UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
“Dr. Wilfredo Erwin Gardini Tuesta”

ACREDITADA POR SINEACE

RE ACREDITADA INTERNACIONALMENTE POR RIEV

BASES MOLECULARES Y CELULARES DE LA

MEDICINA II
SEMESTRE ACADÉMICO: 2023-I

DOCENTES RESPONSABLES DE LA ASIGNATURA

SEDE FILIAL ICA : Mg EDWN A. LIHERNANDEZ
 Semana 15

TÉCNICAS EN BIOLOGÍA CELULAR

Y MOLECULAR II
 TECNOLOGÍA DEL DNA
RECOMBINANTE
Endonucleasas de restricción
• Durante el decenio de 1970 se encontró que bacterias contenían
nucleasas que reconocían secuencias cortas de nucleótidos del
Secuencia particular reconocida por la
DNA y dividían la columna central de DNA en sitios específicos
enzima EcoR1:
en ambas cadenas de la hélice doble.

• Tales enzimas se conocen como ENDONUCLEASAS DE

RESTRICCIÓN o ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (en las bacterias
funcionan para destruir el DNA viral que pudiera entrar a la célula,
lo que restringe el crecimiento de los virus).

• Se aíslan enzimas de varios cientos de organismos procariotas

distintos que, en conjunto, reconocen > 100 secuencias de Este segmento de DNA tiene simetría
nucleótidos diferentes. rotatoria doble porque puede girarse
Las secuencias que la mayor parte de las enzimas reconoce miden 4 180° sin que la secuencia de bases
a 6 nucleótidos de largo y se caracterizan por un tipo particular cambie.
de simetría interna.
Secuencias de reconocimiento para algunas endonucleasas de restricción de tipo II
• El uso de las enzimas de restricción permite
cortar el DNA del genoma humano, o de
cualquier otro organismo, en un conjunto bien
definido de fragmentos específicos.

• Una vez que el DNA de un individuo particular

se digiere con una de estas enzimas, los
fragmentos obtenidos pueden separarse
mediante ELECTROFORESIS EN GEL.

• Las diferentes enzimas separan la misma

preparación de DNA en conjuntos distintos de
fragmentos.
 Clonación de DNA

Ejemplo de clonación de DNA con plásmidos

bacterianos.

El DNA se extrae de células humanas, se

fragmenta con EcoR1 y los fragmentos se
insertan en una población de plásmidos
bacterianos.

Una vez que la célula bacteriana captó un

plásmido recombinante del medio, la célula da
origen a una colonia de células que contienen la
molécula de DNA recombinante.
Plásmido pBR322.
Formación de una molécula de DNA recombinante.

Una preparación de plásmidos bacterianos se trata con una

enzima de restricción que hace un solo corte dentro de cada
plásmido bacteriano.

Dicha enzima se utiliza para fragmentar una preparación de DNA

genómico humano en pequeños fragmentos.

Como se trataron con la misma enzima de restricción, el DNA

del plásmido dividido y los fragmentos de DNA humano tienen
extremos adherentes.

Cuando estas dos poblaciones se incuban juntas, las dos

moléculas de DNA se unen en forma covalente entre sí y luego
se sellan también en forma covalente con la ligasa de DNA, para
formar una molécula de DNA recombinante.
Video sobre clonación:
https://www.youtube.com/watch?v=IzBDO_YFNW4&feature=youtu.be
 REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
(PCR)
La PCR es una reacción enzimática in vitro que amplifica
millones de veces una secuencia específica de DNA durante
varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es
copiada fielmente.

La mezcla de reacción contiene: la muestra de DNA (o el cDNA,

obtenido a partir del RNA), una DNA polimerasa, los 4
desoxinucleótidos y 2 oligonucleótidos primers que son
complementarios a los extremos 3´ de las dos cadenas de la
secuencia deseada.

Cada ciclo consta de: separación de cadenas de DNA, unión de

primers a los extremos 3´ de la secuencia objetivo, y extensión
de los primers por la DNA polimerasa.

El DNA objetivo duplica su concentración en cada ciclo.

Enzima: ADN polimerasa
La más usada con frecuencia es la Taq DNA polimerasa ⇨
proviene de la bacteria termófila Thermus aquaticus la cual
vive en condiciones de temperatura muy altas.
Es una enzima termoestable.

Primers o cebadores: son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la

secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Tamaño: 15-25 pb.
Son dos secuencias diferentes de primers: una denominada «forward» o sentido y otra
«reverse» o antisentido.
ETAPAS DE LA PCR

Desnaturalización: la muestra se calienta a 90 -

95°C para separar las cadenas de DNA.

Alineamiento: la temperatura se reduce a 55°C, lo

suficientemente baja para que los primers se
hibriden con las cadenas de DNA.

