆 ↔ 𝐸𝑆 ↔ 𝐸 + 𝑃

En la Figura 1 se presenta el mecanismo de interacción de una enzima con sus sustratos, y el grado
de complementariedad física y geométrica para que se pueda llevar a cabo la unión y formación del
complejo ES (Figura 1a). Inicialmente como se muestra en la Figura 1b, los sustratos se unen a la
enzima libre mediante su centro activo a través de interacciones no covalentes tales como puentes
de hidrógeno, enlaces iónicos e interacciones hidrofóbicas. Luego de la unión del complejo ES, se
da la formación del producto y la liberación de este último del centro activo de la enzima (Cooper,
2000; Koolman,Klaus-Heinrich Röhm, 2004; Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky and
Jackson, 2011; Voet et al, 2009).

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2. Laboratorio de biocatálisis: Determinación de actividad enzimática

Figura 1. Mecanismo de catálisis enzimática. 1a. Complementariedad geométrica y física del

complejo enzima-sustrato. 1b Formación de complejo ES y generación de productos.

Las enzimas aceleran las reacciones biológicas al disminuir la energía de activación de una reacción
dada, sin alterar su equilibrio. Su mecanismo de acción consiste en la formación de un complejo
entre la enzima y el sustrato (ES), el cual realiza la reacción química adecuada y permite la
recuperación de la enzima original en el momento en que el complejo enzima-producto se rompe
para liberar al producto.

Cada enzima es específica, en el sentido que puede actuar solamente sobre cierto sustrato o grupo
de sustratos. Esto no quiere decir que hay una enzima para cada sustrato, sino que cada enzima
actúa sobre sustancias que tienen en común una cierta identidad molecular. La especificidad de la
enzima se muestra por el simple hecho de que a partir del mismo sustrato, se forman diferentes
productos finales cuando actúan diferentes enzimas (Meyer et al., 1970).

La acción catalítica de una enzima, es decir, su actividad enzimática, se determina como la cantidad
de sustrato convertido (o producto formado) por unidad de tiempo. Esta actividad enzimática puede
ser expresada de muchas formas, pero la más comúnmente usada es el sistema internacional de
unidades o unidades internacionales (Ui) definido como: la cantidad de enzima necesaria para
convertir 1 µmol sustrato (o de formar 1 µmol de producto) en un minuto.

La medición de la actividad se hace a través de la cuantificación del incremento de la velocidad de

reacción en condiciones perfectamente definidas, es decir, midiendo la diferencia del recambio
entre la reacción catalizada y la reacción no catalizada en un tiempo determinado. (Koolman,K-
Heinrich R, 2004; H). La acción catalítica o actividad enzimática recibe la influencia de numerosos
factores que deben ser controlados y optimizados en su totalidad si se desea que las cuantificaciones
tengan sentido y sean reproducibles. Ante esto, existen factores que afectan dicha actividad
enzimática, y entre los más importantes se encuentran la temperatura y el pH (ver Tabla 1).

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2. Laboratorio de biocatálisis: Determinación de actividad enzimática

Tabla 1. Algunos factores que afectan la actividad enzimática (Adaptado de Martínez et al., 2007)
Factores Descripción
A bajas temperaturas las enzimas disminuyen su actividad ya que se ven
inactivadas de forma reversible; por el contrario, si la temperatura se eleva
Temperatura
demasiado (respecto a su T optima), ocurre la desnaturalización de la enzima
asi como la pérdida de cualquier tipo de actividad.
La mayoría de las enzimas realizan su función catalítica a pH comprendidos
entre 6-8; la variación de estos niveles genera principalmente daños
pH
irreversibles como la desnaturalización de las proteínas, inestabilidad en los
parámetros cinéticos e inestabilidad en el complejo enzima-sustrato.

