FUNDACIÓN DE LAS AMÉRICAS PUEBLA

ESCUELA DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE NANOBIOLOGÍA

DRA EDITH FABIOLA MARTÍNEZ PÉREZ

2019
 REGLAMENTO BÁSICO DE SEGURIDAD

El laboratorio de química es un lugar que puede ser peligroso si no se

respetan las normas básicas de seguridad. La mayoría de los productos químicos
son nocivos de una u otra forma, pero si se manipulan correctamente no hay razón
ninguna para que puedan afectarnos.

Las reglas esenciales para la seguridad en el laboratorio se pueden clasificar

en dos apartados: precauciones que siempre hay que seguir y acciones que nunca
se deben realizar.

SIEMPRE

1. Familiarizarse con el Reglamento de Seguridad del laboratorio donde se

trabaje, en especial:

a) Salida de emergencia.
b) Ruta de evacuación.
c) Extintor.
d) Extractores y ventiladores.
e) Botiquín.
f) Regadera de seguridad.
g) Lava ojos.
h) Teléfonos de emergencia.
i) Servicios (Agua, Luz, Gas).
j) Zona de desechos tóxicos.

- Llevar gafas protectoras siempre. Las salpicaduras son relativamente frecuentes

y los ojos son muy sensibles hacia la totalidad de los materiales orgánicos. Si Ud.
usa lentes de contacto, deberá quitárselos antes de entrar al laboratorio.

- Llevar ropa adecuada. Es imprescindible llevar bata, y evitar llevar pantalones

cortos, sandalias. El cabello si lo tiene largo, deberá recogerlo el tiempo que dure la
práctica, etc.

- Leer las instrucciones de su práctica, antes de empezar un experimento, además

de escuchar atentamente las recomendaciones de su Profesor. Es importante que
quede claro lo que Ud. hará ese día en su laboratorio.

- Antes de utilizar un aparato, comprobar que funciona correctamente. Aquí se

puede englobar el material de vidrio, el cual hay que verificar que no tiene ninguna
rotura antes de agregarle un producto.

- Manejar todos los productos químicos con gran cuidado. Estos pueden ser
tóxicos, corrosivos, inflamables, explosivos, con posibles propiedades
cancerígenas, etc. Revisar antes sus hojas de seguridad.
Acostúmbrese a leer las etiquetas de sus frascos antes de agregarlos a una
reacción, debe estar seguro que es el reactivo y la concentración que pide su
práctica, además de que las etiquetas de frascos originales proporcionan
información de toxicidad, almacenaje, propiedades físicas, pureza, etc.

- Para evitar el contacto de los productos con la piel, es recomendable utilizar

guantes. En caso de contacto, en general, retire el reactivo con algún papel o tela y
proceda a lavar la zona con abundante agua.

- Mantener el área de trabajo limpia.

- Recoger líquidos o sólidos que se derramen inmediatamente. Para ácidos y bases

conviene neutralizar previamente. Si el derrame es muy grande avisar al Personal
de los Laboratorios, antes de iniciar cualquier acción y desalojar el espacio.

- Debe dejar material, mochilas, libros en lugares en los que no interfieran el paso.

- Deberá tomar únicamente la cantidad de reactivos que se requiera para el

experimento que va a realizar en el laboratorio.

- Si tiene que desechar algún reactivo, pregunte dónde y cómo debe hacerlo.

- Siempre deberá vigilar su experimento mientras lo está realizando.

- Preguntar al Profesor en caso de duda.

- En caso de accidente, avisar inmediatamente al Profesor.

- Lavarse las manos siempre, antes de abandonar el laboratorio.

- Si en el laboratorio maneja cilindros de gas comprimido, pueden explotar, debe

mantenerlos limpios, en espacios libres, y encadenados a un lugar previamente
asignado.

NUNCA

- Comer o beber en el laboratorio.

- Fumar en el laboratorio.

- Inhalar o probar productos químicos.

- Distraer a los compañeros que estén trabajando.

- Correr en el laboratorio.

- Trabajar solo.
- Llevar a cabo experimentos no autorizados.
- No guarde reactivos peligrosos dentro de su gaveta.

- Olvidar que cualquier reactivo no etiquetado (desconocido) es peligroso.

- No se quite sus lentes o su bata de seguridad cuando este desechando reactivos.

- Nunca se debe encender un mechero antes de comprobar que no hay ningún

líquido inflamable en las proximidades. Uno de los principales peligros en el
laboratorio es el fuego.

- Olvidar que el equipo que requiere calentamiento representa un peligro debido a

que puede causarle quemadura, utilice pinzas o guantes resistentes al calor para su
manejo.

- El equipo eléctrico puede provocar corto circuito o incendios, no lo conecte si

esta mojado, no trate de repararlo.

- Los equipos en movimiento, por ejemplo centrífugas, bandas de bombas de vació,

motores, etc. pueden jalar su ropa o abrirse repentinamente exponiéndolo a
materiales peligrosos. Espere a que el equipo haya parado completamente para
efectuar cualquier acción.

No hay grandes misterios en la seguridad de un laboratorio, si Ud. aplica su

"sentido común" y sigue las reglas de seguridad básicas, no tendrá
problemas.

El material que se coloque en las incubadoras, refrigeradores y agitadores

del Departamento, deberán estar perfectamente identificados con los
siguientes datos: Nombre de la materia, número de equipo o nombre del
alumno, fecha de entrada y de salida. Cada semana se revisará el equipo y el
material que no esté identificado correctamente o con fecha de salida
vencida, serán retirados.

MATERIAL POR EQUIPO.

1. Gafas de seguridad para laboratorio.

2. Marcador permanente para vidrio.
3. Encendedor.
4. Masking tape
5. Jabón líquido
6. Franela
 BITÁCORA DEL LABORATORIO

OBJETIVOS.

1. Conocer el formato y contenido de la bitácora de laboratorio

ANTECEDENTES

Una parte esencial del trabajo técnico y científico es el registro y la comunicación

de los resultados de un experimento. El registro de los resultados se hace
generalmente en una libreta que debe estar a disposición para la consulta de todas
las personas que trabajan en le laboratorio :

Título: Consiste en unas cuantas palabras que definen lo más exacto posible el
contenido del reporte.

Introducción: Se deberá elaborar una introducción que sea acorde al tema tratado
durante la práctica de laboratorio correspondiente, la cual debe ser consultada en
literatura especializada en cada tema.

Objetivos: En esta sección se debe de mencionar las metas que se persiguen al

realizar una práctica o estudio. Los objetivos deben de especificarse clara y
objetivamente, de tal forma que puedan ser evaluados.

Resultados. Los resultados se pueden entender mejor cuando se presentan en

forma de tablas o figuras (dibujos y gráficas). Estos deben de ser numerados
(Tabla 2, Figura 20), tener una leyenda explicativa, donde se puede incluir
información como: morfología colonial, morfología microscópica, resultados de
pruebas bioquímicas

Ejemplos:
 Tabla 1 Morfología colonial de bacterias aisladas en medio de EMV.

Especie

Escherichia coli Colonias azul-negras con brillo metálico

verde

Salmonella typhimurium Colonias sin color a de color ámbar

1. Los nombres de género y especies aparecen en letras cursivas. La inicial del

género es con mayúscula y la especie. Otros nombres de categorías científicas se
deben escribir con la inicial en mayúscula. Ejemplo: Phylum Ciliophora, Familia
Paramecididae.

Figura 1

Especimen de Paramecium sp. observado en la práctica. Tamaño aproximado 400

m

La presentación de dibujos, ademas de comunicar los resultados, centra nuestra

atención sobre las características a estudiar: Los dibujos o fotografías en su
bitácora deben de identificar claramente las características bajo estudio. Cuando
se trata de dibujos de observaciones bajo el microscopio se debe de indicar la
magnificación.
Además de las tablas y figuras en la sección de resultados se deben de incluir un
texto que resume y resalta lo más importante por ejemplo "como se ve en la
figura1, Paramecium presenta tanto macro como micro núcleo”

Es muy importante presentar los resultados tal y como se obtuvieron, aun y

cuando no sea como se esperaban.

Conclusiones: En esta sección se debe de relacionar los resultados obtenidos con

los temas planteados en la introducción del manual de prácticas, tratando de evitar
el ser repetitivo. Explique aquí sus resultados ¿fueron tal como se esperaban?. De
no haber sido como se esperaban ¿como se explica esto? Mencione los principios o
características básicas de los organismos se demostraron u observaron en la
práctica.

Respuestas al cuestionario de investigación: Se deben basar en referencias

especializadas y actualizadas.

Bibliografía consultada: Al final incluya la lista de esta referencias con el formato

APA que se ejemplifica a continuación

Margulis L. H. I. Mckhann & L. Olendzenski. 1993. Ilustrated Glossary of Protoctista.

Jones and Bartlett Publishers Boston, London

Marquardt W. C. & R. S. Demaree 1985. Parasitology. Macmillan Pub. Co. New York,
London
 CONOCIMIENTO, MANEJO Y PRECAUCIONES DEL MICROSCOPIO

OBJETIVO

Que el alumno identifique cada una de las partes que componen al microscopio
compuesto. Que el alumno maneje de manera adecuada el microscopio.