Extensión: la temperatura se eleva a 75°C, y la

DNA polimerasa sintetiza nuevas cadenas de
DNA extendiendo los primers.

Los tres pasos se repiten hasta 40 veces.

Video:
https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU
 PCR EN TIEMPO REAL

● El término en tiempo real se refiere a que la detección de

los productos amplificados sucede en cada ciclo de la
reacción.

● En la PCR en tiempo real la acumulación de ADN

amplificado es detectado y cuantificado a medida que la
reacción avanza, es decir: “En tiempo real” esto se logra
incorporando una molécula fluorescente que se asocia al
ADN amplificado, donde el incremento de esta
fluorescencia es la proporcional al incremento de la
cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción.

● El producto de amplificación es monitoreado conforme

transcurre la reacción sin que haya la necesidad de que
sea manipulado en un gel de agarosa.
Termociclado
r
 SECUENCIAMIENTO DEL DNA

La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro

componentes básicos químicos, llamados "bases", que forman la
molécula de ADN.

La secuencia les informa a los científicos la clase de información

genética que se transporta en un segmento específico de ADN. Por
ejemplo, los científicos pueden usar la información de las secuencias
para determinar qué tramos de ADN contienen genes y qué tramos
transportan instrucciones regulatorias, que activan o desactivan Frederick Sanger
genes. Además, los datos de las secuencias pueden resaltar los
cambios en un gen que pueden causar enfermedades.

El Proyecto Genoma Humano, completado en 2003, necesitó más de

una década usando la secuenciación de Sanger para determinar el
genoma de un solo individuo.
Ahora es posible secuenciar el genoma humano en cuestión de días. El tiempo y el costo de la secuenciación
han disminuido drásticamente gracias a un grupo de tecnologías de secuenciación masiva denominado Next
Generation Sequencing (NGS).

Los métodos NGS son más rápidos que la secuenciación de Sanger porque secuencian millones de pequeños
fragmentos de ADN de muchas partes diferentes del genoma al mismo tiempo, en lugar de leer cada vez un
solo fragmento de ADN de una región del genoma. Debido a que todas estas reacciones están ocurriendo al
mismo tiempo, NGS también se conoce como secuenciación masiva.

Un beneficio adicional de NGS es que la sensibilidad para detectar alteraciones que están presentes en un
nivel muy bajo es mucho mejor que con la secuenciación de Sanger. Con la técnica NSG se pueden detectar
mutaciones si están presentes en tan solo un 2-5 % del ADN analizado.
 Secuenciamiento SMRT
(single molecule real time sequencing)

El secuenciamiento en tiempo real de una única molécula de ADN es una tecnología de secuenciamiento por
síntesis de una molécula de ADN fija.
La secuenciación se realiza sobre un chip que contiene muchas guías de onda de "modo cero" (ZMW).

ZMW: estructura de confinamiento de nanofotones que

consiste en una cavidad circular recubierta de una
película de aluminio sobre un sustrato de sílice.

En el fondo de la ZMW se fija una ADN polimerasa con

una molécula de ADN molde de cadena sencilla.
Cada una de las 4 bases nitrogenadas se encuentra marcada con una molécula fluorescente diferente que
permite su identificación durante la secuenciación por síntesis.

La molécula fluorescente se une al grupo fosfato del nucleótido, y cuando éste se incorpora a la cadena de
ADN, el complejo fluoróforo-fosfato es liberado como consecuencia de la formación del enlace fosfodiéster que
tiene lugar durante la elongación de la cadena de ADN ⇨ la señal de fluorescencia difunde fuera del área de
detección y no se detecta más.

La señal procedente de la
incorporación de un nucleótido
por parte de la ADN polimerasa
se detecta durante la síntesis de
ADN.

SMRT chip
Annu. Rev. Anal. Chem. 2013. 6:287–303
Desde la introducción de la tecnología de la información en la investigación biomédica
han surgido una gran cantidad de herramientas computacionales y bases de datos que
han contribuido con importantes avances científicos.

https://doi.org/10.11144/Javeriana.umed61-2.sngs
Actualmente, la bioinformática se aplica en
distintas áreas médicas:

en Oncología se estudian distintas alteraciones

del genoma donde pequeñas variaciones pueden
afectar a la eficacia o toxicidad de los
tratamientos con quimioterapia;
en salud prenatal, permite identificar alteraciones
en el feto de una manera más sencilla, simple y
económica; y en enfermedades raras, favorece
diferenciar e identificar de manera más precisa
enfermedades que tienen un complejo
diagnóstico clínico.

MEDICINA - Volumen 79 - N° 6/1 - NÚMERO ESPECIAL 80 ANIVERSARIO, 2019