Para el estudio de las enzimas y la influencia de diferentes factores sobre su actividad a nivel
pedagógico, se ha empleado como modelo la enzima invertasa, β-fructofuranosidasa o también
llamada sacarasa (EC 3.2.1.26), la cual pertenece al grupo de las hidrolasas y cataliza la hidrólisis
de sacarosa a glucosa y fructosa (Ashokkumar et al., 2001). La producción de invertasa ha sido
reportada en diferentes microorganismos tales como: Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis,
Xanthophyllomices y hongos filamentosos del genero Aspergillus, Aureobasididum y Penicillium (
Readdy et al., 2010; Mussato et al., 2009). Normalmente, S. cerevisiae ha sido el microorganismo
de elección para la producción de la invertasa por su alta actividad enzimática.

La mayoría de los métodos para medición de actividad invertásica están basados en la

determinación de azúcares reductores como resultado del corte enzimático del enlace entre la
glucosa y la fructosa. La medición de actividad de la enzima invertasa se hace generalmente
haciendo uso de la técnica de DNS, la cual permite la determinación de la concentración de
producto formado (glucosa y/o fructosa) por unidad de tiempo. La actividad de la enzima invertasa
se expresa en términos de unidades internacionales de actividad enzimática (Ui) como µmol de
glucosa/min (EC 1), la cual a su vez se puede expresar en unidades de actividad volumétrica
(Ui/mL) (EC 2) o actividad específica (Ui/mg) (EC 3).

EC 1 [𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜] (µ𝑚𝑜𝑙)
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 [𝑈𝑖] =
𝑡(𝑚𝑖𝑛)

EC 2 [𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜](µ𝑚𝑜𝑙)
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑈𝑖 𝑚𝐿 =
𝑡(𝑚𝑖𝑛) × 𝑉𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛(𝑚𝐿)

EC 3 [𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜](µ𝑚𝑜𝑙)
𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 [𝑈𝑖/𝑚𝑔] =
𝑡(𝑚𝑖𝑛) × 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎(𝑚𝑔)

4. Seguridad durante la práctica

4.1. Equipos de protección personal.

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

 Bata de laboratorio
 Guantes de nitrilo

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 Gafas de seguridad
 Zapatos cerrados

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

4.2. Manejo de residuos químicos y biológicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas de laboratorio en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

3. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica.

NOTA: Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo

5. Materiales y métodos

5.1 Materiales y reactivos

Cada grupo contará con los materiales descritos en la Tabla 2 para la elaboración de la práctica.
Cabe resaltar que cada grupo empleará el buffer acetato y la solución de sacarosa ajustados al pH de
trabajo según la distribución de grupos.

Tabla 2. Materiales y equipos requeridos para el desarrollo de la práctica de actividad enzimática.

Materiales y equipos Reactivos
Celdas para espectrofotómetro (4) Reactivo DNS (ácido 3,5-dinitrosalicilico) (2 mL)
Tubos de ensayo de 20 ml con tapa rosca (3) Reactivo azul de Coomasie G-250 (5 mL)
Pipeta graduada de 5 ml (x1) Enzima invertasa (1 g), preparar solución madre
de 10 mg/mL (el laboratorista la prepara).
Micropipeta de 10-100 μL (con puntas) Buffer acetato de sodio 0.1 M ajustado con ácido
acético glacial, diferentes pHs: 4.6, 5.3 y 6.0
Micropipeta de 100-1000 μL (con puntas) Solución de sacarosa 10 mg/mL en buffer acetato
0.1 M diferentes pHs: 4.6, 5.3 y 6.0
Pipeteador (1)
Frasco lavador
Espectrofotómetro Genesys 20
*El espectrofotómetro será compartido entre 2 grupos. Cada mesa tendrá disponible 2 equipos. En
total se usarán seis.

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5.2 Determinación de actividad enzimática (UI)

Se realizarán ensayos para la medición de actividad de la enzima invertasa a diferentes condiciones

de temperatura y pH, por lo cual se establecerá para cada pareja un valor de temperatura y pH
determinado de acuerdo a la Tabla 3.

Tabla 3. Condiciones de temperatura y pH de cada grupo de trabajo.