ANTECEDENTES

En el estudio de los microorganismos, uno de los instrumentos esenciales es el

microscopio, el cual puede ser simple o compuesto.
El holandés Antony van Leewenhoek, fue el primero en usar el microscopio como
instrumento de investigación de la microbiología, basándose en el microscopio
hecho por Robert Hook, él usó un microscopio simple en 1674 para observar
bacterias y protozoos.
Sin embargo,la utilidad del microscopio simple se ve restringida, debido a su
limitada capacidad de amplificación, por otra parte el microscopio compuesto
tiene mucha aplicación en los laboratorios científicos y en la industria.
La función principal del microscopio es la de permitir distinguir estructuras y
puntos que están separados por distancias muy pequeñas, a esto se le conoce como
poder de resolución.
La resolución es la parte más importante de la amplificación, ya que no sólo es
obtener la imagen más grande sino que es indispensable observar con claridad los
detalles finos.
La resolución depende de muchos factores entre los que se incluyen la iluminación,
la naturaleza del espécimen y del mismo investigador.
El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de
onda de la luz utilizada, mientras más corta es la longitud de onda, tanto mayor es
el poder de resolución.
Los microscopios se han modificado, entre estos se incluyen instrumentos de
constraste de fases y campo oscuro.
En la microscopía de contraste de fases, el contraste entre un espécimen
transparente y el medio circundante se incrementa sin alterar la transparencia del
espécimen.
En el caso de campo oscuro, el contraste del espécimen se aumenta en relación al
fondo debido a que la imagen se forman de una luz difractada, reflejada o
refractada produciendo una imagen brillante sobre un fondo oscuro el cual
permitecaptar estructuras diinutas que por lo general son tan pequeñas que es
difícil observarlas en forma directa.
El microscopio electrónico es otro ejemplo de un instrumento que proporciona
mayor poder de resolución mediante el empleo de irradiación luminosa de
longitudes de onda más corta. El haz de electrones que utiliza como fuente de
iluminación en un vacío posee una longitud de onda mucho más corta que la luz
ordinaria, la cual sobrepasa en mucho a cualquier otro sistema óptico antes
mencionado.

MATERIALES

 Microscopio compuesto
 Laminillas fijas
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Papel para limpiar los lentes

Sistema óptico
 Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del
objetivo
 Objetivo: lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta
 Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación
 Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el condensador
 Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador

Sistema Mecánico
 Soporte: mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo
 Platina: lugar donde se deposita la preparación
 Revólver: contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite girar y cambiar
los objetivos
 Cabezal: contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o
binocular
 Tornillos de enfoque: macrométrico que aproxima el enfoque y el
micrométrico que consigue el enfoque correcto.

METODOLOGÍA

MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la

platina completamente
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzad metálicas
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x o colocar el de 10 aumentos
(10x) si la preparación es de bacterias
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetico a la preparación, empleando
el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y
no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el
objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o
ambos.
 b. Mirando ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente
el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se
observe algo nítido, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque
fino.
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele
ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque
fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es
preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación
desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la
preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:
incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y
mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se
enfocó con el objetivo de inmersión.
6. Empleo del objetivo de inmersión
a. Bajar totalmente la platina
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de
luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que
echar el aceite.
c. Girar el revólver hacia el objetico de inmersión dejándolo a medio
camino entre éste y el de 40x
d. Colocar una gota mínima de aceite deinmersión sobre el círculo de
luz
e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del
objetivo de inmersión
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta
que la lente toca la gota de aceite. En este momento se nota como si
la gota ascendiera y se adosara al lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo
entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aún
menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy
grande.
h. Una vez que se haya puesto aceite de inmersión sobre la
preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo de 40x sobre
esa zona, pues se manchará de aceite. Por tanto, si desea enfocar
otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el
paso 3.
i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina
y se coloca el objetico de menor aumento girando el revólver. En este
momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se
debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel
especia para óptica. Comprobar también que el objetivo de 40x esté
perfectamente limpio.
 MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento

en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la
platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto
con su funda para evitar que se ensucien y dañen los lentes. Si no se va a
usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario
para protegerlo del polvo.
3. Nunca hayq eu tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de óptica
4. No dejar el portaobjetos puesto en la platina si no se está utilizando el
microscopio
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que
queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica en un solo sentido
y con suavidad. Si el aceite ha lleado a secarse y pegarse en el objetivo, hay
que limpiarlo con una mezcla de alcohol:acetona (7:3) o xilol. No hay que
abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos solventes en
exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico,
micrométrico, platina, revólver y condensador)
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la
mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No
cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo mismo ni hacerlo
mientras se está observando a través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella
algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un
paño humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siembre los microscopios al finalizar la
sesión práctica y al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y
revisión de los mismos.

Actividad práctica

1. Observe el pan o tortilla y el agua estancada a través del objetivo de menor

aumento
2. Repetir las observaciónes utilizando el objetivo de mayor aumento (no el de
inmersión) colocar un cubreobjetos en preparaciones acuosas para
prtegerla lente del agua. Esto se conoce como montaje húmedo.
3. Finalmente observe su laminilla fija o preparada.

RESULTADOS

Dibuje o tome una fotografía de las observaciones realizadas durante la práctic

CUESTIONARIO

1. Dibuja y describe el primer microscopio simple

2. ¿Quién realizó el primer microscopio simple?
3. ¿Qué es la microbiología y para qué nos sirve?
4. Describe las diferencias entre los microscopios que se utilizan actualmente
(óptico, fluorescencia, estereoscópico, electrónico)
5. Defina aumento y resolución
6. Haga un esquema del recorrido de la luza a través del microscopio
compuesto
7. ¿Qué es el poder de resolución?
8. ¿Qué parte del microscopio concentra los rayos luminosos en un solo punto
de observación?
9. ¿Con qué tipo de microscopio observaría las siguientes estructuras
a. preparación de bacterias teñidas
b. tejido vivo sin teñir donde se desa ver algunos detalles intracelulares
c. una muestra que emite luz cuando se ilumina con luz ultravioleta
d. detalles intracelulares de una célula que mide 1 micra de longitud
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO

Aplicar reacciones generales de identificación de carbohidratos

INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos se clasifican en tres grupos: monosacáridos, oligosacáridos y

polisacáridos. Los monosacáridos son los carbohidratos más simples y pueden
obtenerse a partir de otros carbohidratos más complejos por hidrólisis, varían en la
longitud de la cadena (3 a 9) pudiendo ser aldehídos o cetonas. Los oligosacáridos están
constituidos por varios monosacáridos (2 a 6) y pueden llegar a producirlos por
hidrólisis. Los polisacáridos son más complejos, de PM elevado y por hidrólisis
producen un gran número de unidades de monosacáridos iguales o diferentes. Los
homopolímeros como el almidón, glucógeno y celulosa producen el mismo
monosacárido por hidrólisis. Los heteropolímeros como gomas y pectinas están
constituidos por azúcares, animoazúcares y otros compuestos que no son carbohidratos.
Algunas características estructurales de los carbohidratos pueden utilizarse para su
identificación como en la reacción de Molish, de Seliwanoff y Barfoed.

REACTIVOS

 Solución al 1% de glucosa, sacarosa, fructosa, maltosa, arabinosa, almidón

 Soluciones 0.1 M de lactosa y galactosa
 Reactivo de Molish, Seliwanoff y Barfoed

MATERIAL

 20 Tubos de ensaye con tapón de rosga

 Gradilla
 10 pipetas de 5 mL
 3 pipetas de 10 mL
 3 pipetas pasteur de plástico
 3 vasos de pp de 50 mL
 1 Vaso de pp de 400 mL
 1 Parrilla eléctrica
 1 Vaso de pp de 250 mL
 3 Vidrio de reloj
  1 Cronómetro

PROCEDIMENTO

Reacción de Molish-Udransky.

Es una reacción general para carbohidratos. La reacción positiva se observa por un

anillo violeta rojizo.

1.- Por cada solución de CHO a probar prepare y rotule un tubo de ensaye.

2.- Añada 1 mL de la solución a probar.

3.- Agregue 2 gotas del reactivo de Molish, mezcle bien.

4.- Deje resbalar por las paredes del tubo entre 0.5 a 1mL de ácido sulfúrico
concentrado, en la campana de extracción, hasta observar la presencia de un anillo azul
oscuro.

5.- Anote sus resultados

CHO

Reacción
(+/-)

Reacción de Seliwanoff

Diferencia entre aldosas y cetosas. Las cetosas dan un color rojo fuego rápidamente y
las adosas lo dan muy débilmente y lento.

1.- Prepare un baño María a ebullición en la parrilla de calentamiento.

2.- Rotule los tubos de ensaye de las soluciones a probar.
3.- Agregue 0.5 mL de cada una de las soluciones a probar.
4.- Adicione 2.5 mL del reactivo de seliwanoff
5.- Caliente en el baño María los tubos exactamente 60 s, anote sus resultados.
6.- Continúe calentando y anote sus observaciones por cada min hasta los 5 min.

CHO

1 min

2 min

3 min
4 min

5 min

Reacción de Barfoed

La reacción positiva se distingue por un precipitado rojo. Distingue entre

monosacáridos (reacción positiva de 2 a 5 min) y disacáridos (reacción positiva después
de 5 min).

1.- Rotule 5 tubos de ensayo (glucosa, sacarosa, fructosa, maltosa y arabinosa) y

agregue 0.5 mL de cada uno.
2.- Agregue 2.5 mL de reactivo de Barfoed
3.- Coloque los 2 tubos en baño María a ebullición por 10 min. Registre el tiempo en
que aparece el precipitado rojo en cada tubo.

CHO

Reacción
(+/-)

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuál es el fundamento bioquímico de cada reacción?

2.- ¿Cómo se preparan los reactivos de Molish-Udransky, Seliwanoff y Barfoed?

3.- ¿Qué carbohidrato utiliza el espermatozoide como fuente energética?

4.- ¿Cuál es el carbohidrato más abundante en la sangre humana?

5.- ¿A qué se le llama fibra dietética?

6.- ¿Qué semejanza o diferencia funcional y estructural existe entre el glucógeno,

almidón y celulosa?

7.- ¿Qué contiene la miel de abeja?

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DEL
ÁCIDO 3,5 DINITROSALICÍLICO (DNS)

OBJETIVO

Determinar cuantitativamente azúcares reductores mediante el método del ácido 3,5

dinitrosalicílico.

INTRODUCCIÓN

Uno de los métodos para la determinación de azúcares reductores que mejores

resultados proporciona, es el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. Este método ha sido
modificado varias veces para adecuarse al análisis de diferentes muestras, es un método
altamente sensible.

El ácido 3,5 dinitrosalicílico se reduce al ácido 3-amino-5 nitrosalicílico por los

azúcares reductores presentes, previo calentamiento a 100°C, desarrollándose un color
amarillo café el cual es estable hasta por 24 h. La lectura se realiza a 540 nm.

REACTIVOS

1.6 g NaOH
30 g Tartrato de sodio y potasio
1g de Ácido DNS
1 g Glucosa

Preparación de disolución de DNS:

1.6 g NaOH
30 g Tartrato de sodio y potasio
1g de Ácido DNS

Disolver el NaOH en 40 ml de agua, agregar lentamente el tartrato de sodio y potasio,

agregar otros 40 ml de agua y lentamente agregar el ácido dinitrosalicílico. Dejar en
agitación toda la noche, aforar a 100 mL y filtrar.

Preparación del estándar de glucosa

Solución estándar de glucosa 1,0 g/100 mL.

Disolver 1,0 g de glucosa en 50 mL de agua destilada y aforar a 100 mL a con agua

destilada, mezclar bien.
Soluciones estándar de glucosa de concentración conocida.

Usando una pipeta volumétrica de 5 mL y matraces volumétricos de 10 mL, preparar

soluciones estándar de glucosa por diluciones sucesivas de acuerdo a la tabla siguiente:

Solución [glucosa] Se usa la mL que Aforo

No. mg/mL solución se toman total
1 10 - - -
2 5 1 5 10
3 2,5 2 5 10

4 1,25 3 5 10
5 0,625 4 5 10

Muestras de jugo de frutas

1. 1.0 mL de jugo se diluyen con agua destilada (1:5 y se filtran a través de una
membrana de 0,45 µm).
2. Se toman 0.5 ml de la muestra y se agregan 0.5 ml de Acido DNS
3. Los tubos se llevan a ebullición durante 5 minutos y luego se dejan enfriar
4. Se agregan 5 ml de agua a cada tubo
5. Se lee a 540 nm en el espectrofotómetro
6. Las diluciones de glucosa para la curva de calibración se tratan de la misma
manera que las muestras.
7. Se prepara un blanco utilizando agua destilada.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué la sacarosa no se considera un azúcar reductor?

2. Escriba la reacción de los azúcares reductores con el ácido DNS
3. En qué parte de la vía gastrointestinal se realiza la hidrólisis final de los
disacáridos
4. ¿Cómo afecta una gastroenteritis a la digestión de los carbohidratos?
5. Una persona intolerante a la lactosa puede presentar síntomas de diarrea con
deposiciones acuosas, ácidas y explosivas, ¿Cuál podría ser la causa?
 AISLAMIENTO DE CASEÍNA Y DE OVOALBÚMINA

OBJETIVO GENERAL

Poner en practica los métodos bioquímicos para la purificación parcial de

proteínas, basados en sus propiedades de solubilidad.

• Aislar caseina de la leche a partir de su punto isoeléctrico

• Aislar la albumina de la clara de huevo por precipitación con sulfato de
amonio.
• Familiarizar al alumno con el uso de la centrífuga.

ANTECEDENTES

MATERIALES

1 Probeta de 50 mL
2 Vasos de Precipitados de 250 mL
1 Vaso de Precipitados de 100 mL
2 Pipetas Graduadas de 5 mL
4 Tubos de Centrifuga de 50 mL 1
Agitador de Vidrio
1 Matraz Kitazato
1 Parrilla Electrica
1 Piceta
1 Potenciómetro
1 Centrífuga clínica
4 Viales de Vidrio
2 Pipetas Pasteur
1 Embudo Buchner
1 Embudo de Vidrio
1 Palangana con hielo
Gasa

REACTIVOS

HCl
NaCl
(NH4)2SO4
Acido Acético Glacial
Acetato de Sodio
Etanol Acetona
Éter Etílico
120 mL de Leche Cruda de establo (no Industrializada)
1 Huevo Fresco
Solución de HCl al 20% (v/v)
Solución de ácido acético 1.0M
Solución amortiguada de (NH4)2SO4
Preparación: Agregar 780 g de (NH4)2SO4 a un litro de agua y calentar por
agitación. Adicionar 12.3 g de acetato de sodio. Enfriar y añadir 9 mL de ácido
acético glacial. Dejar que sedimenten los cristales, use solo el sobrenadante.

METODO

A. Obtención de la Caseina

1. El día anterior a la práctica, dejar enfriando la leche para que se separe la parte
lipidica.
2. Al iniciar la práctica, eliminar los lípidos que se encuentran en la superficie con
una pipeta Pasteur
3. Colocar 60 mL de la leche descremada en un vaso de precipitados de 250mL
junto con el agitador magnético y agitar suavemente sobre la parilla
4. Calibrar el potenciómetro con las soluciones patrón de pH7 y pH4
5. Introducir el electrodo en el vaso con leche, cuidando no golpearlo con el
agitador magnético.
6. Adicionar lentamente, con una pipeta Pasteur, la solución de HCl al 20% hasta
ajustar el pH a 4.6.
7. En el punto isoeléctrico se formará un precipitado voluminoso. En ese momento
se detiene la agitación y se deja reposar durante 10 minutos a temperatura
ambiente
8. Mezclar la suspensión por unos cuantos minutos y distribuirla en tubos de
centrífuga, procurando recuperar todo el precipitado.
9. Equilibrar los tubos por parejas y centrifugar a 2000 rpm durante diez minutos.
10. El precipitado de todos los tubos se coloca en un vaso. Agregar 20 mL de agua y
agitar sobre una parrilla con un agitador magnético, hasta obtener una suspensión
homogénea. Este lavado es para eliminar el HCl.
12. Colocar la suspensión en dos tubos de centrífuga y efectuar el proceso de
centrifugación a 2000 rpm durante diez minutos. Desechar el sobrenadante y
repetir los lavados con agua dos veces más.

13. Al eliminar el agua del último lavado adicionar 10 mL de etanol al precipitado

y homogeneizar con un agitador de vidrio. Volver a centrifugar para eliminar el

etanol.
14. Finalmente, lavar con acetona y éter etílico de la misma forma que se hizo con
el alcohol.
15. Recuperar el precipitado y colocarlo en papel aluminio, en forma extedida,
para que se seque y forme un polvo.
B. Obtención de Albúmina.

1. Colocar la clara de huevo en una probeta y medir su volumen, evitando que se

rompa la yema
2. Verter la clara en un vaso de precipitados, agregar la décima parte de su
volumen de ácido acético 1.0 M y agitar.
3. Filtrar la albúmina acidificada a través de cuatro capas de gasa, agitando
fuertemente con una varilla de vidrio para acelerar el proceso.
4 Al filtrado añadir un volumen igual de la solución de sulfato de amonio
amortiguado, y agitar. Dejar reposar la solución durante 15 minutos en un baño de
hielo.
5. Separar el precipitado que contiene ovoalbúmina y ovomucina centrifugando a
3000 rpm durante diez minutos.
6. Al sobrenadante que contiene la albúmina, añadir pequeñas cantidades de la
disolución de sulfato de amonio: se notará una ligera turbidez que desaparecerá al
agitar. Siga vertiendo sulfato de amonio y agite hasta que la turbidez ya no
desaparezca, agregar un poco más para permitir que la albúmina precipite.
7. Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas
8. Eliminar el sobrenadante por centrifugación.
9. Suspender la albúmina en 5 mL de acetona y recuperar filtrando en un
embudo Buchner.
10 Colocar el residuo en un papel aluminio y dejar que seque completamente al
aire. Guardar en un vial etiquetado.

RESULTADOS

1. ¿Cuántos gramos de caseína obtuvo?

2. ¿Qué porcentaje representa del volumen inicial?
3. ¿Cuántos gramos de albúmina obtuvo?
4. ¿Qué porcentaje representa del volumen de la clara?
5. ¿Qué volumen de leche utilizó para la extracción de caseína?
6. ¿El precipitado de caseína apareció exactamente a pH 4.6 o requirió acidificar
más? Explique.
7. ¿Para que tuvo que lavar la caseína con agua?
8. ¿Los lavados con los solventes orgánicos eran necesarios? ¿Por qué?
9. ¿Fue bueno el rendimiento?
10. ¿Cuál fue el volumen total de la clara de huevo?
11. ¿Cuál es la razón de agregar ácido acético y filtrar a través de gasas?
12. Aproximadamente ¿a que concentración de sulfato de amonio precipita la
ovomucina y la ovoglobulina, de acuerdo el volumen de sulfato de amonio
que adicionó? y ¿Cuál es la concentración de sulfato de amonio a la que
precipita la albúmina?
13. De acuerdo con lo reportado en la literatura. ¿Cuánta albúmina tiene el
huevo?. Compárelo con su resultado.
CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipo de proteínas son al caseína y la albúmina estructural y

funcionalmente?
2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas?
3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína?
4. ¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales?
5. ¿Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas?
6. ¿En que se basa la centrifugación para separar partículas de diferente
tamaño?
7.¿Cuántos tipos de centrífugas se conocen?
8. ¿Todos los métodos de extracción de proteínas las desnaturalizan?
9.¿Es posible saber si una proteína está pura? ¿Cómo?
10. ¿Será costeable purificar proteínas industrialmente?

BIBLIOGRAFÍA

1. Segal Kischinevzky, C.A. Manual de Prácticas de Biología Molecular de la

Célula. Universidad Nacional Autónoma de México. 1ª Edición 2005.
 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVO. Determinar proteínas mediante el método de Biuret.

ANTECEDENTES

La mayoría de las proteínas no absorben luz dentro del intervalo de longitud de

onda visible, por lo que es necesario acoplar una reacción química que genere
color y así poder cuantificarlas.