Mesa de trabajo Grupo pH Temperatura (°C)
A 4.6
1 B 5.3 25 (Temperatura
ambiente)
C 6.0
D 4.6
2 E 5.3 55
F 6.0
G 4.6
3 H 5.3 90
I 6.0

Antes de realizar el ensayo marque los 3 tubos de ensayo a utilizar (de 20ml), y realice el siguiente
procedimiento:

1. Preparar la dilución de enzima adecuada a partir de una solución madre de 10 mg/mL, con el fin
de llevarlo a una concentración 1 mg/mL. Para esto, adicione 1 ml de la solución madre a uno
de los 3 tubos de ensayo y diluya con 9 ml de buffer adecuado (Tubo 1: enzima diluida 1/10).
2. Adicione 325 μL de la solución de sacarosa a uno de los tubos (Tubo 2: ensayo enzimático), y
250 μL de buffer acetato de sodio 0.1 M a otro de los tubos (Tubo 3: ensayo control).
3. Tape los 3 tubos anteriormente preparados (para evitar la evaporación) y precalientelos a la
temperatura correspondiente (acorde a la combinación asignada de pH y T) durante 3 min.
4. Para comenzar la reacción, adicione 325 μL de la enzima invertasa diluida (Tubo 1) para el
ensayo enzimático (Tubo 2), y 250 μL para el ensayo control (Tubo 3).
5. Agitar la mezcla suavemente y calentar a la temperatura de trabajo asignada para cada grupo
durante exactamente 10 min (ver Figura 2).
6. Enfriar las muestras en baño de hielo durante 60s para detener la reacción.
7. Tome 100μl del tubo de ensayo enzimático (Tubo 2) y agréguelo en un nuevo tubo (Tubo 4),
adicione en este tubo 400μl de buffer. Para alcanzar una dilución 1/5 del ensayo enzimático
(e.g. Tubo 2).
8. Tome 50μl del tubo de ensayo enzimático (Tubo 2) y agréguelo en un nuevo tubo (Tubo 5),
adicione en este tubo 450μl de buffer. Para alcanzar una dilución 1/10 del ensayo enzimático
(e.g. Tubo 2). Ver tabla 4.
9. Agregar 500μL de reactivo DNS tanto para el ensayo enzimático (Tubo 2), como para el
ensayo control (Tubo 3), ensayo con dilución 1/5 (Tubo 4), y ensayo con dilución 1/10 (Tubo
5), agitar.
10. Calentar los 4 tubos a una temperatura de 90°C por 5 minutos.

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11. Enfriar utilizando baño de hielo durante 30s, y adicionar 3.5 mL de agua destilada a los 4
tubos, agitar.
12. Leer en el espectrofotómetro a 540 nm. Recuerde calibrar con el blanco (Tubo 3: ensayo
control). Registre los datos de absorbancia obtenidos en la Tabla 4.

Figura 2. Ensayo enzimático para determinación de actividad invertasa.

5.3 Determinación de actividad enzimática especifica (UI/mg)

Luego de medir los azúcares reductores, se determinará la concentración de proteína de enzima

invertasa usada en los experimentos anteriores empleando la metodología de Bradford. Para la
medición de proteína en la muestra de enzima se seguirá este procedimiento:

1. Adicione en una celda 100 μL de la solución de enzima madre (10 mg/mL), y en otra 100 μL de
agua destilada (blanco). A cada muestra, adicionar 1.9 mL de reactivo Azul de Coomasie G-
250, y mezclar por reflujo.
2. Esperar 5 minutos para leer en el espectrofotómetro a 595 nm. Recuerde calibrar el
espectrofotómetro con el blanco, anote los resultados en la Tabla 5.

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2. Laboratorio de biocatálisis: Determinación de actividad enzimática

6. Bibliografía

Alvarez, G, P. Arenal., A. Cea., L. Fernandez., R. Milan., S.Morales & C. Sanchez.(2009).