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción

de Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias
a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un
compuesto de color violeta, debido a la formación de un conmplejo de
coordinación entre los iones Cu+2 y los pares de electrones no compartidos del
nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídico. La intensidad de color es
directamente proporcional a la concentración de proteínas presentes en la
muestra.

Curva de Calibración:

Se obtiene la curva de calibración midiendo la absorbancia de una serie de

soluciones de concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un
mismo método y medidas a igual longitud de onda en el mismo instrumento. Para
medir la concentración de una sustancia se elige por lo general, la región de
máxima absorción del espectro, denominada longitud de onda analítica.
El resultado se expresa en una gráfica de la absorbancia (A) en función de la
concentración (c). Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una línea
recta que pasa cerca del origen; de cuya pendiente se puede obtener el coeficiente
de extinción e

Es posible determinar gráficamente la concentración de una muestra desconocida

(cx) midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de
calibrado.

Normalmente la concentración se estima a partir de la ecuación de la curva de

calibración

A= mc+b

Donde A es la absorbancia, c es la concentración y b es la ordenada al origen. El

coeficiente de concentración se puede calcular con la pendiente de la recta

REACTIVOS

A. Reactivo de Biuret: Disolver 1.9 g de CuSO4.5H2O y 3.35 g de

Na2EDTA en 350 ml de agua destilada. Agregar lentamente y con agitación
constante 100 ml de solución fresca de NaOH 5 M. Aforar a 500 ml con
agua destilada.

B. Solución patrón de albúmina al 2.5% en NaCl 9%

MATERIALES

Espectrofotómetro a 540 nm
1 Celda para espectrofotómetro
1 pipetas de 5 ml
2 pipetas de 1 ml
propipeta
1 gradilla
3 vasos de precipitados de 50 ml
6 tubos de ensayo

MÉTODOS

1. Prepare una batería de tubos enumerados como indica la tabla 1

2. Agregue el volumen indicado de la solución de albúmina (estándar S)
 3. Agregue el volumen indicado de agua a cada tubo
4. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret a cada tubo

albúmina Reactivo. Absorbancia Concentración

Biuret
TUBO (mL) H2O

2.5% (mL) (mL) %

Muestra
Problema
1B 0,0 --- 1,0 4,0

2S 1,0 --- 0,0 4,0

3S 0,8 --- 0,2 4,0

4S 0,6 --- 0,4 4,0

5S 0,4 --- 0,6 4,0

6 MP --- 1,0 0,0 4,0

Mezclar e incubar los tubos por 15 minutos a temperatura ambiente

Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotómetro.

NOTA. El color del complejo es estable al menos por 30 minutos

La ley de Lambert y Beer se cumple hasta los 15g/100 ml (150 g/l)

RESULTADOS

De acuerdo a los datos:

 Calcule la concentración de la albúmina en los tubos (2S – 5S)
 Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
 Obtenga la ecuación de la recta y el coeficiente de regresión
 Construya una gráfica absorbancia versus concentración, trace la recta
obtenida por regresión.
 Calcule la concentración de la muestra problema en las cubetas mediante la
ecuación de la recta considere si hizo diluciones de la muestra original

Valores esperados:

Recién nacidos 5.2-9.1 g/dl

Niños (hasta 3 años) 5.4-8.7 g/dl
Adultos 6.0-8.0 g/dl

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es importante agitar los tubos de ensayo después de preparar las
disoluciones?
2. ¿Cómo se encuentra el valor de proteínas determinado en su muestra?
3. ¿Cuál es el fundamento de la técnica que se usó en esta práctica?
4. ¿Qué patologías pueden presentar niveles elevados o bajos de proteínas?
5. ¿Por qué no se debe usarse una muestra hemolizada?
6. El método de Biuret se puede usar para la determinación de dipéptidos y
aminoácidos?
7. El método de Biuret se puede usar para la determinación de proteínas en
orina?

BIBLIOGRAFÍA

1. Bohinski R. Bioquímica. Quinta edicion. Addison Wesley Iberoamericana

2. Finlayson. J.S. Basic Biochemical Calculations Related procedures and
Principles. Addison Wesley Pub. Co.
 OBTENCIÓN DE LECITINA Y COLESTEROL
A PARTIR DE LA YEMA DE HUEVO

OBJETIVO

Poner en practica los métodos bioquímicos para la purificación parcial de lípidos

ANTECEDENTES

Se separará primero la yema del huevo por los medios manuales o mecánicos. En
la yema se encuentran las lecitinas en gran abundancia y además el colesterol en
suficiente cantidad para hacer su aislamiento y detección fácilUna vez separada la
yema se hará una extracción general de lípidos con solventes orgánicos. Algunos
autores afirman que una mezcla clorformo-éter a partes iguales es el mejor
solvente para la extracción de los lípidos. En ésta práctica se usará una mezcla
etanol-éter al 2 :1. Se aprovechará el hecho de que las lecitinas son insolubles en
acetona para obtener su fácil precipitación. Después de precipitar las lecitinas,
quedan en solución muchas otras clases de lípidos entre los cuales está el
colesterol. Se hace entonces una saponificación para separar la fracción
saponificable y quedarse con la insaponificable donde se encuentra el colesterol.
Bastara entonces solubilizarlo bien y agregar agua para precipitarlo, ya que es
insoluble en agua. Se precipita en forma cristalina.

MATERIAL

1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón

Vaso de precipitados de 250 ml
Probeta de 50 o 100 ml Agitador
Embudo 6 tubos de ensaye de 13x10
Vaso de precipitado de 250 ml Pipeta de 5 ml
Vaso de precipitado de 100 ml Probeta de 50 o 100 ml
Vaso de precipitado de 50 ml Baño María
Agitador Embudo
Baño María Gradilla
Mechero, tripié y tela de asbesto

MÉTODOS

OBTENCIÓN DE LECITINA
1. Separe la yema de huevo y vacíela en un Erlenmeyer de 250 ml. Hágalo con
cuidado, de preferencia en el lavabo, procurando siempre la limpieza. La clara
se descarta.
2. Añada 25 ml de alcohol metílico y 25 ml de éter. Tape el Erlen Meyer y agite con
cuidado durante dos minutos, destapando de tiempo a tiempo para desalojar
cualquier presión que pudiera desarrollarse. Deje reposar la mezcla por 10
minutos, agitando suavemente de tiempo en tiempo.
3. Filtre sobre papel Whatman 1 humedecido con etanol y doblado en forma de zig
zag.
4. Pase el residuo que quede en el papel filtro a otro Erlenmeyer y añada 10 ml de
etanol y 5 ml de éter. Agite suavemente y deje reposar por 5 minutos.
5. Filtre nuevamente esta última extracción y combine los filtrados. El residuo se
descarta.
6. Evapore el filtrado hasta sequedad en baño de agua hirviendo, en un vaso de
precipitados lo mas ancho posible. Si usa mechero NO SE ASOME para ver si ya
está terminando la evaporación, para ese use unas pinzas grandes y con ellas
saque el matraz y así haga su observación.
7. Disuelva el residuo en 5 ml de éter.
8. Lentamente y con agitación suave vacíe esa solución a un vaso de precipitados
que contenga 15 ml de acetona. Siga agitando con cuidado hasta que las
partículas de lecitina cruda precipitada se adhieran entre sí formando una
bolita.
9. Filtre para separar la lecitina y guarde por separado la lecitina y el filtrado para
usarlos en las siguientes partes de la práctica. Si la lecitina formó una bolita mas
o menos firme, no habrá necesidad de filtrar, bastará con decantar.

OBTENCIÓN DE COLESTEROL

1. Evapore el filtrado de la sección anterior, en baño de agua hirviendo hasta que

se haga una pasta (el residuo no debe oler ni a éter ni a acetona). Enfríe.
2. Añada 7.5 ml de la solución de potasa alcohólica al 10 %. Agite y caliente la
solución hasta que se concentre hasta sequedad. Enfríe.
3. Añada 25 ml de éter y agite bien. Filtre por si hay algún precipitado de jabón.
4. Evapore el filtrado hasta sequedad.
5. Añada 5 ml de alcohol etílico y caliente en baño María por dos minutos.
Transfiera la solución a un tubo de ensaye.
6. Centrifugue por 5 minutos.
7. Transfiera el sobrenadante, después de la centrifugación, a un tubo de ensaye.
Este sobrenadante contiene colesterol en solución. Ahora añada gota a gota,
agua destilada a la solución, hasta que no aparezca más precipitado. Deje
reposar por 15 minutos y centrifugue.
8. Descarte el líquido por decantación. (puede centrifugarse el residuo cristalino
de colesterol, disolverlo en 2 ml de alcohol caliente y volver a precipitarlo,
añadiendo gota a gota agua. Esto dará un colesterol un poco mas puro). Deje
secar los cristales de colesterol.
CUESTIONARIO

1. Investigue bibliográficamente las estructuras completas de la lecitina y el

colesterol.
2. Investigue bibliográficamente la estructura de la membrana celular y cómo
están en ella los lípidos que la forman (fosfolípidos, glucolípidos y colesterol)
3. Investigue que es y cómo se obtiene el éter de petróleo.
 AISLAMIENTO DE LA POLIFENOLOXIDASA Y FACTORES QUE AFECTAN SU
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

OBJETIVOS

Aislar la enzima polifenoloxidasa de la papa y determinar su temperatura, pH y

concentración de sustrato óptimo

INTRODUCCIÓN

Los seres vivos son capaces de obtener y usar energía con gran rapidez debido a la
presencia de catalizadores biológicos llamados enzimas. Como en el caso de
catalizadores inorgánicos las enzimas cambian la rapidez de las reacciones
químicas sin afectar el equilibrio de la reacción; muy pequeñas cantidades son
necesarias para llevar a cabo la transformación de un gran número de moléculas.
Sin embargo, a diferencia de los catalizadores inorgánicos, las enzimas son muy
específicas en la reacción o tipo de reacción que catalizan. Las enzimas sólo
funcionan en un intervalo bien definido de pH, temperatura, concentración de
sustrato y cofactores.

Actividad enzimática

La actividad de una enzima se expresa en términos de unidades (U) de forma que

1U es la cantidad de enzima que puede catalizar la conversión de 1 mol de
sustrato por minuto en condiciones bien definidas. Cuando la actividad es muy
alta, puede expresarse en términos de nmol/min o pmol/min.

La pureza de una enzima se expresa en términos de actividad específica, que es el

número de U/mg de proteína.

Cofactores

En muchos casos si la enzima se mezcla con su sustrato en las condiciones

adecuadas, la actividad enzimática es menor de la esperada y esto puede deberse a
la ausencia de coenzimas o activadores.

Las coenzimas son compuestos orgánicos de bajo peso molecular que participan en
el mecanismo de la reacción. En muchos casos actúan como aceptores o donadores
de grupos químicos específicos. Por ejemplo, el NAD acepta y dona átomos de
hidrógeno y es la coenzima de muchas deshidrogenasas. El término coenzima se
emplea para cofactores que permanecen solubles en el medio, mientras que el
térnino grupo prostético se usa para coenzimas que están unidas a la proteína por
enlaces covalentes.
Los activadores también tienen una estructura química sencilla y no son tan
específicos como las coenzimas. Actúan activando el complejo enzima-sustrato.
Varios iones metálicos actúan como activadores de un gran número de enzimas,
por ejemplo, el Mg2+ para la fosfatasa alcalina y las cinasas.

Efecto de la temperatura

Las moléculas deben tener una cierta energía de activación € antes de reaccionar;
las enzimas funcionan como catalizadores al bajar la energía de activación,
permitiendo así que la reacción proceda con más rapidez. El cambio de energía
libre (G) de la reacción no se ve afectada por la enzima. Las enzimas tiene un
intervalo de temperatura en el cual su actividad enzimática es máxima y se llama
temperatura óptima.

Efecto del pH

Las enzimas son activas en límites estrechos de pH. La variación de la actividad con
el pH se debe a cambios en el estado de ionización de la protéina y otros
componentes de la mezcla de reacción. Sólo una de las muchas formas iónicas
posibles de una proteína es biológicamente activa, por lo que los cambios respecto
al pH óptimo produce un cambio de actividad.

Determinación de la actividad enzimática

Para medir la actividad de una enzima se mide la desaparición de sustrato o la

aparición de producto conforme avanza la reacción a través del tiempo.

La gráfica de la cantidad de sustrato que desaparece o de producto que se forma

con respecto al tiempo se llama progreso de la reacción. La actividad enzimática 
se obtiene por la pendiente de la recta inicial y se llama velocidad inicial de
reacción.

Si la actividad de la enzima se determina en un amplio intervalo de

concentraciones de sustrato, se obtiene la siguiente gráfica:
La polifenoloxidasa es una enzima que contiene cobre y tiene un pH óptimo de 6-7.
Cataliza la oxidación de di y tri hidroxifenoles para formar las quinonas
correspondientes.

La reacción que se lleva a cabo con catecol es:

Catecol + ½ O2 quinona + H2O

La reacción de óxido-reducción se acompaña de cambio de color (las quinonas

absorben luz en la región visible del espectro). Esta reacción ocurre naturalmente
y es la responsable del oscurecimiento de las papas sin cáscara y de fruta
magullada.

MATERIALES

Solución de catecol 0.01M

HCl 0.4%
Acido láctico 0.1%
Solución de carbonato de sodio 0.5%
Extracto de la enzima
Charola con hielo
Gasa
Embudo
Mortero
Centrífuga
Tubos de centrífuga
10 tubos de ensayo
6 Pipetas Pateur
Gradilla
Parrilla eléctrica
4 vasos de precipitados 250 ml
2 termómetros

METODOLOGÍA

A) Purificación de la enzima
a. Se pela una papa chica y se muele con un poco de arena de mar a
temperatura de 4 grados C
b. Se filtra y la suspensión obtenida se centrifuga
c. El filtrado es el extracto de la enzima.Debe mantenerse en hielo y
protegido de la luz mientras preparan los experimentos
d. Numere los tubos y agregue las soluciones que se indican en el cuadro
 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Extracto de la enzima 1 ml 1ml 1 ml

Solución de catecol 1 ml

Agua 1 ml 1 ml

e. Los tres tubos se colocan en un baño de agua a 35-40 grados C y se

examinan cada cinco minutos en un lapso de 25 minutos, registrando en
cada tiempo el color que va adquiriendo cada solución.
f. Registre los resultados en una gráfica de actividad enzimática contra
tiempo considerando que:
g. - = no hay cambio de color
+ = color ligero

++ = color moderado

+++ = color intenso

B) Efecto del pH en acción de la enzima

C)
a. Numere 4 tubos

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Extracto de la enzima 0.2 ml 0.2ml 0.2 ml 0.2 ml

Solución de catecol 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

HCl (pH 1) 0.2 ml

Acido láctico (pH 5) 0.2 ml

Agua destilada (pH 7) 0.2 ml

Sol carbonato de sodio 0.2 ml

(pH 9)

b. Deje reposar por 15 minutos y registre el color

c. Los resultados se grafican como actividad enzimática contra pH

D) Efecto de la temperatura en la actividad de la enzima

 a. Numere 3 tubos. Agregue 1 ml de solución de catecol.
b. En cada uno de los tubos se agregan 0.2 ml de la enzima y se colocan en
un baño de agua a diferentes temperaturas como lo muestra la siguiente
tabla
Tubo 1 0 grados C

Tubo 2 37 grados C

Tubo 3 70 grados C

c. dejar reposar por 15 minutos

d. Graficar los resultados como actividad enzimática contra temperatura

RESULTADOS

1. Construya las gráficas que se indican anteriormente e interprete sus

resultados

CUESTIONARIO

1. ¿Para qué le sirve a un médico la determinación de la actividad de algunas

enzimas?
2. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación tienen valor diagnóstico?

BIBLIOGRAFÍA

1. Lehninger AL,, Nelson, DL. Principios de Bioquímica. 4ª Ed. Barcelona.

Ediciones Omega 2005
2. Baynes, JW; Dominiczak, MH. Bioquímica Médica. 2ª. Ed. Elsevier Mosby.
2007
 ESTERILIZACIÓN Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO.

Manejar y practicar el uso del autoclave

Preparar de manera adecuada medios de cultivo microbianos
Identificar distintos medios de cultivo

FUNDAMENTO.

Un medio de cultivo es una sustancia en la que se puede desarrollar un

microorganismo; contiene los elementos nutritivos esenciales en una
concentración adecuada, la necesaria cantidad de sales, el adecuado volumen de
agua, exento de sustancias inhibidoras del organismo que se va a cultivar, tiene la
consistencia deseada, el pH adecuado y es estéril.

GENERALIDADES.

Los microorganismos heterotróficos a cuyo grupo pertenecen los gérmenes

patógenos, necesitan una amplia variedad de exigencias para su cultivo; la
exigencia más importante es la nutricional que se puede satisfacer en un medio de
cultivo.

A) Los componentes básicos de un medio de cultivo para m.o son los

siguientes:

Extracto de carne: El cual aporta el medio de cultivo carbohidratos,

componentes orgánicos nitrados, vitaminas y sales.

Peptonas: Obtenidas a través de una hidrólisis parcial de proteínas, aporta

principalmente nitrógeno orgánico.

Agar: Es una carbohidrato obtenido de algas marinas, da consistencia sólida

por su acción como coagulante. No aporta ningún valor nutritivo.

Existen medios de cultivo sólidos que contienen suficiente agar, medios

semisólidos que contiene una cantidad mínima de agar y medios líquidos que
no contienen agar ni gelatina.

B) De acuerdo a la composición química de los medios de cultivo se clasifican

como:

Medios de cultivo simples: Están compuestos por los nutrientes básicos,

ejemplo: Agar y caldo nutritivo.

Medios de cultivo enriquecidos: Contienen sustancias que proveen al medio de

nutrientes necesarios para el desarrollo de m.o. exigentes, por ejemplo: agar
chocolate y agar sangre de carnero.

Medios de cultivo selectivos: Contienen sustancias que inhiben el crecimiento

de algunos m.o. pero que permiten el desarrollo de otros, ejemplo: medio
salmonella-shigella.
 Medios de cultivos diferenciales: Contienen sustancias químicas que permiten
diferenciar las transformaciones metabólicas ocurridas en el medio por las
bacterias.

C) De acuerdo en la manera en que se utilizarán, los medios de cultivos sólidos

se pueden emplear en diversas formas:

En placa: Se utilizan cajas de Petri, adicionando el medio de cultivo todavía

líquido ya esterilizado, a una temperatura aproximada entre 46 y 50 ºC para
evitar la formación de agua en la tapadera de la caja. El volumen que se
adiciona es aproximadamente de 15 a 20 ml.

En tubo de agar inclinado: Los tubos con agar esterilizado todavía líquido, son
colocados en una posición inclinada de tal forma que se forme una capa
aproximada de 3 cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones dejando
que solidifiquen. Los tubos de agar inclinado se han utilizado para
conservación de cepas y en algunas pruebas bioquímicas.

Los medios de cultivo líquidos se usan generalmente en tubo en cantidades e

especificadas para cada prueba.

Los recipientes destinados a la preparación se limpiarán perfectamente con

agua destilada limpia esto es con el fin de eliminar cualquier residuo de otra
sustancia que pueda alterar la composición del medio. Es importante tener en
cuenta que el recipiente sea grande, para que el medio de cultivo que se
prepare pueda ser agitado con facilidad y sin riesgo a que se derrame.

MATERIAL.