Bioquimica y Biologia molecular. UNAM. ISBM. 970-32-1866-0.
Ashokkumar, B., K. Nagaraja & G. Paramasamy.(2001). Optimization of media for B-
Fructofuranosidase by Aspergillus Niger in submerged and solid state fermentation. Proc.
Biochem. 37: 331-338.
Cooper GM. (2000). The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer
Associates. The Central Role of Enzymes as Biological Catalysts. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9921/
Gusakov A. V., Kondratyeva E. G., and. Sinitsyn A. P. (2011) Comparison of two methods for
assaying reducing sugars in the determination of carbohydrase activities. International Journal
ofAnalytical Chemistry, vol. 2011, Article ID 283658, 4 pages.
Koolman,K & Heinrich R. (2004). Bioquímica: Texto Y Atlas. 3era Ed. Mdrid. ISBN.84-7903-724-
35. Pag 85-104
Linde, D., I. Macias, L. Fernandez, F. Plou, A. Jimenez & M. Fernandez. (2009). Molecular and
Biochemical Characterizacion of a B-Fructofuranosidase from Xanthophyllomyces
dendrorhouse. Appl. Envirion. Microbiol.
Meyer, H-P. 2006. Chemocatalysis biocatalysis (biotransformation): some thoughts of a chemist
and of a biotechnologist. Org Process Res Dev. 10: 572-580.
Murray, R, D. Bender., K. Bothan., P. Kennelly., V. Rodwell & P. Weil.(2009). Happer Bioquimica
Ilustrada. C.P. 01376, México, D.F. ISBN: 978-607-15-0304-6
Mussato, S., L. Rodriguez & J. Teixeira.(2009). B-Fructofuranosidase Production by repeated batch
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928
Reddy, P., G. Reddy & M. Sulochana.(2010). Highly thermostable B-Fructofuranosidase from
Aspergillus niger PSSF21 and its applications in the synthesis of fructo-oligosacharides from
agroindustrial residue. Asian J. Biotechnol. 2(2):86-98.
Reece J; Urry L; Cain M; Wasserman S; Minorsky P and Jackson R. (2011). Campbell Biology
9th edition. Pearson Education Inc
Voet D, Voet J &Pratt C. (2009) Fundamentos de Bioquímica: la vida a nivel molecular. 2da
edición (1264 p). Editorial Médica Panamericana.

Elaborado por: M.Sc. Maria Isabel Rodriguez y Dr. Nelson Caicedo.

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2. Laboratorio de biocatálisis: Determinación de actividad enzimática

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

DATOS DEL LABORATORIO

Tabla 4. Absorbancia de los ensayos con enzima invertasa (método de DNS).

Absorbancia
Sin
1/5 1/10
dilución
Ensayo enzimático

Tener en cuenta que si el valor de la absorbancia supera el valor más alto de la curva patrón debe
repetirse la determinación (DNS) haciendo una dilución adecuada de la muestra.

Tabla 5. Concentración de proteína (método de Bradford).

Absorbancia solución de enzima

Enzima invertasa

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Anexo 1: Esta práctica tiene Informe In-situ

Antes de la practica:

Los estudiantes deben saber calcular actividad, deben llevar a clase la curva de calibración de
azúcares reductores (DNS) y la curva de determinación total de proteínas (Bradford) obtenida en la
práctica1. En caso tal de que se le olvide al instructor indicar con anterioridad que deben llevar
dichas curvas, se puede hacer entrega en clase de la ecuación de la curva de calibración para ambos
procedimientos.

Los estudiantes deben consultar en la literatura sobre las condiciones de trabajo adecuadas para la
enzima invertasa.

Durante la práctica: El profesor debe indicar a los estudiantes que la práctica experimental durará
2 horas, se empleara 30 minutos en el Informe In-situ, y se dejaran 30min para organizar y dejar
limpio el laboratorio.

Al final de la Practica: Luego de pasada 2 horas de práctica, se les pide a las parejas de laboratorio
que procedan con el Informe In-situ.

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