 Matraces Erlenmeyer de 250 ml

 Probeta graduada de 500 ml.
 Caja de Petrí estéril 100 x 15
 Tubos con tapón de rosca grande.
 Gasas.
 Algodón.
 Mechero Bunsen.
 Espátula limpia.
 Agua destilada limpia.
 Desinfectante.
 Balanza
Medios a preparar:
o ADS.
o Agar dextrosa papa
o Agar selectivo para candida.
o Agar Biggy.
o SS.
o Cled.
o Caldo Lactosado.
 MANEJO DE LA AUTOCLAVE.

1. Verificar que el nivel del agua sea el indicado.

2. El material a esterilizar se debe colocar en la canastilla del autoclave y se

introduce en ella

3. Se enciende el autoclave, las llaves se cierran en parejas (una sola persona

debe realizar esta operación para que la fuerza sea la misma en cada una de la
llaves) y se debe dejar abierta la válvula de escape.

4. Cuando el vapor comience a salir por la válvula, esta se cierra y la presión y

temperatura comenzarán a aumentar. Debe verificarse frecuentemente de que
el autoclave no rebase las condiciones adecuadas.

5. Cuando se ha llegado a las condiciones de presión, temperatura y tiempo

adecuados, se baja la temperatura cerrando las llaves del gas, se deja enfriar
hasta que la aguja no marque presión. Solo se puede abrir la tapa cuando ya
haya bajado por completo la

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Consultar las indicaciones del fabricante del medio de cultivo a preparar para
conocer las condiciones en las que se elaborará el medio.

2. Se pesa exactamente la cantidad del medio de cultivo especificada en el envase.

El medio deshidratado se pesará en papel de aluminio.

3. Al medio de cultivo pesado se le añade aproximadamente la mitad del agua

destilada se agita lo suficiente tratando de hacer una suspensión homogénea, se
deja reposar unos minutos y después se le adiciona el resto del agua, arrastrando
el medio que pudo quedar pegado en las paredes del matraz.

4. El medio de cultivo se debe calentar para disolver. Este calentamiento debe

efectuarse en baño María o directamente en la parrilla. El medio estará listo
cuando al agitar el recipiente no se adhieran a las paredes internas, partículas del
agar. Es necesario que el tiempo de calentamiento sea el indicado, ya que los
medios de cultivo son muy sensibles. Los medios de cultivo que no contiene agar
son fáciles de disolver en el agua fría o con un ligero calentamiento.

5. La esterilización del medio de cultivo se lleva a cabo en autoclave, a 121ºC

durante 15 minutos. Se recomienda repartir el medio en porciones más pequeñas;
por ejemplo en los tubos donde va a quedar definitivamente. No se recomienda
esterilizarse en las cajas de Petrí.

Cada medio de cultivo tiene sus especificaciones propias; es recomendable leerlas

ya que muchos de los medios no se esterilizan o requieren de una presión y una
temperatura de esterilización más baja.
6. Se debe verificar si el pH del medio preparado es el especificado, este puede ser
medido con un potenciómetro, si el medio es sólido debe ser medido a una
temperatura de 45 a 50 ºC (líquido) si es líquido a temperatura ambiente.

7. El vertido en placas se debe de hacer, cuando el medio se encuentre a una

temperatura de 45 a 50 ºC, en un ambiente estéril, evitando la formación de
burbujas, si esto ocurre al terminar el vaciado se pasa el mechero rápidamente por
la caja con el medio. El volumen que se le agrega a la caja es aproximadamente de
15 a 20 ml. En los tubos dependiendo del tamaño se adicionará aproximadamente
la mitad del tubo, para el medio de cultivo líquido se le agregará a cada tubo
aproximadamente 2 a 3 ml

8. Cuando el medio de cultivo este solidificado o frío se empaquetará en cajas o en

tubos y se rotularán con el nombre del medio, fecha de preparación, número de
equipo que lo elaboró y se guardarán en el refrigerador en forma invertida.

CUESTIONARIO
1. ¿Qué necesidades nutricionales en términos de sustancias químicas son
necesarias para el desarrollo de los microorganismos?
2. ¿Cuáles son los ingredientes del caldo nutritivo y del agar nutritivo que tipo
de nutrientes puede aportar cada uno de sus componentes?
3. ¿Cuál es la diferencia entre las bacterias fototróficas y las quimiotróficas y
entre las autotróficos y las heterotrófico
 INOCULACION DE UN MEDIO DE CULTIVO.

OBJETIVO

1. El alumno aprenderá el funcionamiento básico del uso del autoclave.

2. Demostrará la utilidad de autoclave como un método de esterilización
3. EnsayarÁ diferentes métodos de inoculación y técnicas de estriado en placa
4. Practicará la inoculación en un ambiente estéril

ANTECEDENTES

Inoculación es la introducción artificial de microorganismos en un medio de

cultivo y consiste en la dilución de un cultivo mediante el estriado en la superficie
de un medio sólido, en una caja de Petrí. Los microorganismos se van quedando al
hacer las estrías en diferentes partes de la superficie del medio, de tal modo que
quedarán células individuales que al multiplicarse darán lugar a una colonia.

En la microbiología se debe destacar la importancia de obtener un buen cultivo de

bacterias, ya que de esto depende que se puedan observar fácilmente las
características de las colonias, propiedades bioquímicas, morfología reacciones de
coloración, reacciones inmunológicas y la susceptibilidad de una especie
microbiana a los agentes antimicrobianos.

En la naturaleza los microorganismos se presentan como cultivos mezclados que

contiene una gran variedad de géneros y especies. Para poder estudiar las
especies individuales es necesario aislarlos en un cultivo puro, es decir un cultivo
que contenga una sola especie.

El medio que se requiere para obtener un crecimiento puede ser líquido o sólido.
Se debe tener en cuenta que el medio debe tener las propiedades y características
apropiadas para el crecimiento así como también las condiciones ambientales
óptimas como son: Temperatura, pH, presión y oxígeno.

Al inocular un medio de cultivo para hacer crecer cierto microorganismo es

necesario tomar una muestra de este, teniendo cuidado de mantener la pureza del
cultivo. A este procedimiento se le conoce como técnica aséptica.

El asa de inoculación debe ser esterilizada en la llama al rojo vivo, antes y después
de inocular el medio. El asa debe mantenerse en el fuego del mechero de manera
que se caliente a lo largo y en la base del mango.

El asa que generalmente se utiliza es de Nichrome o platino, calibradas para

contener 0.01 ó 0.001 ml de líquido. La aguja de inoculación es un alambre recto
del mismo material que las asas.

Hay diferentes formas de inocular medios de cultivo, el más común es el método

de estría, pero también se encuentra la inoculación por picadura, placa vaciada,
entre otras.
MATERIAL:

 Placa con medios de cultivo

 Caldos nutritivos
 Pruebas bioquímicas.

TECNICA.

1. INOCULACION POR ESTRIA EN PLACA

METODO DE INOCULACION POR ESTRIA CRUZADA.

1. Esterilizar el asa por calor seco en el mechero, de forma vertical.

2. Quitar el tapón del tubo y mantenerlo en la misma mano en que se tiene el asa
de inoculación. Flamear la boca del tubo y con el asa tomar una pequeña porción
de la colonia. Flamear nuevamente la boca del tubo de donde se obtuvo la muestra.

3. Se toma la caja que se va a inocular cerca del mechero, se hacen una serie de
estrías en una esquina de la caja, se da vuelta a la caja y con el asa se toca las dos
últimas estrías una o dos veces y se hace una nueva serie de estrías, repitiéndose
esto en el resto de la caja.

4. Se procede igual con todas las cajas proporcionadas.

5. Todas las placas y tubos deben estar perfectamente rotuladas con un número o
con el nombre de la bacteria.

6. Incubar las placas a 35ºC por 24 horas.

INOCULACION PARA RECUENTO SEMICUANTITATIVO

1. Flamear el asa en la forma indicada.

2. Con el asa se toma una muestra del caldo o de una dilución de bacterias.

3. Se traza una línea a la mitad de la caja; tomando el punto donde se inicia la línea
se comienza a estriar en forma perpendicular a esta de manera continua hasta
llegar a la mitad de la caja, a continuación se le da vuelta a la caja y se repite el
procedimiento a partir de la última estría hasta completar la caja. Por último se
realiza un estriado en forma contraria para obtener un crecimiento enrejado.

4. Se rotula la caja con los datos específicos.

Este tipo de estriado es la técnica de diseminación usada para la inoculación de

medios con agar para recuentos semicuantitativos de colonias. Por lo tanto se
recomienda usar el asa calibrada. Un ejemplo de utilización de este método es en el
recuento de bacterias en una muestra de orina.
II. INOCULACION EN TUBO.

El medio de cultivo en tubo puede ser sólido, líquido o semisólido. De acuerdo al

procedimiento de inoculación se puede utilizar el asa aunque se utiliza con más
frecuencia la aguja de inoculación. El desarrollo de las bacterias en un tubo es de
gran utilidad ya que se pueden ocupar de diferentes maneras, como son: en caldo
para desarrollo de un crecimiento bacteriano, en pico de flauta para las pruebas
bioquímicas o en agar nutritivo para la conservación de cepas.

METODO DE INOCULACION POR AGITACION.

1. Flamear el asa, tomar una asada de manera aséptica de la muestra que se va a

inocular.

2. Depositar la muestra en el tubo con caldo agitando el asa en él para desprender

bien el inóculo.

3. Flamear nuevamente el asa.

4. Rotular el tubo con todos los datos necesarios.

5. Incubar los tubos a 35ºC en caso de no especificar otra indicación.

METODO DE INOCULACION POR PICADURA.

1. Flamear el asa de inoculación y tomar de manera aséptica la muestra a inocular.

2. Se introduce el asa en el medio sólido en forma de pico de flauta picando la base

del medio hasta la mitad y estriando el pico del medio.

3. Flamear nuevamente el asa.

4. Rotular el tubo.
5. Incubar el tubo a 35ºC durante 24 horas.

RESULTADOS

1. Anotar las características de los medios de cultivos (color, aspecto, solido o

líquido).
2. Reportar a manera de tabla la composición química de los medios de
cultivo, como se clasifican.

Clasificaci Fuente Fuentes Fuente Carbohidrat indicador Aga

ón proteín de de os es r
as hidróge pepton
no as

CUESTIONARIO
1. ¿Para qué se usa la técnica aséptica?
2. ¿Qué es un cultivo axénico?
3. ¿Por qué se prefiere usar agar en lugar de gelatina?
4. ¿Cuál es la finalidad de realizar la inoculación por estría?
 TECNICAS DE TINCION.

OBJETIVO.

Conocer y aplicar las técnicas de tinción básicas más frecuentes.

FUNDAMENTOS.

Los colorantes son preparados acuosos orgánicos que tiñen a los microorganismos
de una gran variedad de colorantes ayudando a su diferenciación.

GENERALIDADES.

En la mayoría de los casos, las bacterias se observan en frotis teñidos y no en

estado vivo, ya que el tamaño, la forma y la disposición de las células se aprecian
mejor si estas se tiñen por medio de reacciones con ciertos colorantes.

Los colorantes pueden usarse como tinciones directas de material biológico, como
indicadores de desviaciones de pH en medios de cultivo, como indicadores de
oxido-reducción para demostrar la presencia o ausencia de condiciones
anaerobias.

En términos químicos los colorantes se denominan ácidos o básicos, lo cual no

necesariamente indican una reacción de pH en solución; un colorantes básicos es
aquel constituido por un agrupamiento de átomos orgánicos con carga positiva
(catiónes) que será la parte activa del colorante y que tendrá afinidad por los
ácidos nucléicos. Se encuentra constituido por átomos orgánicos con carga
negativa (aniónicos) y por lo cual reaccionan con sustancias básicas, como
estructura citoplasmáticas. Un colorante neutro es una sal compuesta de un
colorante ácido y un colorante básico.

EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMO.

El examen en fresco de una suspensión microbiana es la técnica de observación

más fácil y rápida de realizar. Permite observar a los microorganismos vivos así
como determinadas características como su morfología, tamaño real y su
movimiento.

TECNICA.

1. Colocar una gota pequeña de la muestra sobre el portaobjetos usando el asa

previamente flameada o una pipeta pasteur estéril.
2. Colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos, primero una arista y luego,
lentamente el resto (evitar la formación de burbujas).
3. Observar al microscopio 40x.

CLASIFICACION DE LAS TINCIONES.

TINCION SIMPLE: Una tinción simple se lleva a cabo cubriendo con un colorante un
frotis seco y fijado al calor. Esta tinción es usada para teñir una gran variedad de
microorganismos. El colorante más utilizado para esta tinción es el azul de
metileno de Loeffler.
TECNICA.
 1. Prepara dos frotis con cepas de E. coli y S. aureus.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno de Loeffler por un minuto.
3. Lavar con agua de la llave o destilada suavemente y dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersión.

TINCION DIFERENCIAL: Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física

como químicamente, así su reacción con algunos colorantes también es diferente,
dando lugar a grupos que se caracterizarán por sus propiedades tintoriales. Dentro
de esta clasificación encontraremos a la tinción de Gram y a la tinción de Ziehl-
Neelsen, que se describirán a continuación:

TINCION DE GRAM: Esta tinción es una de las más comúnmente usadas en

microbiología, el mecanismo de reacción de los colorantes de Gram, actúan en la
estructura y composición de la pared celular. Las bacterias Gramnegativas,
contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias Grampositivas, la
pared celular de las Gramnegativas son también más delgadas que las
Grampositivas por lo que no retienen el colorante inicial cuando se les agrega el
alcohol acetona.
Esta tinción utiliza cuatro reactivos que son: Cristal violeta, Lugol o yodo de Gram,
etanol-acetona al 95% y Safranina. El cristal violeta que es el colorante inicial tiñe
a todos los microorganismos, ya que es un colorante básico, en segundo lugar está
el yodo que actúa como mordiente para aumentar la afinidad entre el colorante
inicial y la célula. El etanol actúa como decolorante sobre el microorganismo,
lavando el colorante inicial en caso de que no se afín con este. La safranina es el
colorante usado como contraste que teñirá a los microorganismos que no se
colorearon con el cristal violeta.
Bacterias Gram positivas quedan teñidas de color violeta.
Bacterias Gram negativas quedan teñidas de color rojo.

TÉCNICA

1. Preparar los frotis bacteriano

 Escherichia coli.
 Staphylococcus aureus.
 Streptococcus alfa hemolítico.
 Levaduras.
 Acinetobacter.
 Mezcla de Staphylococcus y Escherichia coli.
2. Teñir con Cristal violeta 1 minuto.
3. Lavar con agua de la llave o destilada.
4. Cubrir con Lugol 1 minuto.
5. Lavar con agua de la llave o destilada.
6. Cubrir el frotis con alcohol acetona uno segundos.
7. Lavar con agua de la llave o destilada.
8. Teñir con Safranina 30 segundos a 1 minuto
9. Observar con el objetivo de inmersión.
RESULTADOS

1. Dibujar detalladamente los diferentes tipos morfológicos observados

(examen en fresco)

CUESTIONARIO

1. Señalar las ventajas e inconvenientes del examen en fresco.

2. ¿Ha observado al microscopio alguna diferencia estructural entre bacterias
Grampositivas y Gramnegativas?
3. Si cambiara el orden de empleo de los colorantes primario y de contraste,
¿cree que la tinción seguiría permitiendo distinguir entre bacterias
Grampositivas y Gramnegativas?
4. ¿Cuál cree que sería el resultado de la tinción de Ziehl-Neelsen si no se
aplica calor a la muestra?
5. ¿Cuál sería la reacción al Gram de las levaduras? Y ¿de las Rickettsias?
 EXTRACCIÓN DE ADN (MÉTODO DE CHELEX)

Objetivo

Que el alumno practique uno de los métodos para el aislamiento de ADN genómico,
usando levadura como modelo y que describa y explique cada una de las etapas del
protocolo.

Introdución

Uno de los métodos de extracción de DNA que se usa para la realización de PCR de
muestras forenses es el que usa una resina llamada Chelex.

Chelex 100 es una resina que tiene una alta afinidad por los iones metálicos
polivalentes. Esta resina está compuesta de copolímeros de estireno y
divinilbenzeno y contiene iones iminodiacetato los cuales actúan como grupos
quelantes.

Durante el calentamiento de la muestra la resina impide la degradación del DNA

quelando iones que activan a nucleasas. La alcalinidad de las suspensiones de
Chelex (pH 10-11) y la exposición a altas temperaturas causan ruptura de la
membrana celular y desnaturalización del DNA.

Materiales

Muestra de sangre o semen

Microcentrífuga

5 Tubos Eppendorf estériles

Micropipeta de 1000 ul

Agitador magnético

Baño María

2 vasos de precipitados

Vortex

Metodología
 Preparación de la mezcla de Chelex
1. Coloque dentro de un tubo Falcon de 50 ml un agitador magnético y
coloque el tubo dentro de un vaso de precipitados y colóquelo en una
parrilla con agitación.
2. Pese 0.5 g de Chelex dentro del tubo y agregue 5 ml de agua estéril.
3. Mantenga en agitación la suspensión y tome alícuotas de 300-500
microlitros y colóquelos en tubos eppendorf estériles y tape
inmediatamente
Extracción del ADN

1. Coloque de 3-10 microlitros de sangre dentro del tubo Eppendorf que

contiene la mezcla de Chelex y agítelo en el vortex por 10-15 segundos
2. Centrifugue la muestra brevemente a alta velocidad en una
microcentrífuga (
3. Incube la muestra por 20 minutos a 95°C
4. Vuelva a agitar en el vortex por 10-15 segundos. (Sea cuidadoso, el
vapor puede expulsar las tapas del tubo. Sosténgalo con fuerza)
5. Centrifugue el tubo a 6000 rpm por 1 minuto
6. Separe el sobrenadante que contiene el ADN extraído y guárdelo para su
posterior cuantificación.
CUESTIONARIO

1. Mencione 2 medios de cultivo diferentes a YPD que podría utilizar para

propagar levaduras
2. ¿Qué son las nucleasas de restricción?
3. Mencione otros métodos para la extracción de ADN
4. ¿Cómo se puede cuantificar el ADN extraído?
 ENSAYO DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN PARA ANALIZAR EL
POLIMORFISMO DE GLOBINA BETA S MEDIANTE RFLP

(Práctica en laboratorio virtual Cibertorio)

Fundamento:
La anemia drepanocítica (anemia de células falciformes) se origina por la mutación
de un solo nucleótido en el gen de globina beta humana. Esto genera en la
población un polimorfismo, definido por la presencia del alelo normal o el mutado,
en cada uno de los dos cromosomas 11 homólogos.

Pretendemos estudiar el posible diagnóstico genético de esta enfermedad a través

de un polimorfismo RFLP, es decir, mediante restricción y electroforesis.

Como material de partida disponemos de muestras de DNA (virtuales)

correspondientes a una parte de ese gen, para las dos variantes (normal, AA o WW,
y drepanocítica, SS).

Por lo tanto, vamos a estudiar un locus que corresponde a una parte del gen de
globina beta y que contiene el punto polimórfico.

Más información (no necesaria para la práctica):

Concretamente, las muestras comprenden el exón 1, el
intrón A, el exón 2 y parte del intrón B.
Recuerda que el polimorfismo se sitúa en el exón 1.

Aclaración de la nomenclatura:
A la hemoglobina normal del adulto, a2 b2 , se la llama
habitualmente hemoglobina A; de ahí el nombre A para el alelo
normal de la globina beta aquí estudiado. También se representa
como W, de wild type (tipo salvaje o silvestre).

La hemoglobina de las células falciformes (sickle cells), a2 bS2 ,

se denomina hemoglobina S.
 A lo largo de la práctica tendrás que conservar información para pasarla de una
ventana a otra del programa; utiliza para ello el “Bloc de Notas” de Windows.
Conviene que añadas tus propios comentarios para identificar la información que vas
guardando; puedes imprimirlo al acabar, para llevarte toda la información e incluirla
en tu cuaderno de prácticas.
Ayuda para copiar y pegar texto: utiliza el menú que aparece al pulsar el botón
derecho del ratón o, con el teclado, pulsa Ctrl+C para copiar y Ctrl+V para pegar.

Bibliografía:
 J. Luque y A. Herráez (2001) Texto Ilustrado de Biología Molecular e
Ingeniería Genética, págs. 381-383. Ediciones Harcourt / Elsevier España,
Madrid.

Cómo comenzar:
El laboratorio virtual funciona dentro de una página web, por lo que debes
comenzar abriendo el navegador de internet (Internet Explorer o Firefox).

Una vez que se abra el programa, debes buscar la página de Cibertorio:

Puede estar en los “Favoritos” o “Marcadores”; si no, visita

http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/
 BÚSQUEDA DE UNA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ADECUADA PARA DETECTAR
EL POLIMORFISMO

Objetivo:
Encontrar una enzima de restricción que corte de forma diferente los alelos
normal (W o A) y mutado (S) del gen de globina beta.

Materiales virtuales:
Software:

• Laboratorio virtual de biología molecular “Cibertorio”

Reactivos virtuales:

• Enzimas de restricción (deben comprarse en BobCoTM, como se explica más

adelante)

• Grupo de muestras para diagnóstico genético (también comprado en

BobCoTM), que contiene las siguientes muestras de DNA:

• DNA del gen de globina b de una persona homocigótica normal

(representada como AA o WW).

• DNA del gen de globina b de una persona homocigótica falciforme

(representada como SS).

• Cuatro muestras de DNA de pacientes cuyo genotipo se pretende

averiguar (designadas Pt1, Pt2, Pt3 y Pt4); en esta práctica no las
usaremos.

• Marcador de masa molecular de DNA (gratuito, de BobCoTM)

• Tampón universal de restricción 10x (gratuito, de BobCoTM)

• Agua

• Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 mL

• Agarosa

• Tampón de electroforesis TBE (Tris/Borato/EDTA)

• Bromuro de etidio

• Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol,

xileno-cianol y glicerol)

Instrumentación virtual:
 • Micropipeta variable hasta 100 mL

• Incubador con regulación de temperatura BobCo Temp-O-MaticTM

• Cubeta de electroforesis horizontal en agarosa BobCo Gel-O-MaticTM

• Fuente de corriente continua BobCo 1000ZXTM (de 10 a 1000V)

• Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)

• Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV

Procedimiento:
Comienza pulsando en el botón “Iniciar Cibertorio”. Aparecerá un aviso
requiriendo que se haga un pedido de enzimas; acéptalo.

1) Investiga la página del Catálogo en línea. Anota el tamaño en pares de bases

de los componentes del patrón de tamaños (Escalera de DNA) que
emplearás más adelante para la electroforesis.
2) Pulsa el enlace para acceder al “Formulario de pedido”. Rellena los datos
solicitados (esto es una simulación de una situación real, no es importante
lo que escribas mientras no cambies la contraseña).
3) Selecciona las 4 enzimas que te han asignado y el “Grupo de muestras para
diagnóstico genético”.
4) Pulsa el botón “Enviar el pedido”. Espera a que se actualice la pantalla y
aparezca el laboratorio simulado (tubos, pipeta, etc.).
 Uso de la micropipeta virtual
Para seleccionar el tubo sobre el que
quieres actuar debes pulsar sobre él con
el ratón (no sobre la tapa ni la etiqueta);
se abrirá su tapa y la pipeta se
desplazará a él. Haciendo clic en el
pulsador superior del émbolo consigues
que se desplace, expulsando o aspirando
alternativamente el contenido de la
punta. El volumen que se quiere
pipetear se establece pulsando con el
ratón sobre la rueda de ajuste (mitad
izquierda disminuye, mitad derecha
aumenta) o escribiendo en la casilla del
indicador de volumen (no pulses la tecla
Enter).
El intervalo de trabajo de la micropipeta
es de 1 a 100 μL, en pasos de 1 μL.

Para evitar contaminación, se deben

cambiar las puntas cada vez que se cambia
de muestra. La punta se expulsa haciendo
clic con el ratón sobre la palanca expulsora
de puntas o sobre el cubo de basura.

Se consigue una punta nueva haciendo

clic sobre la caja de puntas.

Posibles problemas:
Dependiendo de la configuración de seguridad del navegador, es posible que
se bloquee el acceso al impreso de pedido hasta que aceptes un aviso similar
a éste:

Si, por algún error, necesitas empezar de nuevo con tubos limpios, pulsa el
botón correspondiente, situado a la izquierda de la caja de puntas.

Tras pulsar con el ratón sobre tubo, pipeta, etc., deja tiempo para que ocurra lo
que sea. No seas impaciente.
Al pulsar el émbolo de la pipeta, el cursor-mano no desaparece: mueve el
puntero del ratón fuera de la pipeta.

Si quieres ver mejor el líquido que hay dentro de un tubo, puedes hacer que la
pipeta salga del tubo pulsando de nuevo en el tubo.

5) Prepara mezclas de reacción para ensayar la restricción de las dos muestras

de DNA (AA y SS) con cada una de las cuatro enzimas asignadas. Para ello,
debes poner en cada tubo 10 L de uno de los tipos de DNA, 4 L de tampón
10x, 25 L de agua y 1 L de una de las enzimas de restricción. Incluye
también, como control, un tubo con cada muestra de DNA sin enzima.
Nota: de las 78 enzimas disponibles en el programa, 57 no cortan en esa
región del DNA y, entre las 21 que sí cortan, sólo 3 ven afectada su diana
por la mutación y, por ello, sirven para estudiar este polimorfismo. Esto
ilustra la baja probabilidad de que se pueda detectar mediante análisis de
restricción un polimorfismo causado por la mutación de un único
nucleótido.
Haz una tabla en la que indiques los reactivos y los volúmenes que debes
pipetear en cada tubo.

6) Pon en marcha la reacción de restricción pulsando en el botón “Comenzar”

(está en la parte central inferior, bajo el cronómetro). Transcurrido el
tiempo virtual requerido, se ha completado la reacción. Aparece un mensaje
que te informa de lo que se ha añadido en cada tubo; verifica que coincide
con lo que pretendías.
7) En el menú principal de Cibertorio, selecciona el
módulo “Laboratorio de electroforesis”. Pulsa el
botón “Autocargar”, que hará que las muestras
preparadas en la digestión anterior se transfieran a
los pocillos del gel virtual. En el pocillo nº 13 se carga automáticamente una
mezcla de patrones de tamaño.

Los pocillos tras la carga se ven azules debido a los colorantes añadidos
rutinariamente a las muestras (azul de bromofenol y xileno-cianol), para
facilitar que se vean primero éstas y luego el frente de avance. También se
ha añadido un agente denso (p.ej. glicerol, sacarosa o ficoll) que hace que
la muestra se deposite al fondo del pocillo. Los geles de agarosa como éste
se usan generalmente en horizontal.
La “autocarga” es una característica única de los geles BobCoTM; en la
vida real las muestras se deben transferir laboriosamente a mano desde
los tubos a los pocillos con una micropipeta.

8) Ajusta en la fuente de corriente el voltaje a 200 voltios y el tiempo a 2,5

horas virtuales. Conecta la corriente para comenzar la electroforesis.
Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegúrate de tener puestas
 tus gafas o careta virtuales de protección) y apagar las luces de la
habitación virtual para ver cómo va avanzando el DNA y separándose las
bandas.

En cualquier electroforesis, si la fuente de corriente de la que dispones no indica la

intensidad (miliamperios), es importante que te asegures de que está circulando la
corriente. Observa cómo de ambos electrodos se desprenden burbujas, efecto de la
electrólisis del tampón. También verás que las bandas azules de ambos colorantes
avanzan por el gel (al igual que lo hacen las del DNA, si enciendes la luz UV).

Si se usan voltajes superiores, las muestras avanzarán más rápido por el gel, pero
los voltajes elevados producen corriente de alta intensidad y un calentamiento
excesivo del gel que, aparte de afectar a la muestra (por ej., desnaturalizando el
DNA), puede llegar a fundir la agarosa. A diferencia de los geles reales, los geles
BobCoTM nunca se funden, por lo que el único inconveniente de usar un voltaje muy
alto puede ser que las muestras se pierdan por la parte inferior del gel antes de que
te des cuenta.

9) Una vez completada la electroforesis, interpreta los resultados obtenidos:

decide cuál de las enzimas es la adecuada para investigar el polimorfismo
de la globina.
Justifica la enzima elegida y dibuja un esquema de cómo han quedado las
bandas.

10) Por comparación con el avance de las bandas del patrón (“escalera de
DNA”), calcula el tamaño en pares de bases que tienen los fragmentos de
restricción obtenidos del DNA de las muestras. (Este cálculo puede hacerse
de forma precisa mediante una curva de calibrado, o bien de forma
aproximada por comparación visual del avance.)
Para medir el avance de cada banda puedes usar la regla disponible en la
pantalla. (Arrastra la regla usando el ratón y sitúala de modo que el cero
coincida con los pocillos)

Para estimar el tamaño (nº de pares de bases) del DNA de cada banda,
construye una curva de calibrado con log(nºpb) frente a distancia
migrada, empleando los patrones que se hayan separado bien y que
avancen en la misma zona a la que han llegado tus muestras (por ej., los
6 patrones más pequeños).

Representa la curva de calibrado y utilízala para calcular los tamaños.