Introducción.

En México, desde el año 2006 el cáncer de cuello uterino es la segunda causa de

muerte por cáncer en la mujer, además, en el año 2017, la mortalidad en el grupo específico
de mujeres de 25 años y más, fue de 4,031 defunciones, con una tasa de 11.2 por cada
100,000 mujeres de 25 años de edad y más, y con un promedio de edad a la defunción de
58 años.

El 77.5% de los genotipos reportados de VPH corresponden a los de alto riesgo, un

10.1% a VPH 16, un 4.2% a VPH 18 y el resto fueron debido a coinfección de estos
genotipos.

La siguiente imagen muestra la evolución del número de nuevos casos de cáncer

cervicouterinos en México entre los años de 2010 y 2018.

Imagen 1. Gráfica del total de casos registrados de CaCu entre 2010 y 2018 en México.

En el presente documento se plasman las diferentes fases sobre el proyecto de la

identificación del patógeno activo del cáncer cervicouterino (CaCu) desarrolladas a lo largo
de las 5 semanas del curso de Biología Molecular. Dichas fases se desglosan a partir de las
técnicas encontradas para detectar el agente patógeno, la fase activa y los biomarcadores
causales del CaCu en las mujeres mexicanas.
Patógeno causal de CaCu.

El desarrollo de las células humanas normales depende de la información contenida

en el ADN de las células, además de que el ADN es quien conforma nuestros genes y
adicionalmente controla el funcionamiento de nuestras células.

Existen genes encargados de controlar cuándo las células crecen, se dividen y

mueren. Tales genes se dividen en:

 Oncogenes: Son los genes que ayudan a las células a crecer, dividirse y mantenerse
vivas.
 Genes supresores de tumores: Son aquellos genes que ayudan a mantener bajo
control el crecimiento celular y que provocan que las células mueran en el momento
oportuno.

Los virus del papiloma humano (VPH) contienen en particular dos proteínas
conocidas como E6 y E7, que se encargan de desactivar a los genes supresores de tumores
como el p53 y el Rb. Así, las células que recubren el cuello uterino crecen demasiado y
desarrollan cambios en genes adicionales, lo que en algunos casos puede causar cáncer.

La mayoría de las mujeres con VPH no padecen de cáncer cervicouterino debido a

que desarrollan alguno de los tipos de bajo riesgo (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81,
cp6108), sin embargo, factores de riesgo como el fumar o tener múltiples parejas sexuales,
influyen en que las mujeres expuestas al VPH desarrollen alguno de alto riesgo (16, 18, 31,
33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) y por ende tengan cáncer.

La siguiente imagen muestra cómo se ven las diferentes etapas de desarrollo del
cáncer cervicouterino.
 Imagen 1. Etapas de desarrollo del CaCu.

Ciclo replicativo y etapas de la patogénesis.

El proceso de infección de VPH ocurre principalmente, a través de receptores de

integrinas presentes en las células basales. Sin embargo, también puede ser iniciada por
lesiones epiteliales pequeñas, siendo poco el acceso a las células básales donde produce un
amplio espectro de cambios morfológicos una vez infestadas. En la siguiente imagen se
visualiza el desarrollo de la infección.

Imagen 2. Ciclo replicativo del CaCu.

En el núcleo de la célula hospedera, el virus se replica en una relación de 25 a 50

células, y mediado por la actividad de 4 proteínas multifuncionales: E1/E2, E6 y E7.
 ¤ E1/E2: Es la región que generalmente se rompe cuando el genoma viral se inserta en
el genoma hospedador. La disrupción de E2 libera los promotores virales de las
oncoproteínas E6 y E7 e incrementa la expresión de estos genes transformantes.
¤ E6: Es una oncoproteína que se une al producto génico del gen supresor de tumor
p53, lo cual, lleva a formar un complejo E6-p53 que es blanco posterior para la
degradación, y provoca fallos en los mecanismos de proliferación y apoptosis.
¤ E7: Es una oncoproteína que promueve la trascripción viral por dos vías, las cuales
son:
1. Uniéndose al producto génico del gen del retinoblastoma, y liberándose así
el factor de transcripción E2F, el cual es fundamental en la promoción de la
síntesis del ADN.
2. Uniéndose y activando determinados complejos de ciclinas, como la p33-
dependiente de quinasa 2, la cual controla la progresión del ciclo celular.

Fase 1: técnica para el diagnóstico molecular del agente patógeno causal de CaCu.

1.1 Nombre y descripción del fundamento teórico de la técnica:

Para detectar los agentes causales del cáncer cervicouterino, se escogió la técnica de
“Hibridación in situ fluorescente” (FISH), la cual se describe a continuación.

La Hibridación in situ  Fluorescente es una prueba cuya función es detectar

secuencias de ácidos nucleicos en células o tejidos preservados a través del uso de una
sonda marcada con un fluorocromo, la cual va encaminada hacia un lugar específico del
cromosoma y emite fluorescencia que puede ser observada a través de un microscopio.

1.2 Proceso molecular en el que está basada la técnica:

 La prueba de FISH está fundamentada en la capacidad que poseen los ácidos
nucleicos para hibridarse entre sí, en otras palabras, la existencia de determinada secuencia
de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia por medio de puentes de
hidrógeno formados entre las bases adenina- timina (ADN) o uracilo (ARN) y citosina-
guanina (ADN y ARN).

Imagen 3. Proceso molecular de la prueba FISH.

1.3 Descripción y posibles resultados de la técnica:

Para llevar a cabo la prueba del FISH se es necesario extraer una muestra biológica
(sangre) de la paciente para enviarla al laboratorio para analizarla. Una vez allí el análisis se
efectúa de la siguiente manera:

a) Fijación y permeabilización de la muestra para facilitar la penetración de la sonda

fluorescente dentro de la célula y para proteger al ARN de la degradación por
ribonucleasas endógenas.

b)  Hibridación, es cuando a la muestra desnaturalizada se le añade la sonda de interés

que se unirá a la secuencia escogida del ARNr.

c) Lavado de las láminas con agua destilada para remover la sonda que no se unió.
d) Visualización de la muestra través de un microscopio de epifluorescencia equipado
con diversos filtros para los diversos espectros de color.
 En la siguiente imagen se muestra a manera de resumen el proceso de esta técnica.

Imagen 4. Procedimiento estándar de la prueba FISH.

Los posibles resultados obtenidos a partir de este análisis se muestran a continuación a

manera de mapa conceptual.

Resultados de la
Hibridación in situ

Muestras Muestras sin

bioluminiscentes bioluminiscencia

Positivo a CaCu Negativo a CaCu

Imagen 5. Muestra positiva a CaCu. Imagen 5. Muestra negativa a CaCu.

1.4 Aplicación de la técnica en las mujeres mexicanas:

Según la Secretaría de Salud mexicana, “En año 2013 ocurrieron en el país 269,332
defunciones en mujeres mexicanas, de las cuales, el cáncer de mama y el cervicouterino
ocuparon un 25% de esa cifra”.

Como vimos en su descripción, la prueba de Hibridación in es una de las tácticas

más efectivas para la detección de los agentes causales del cáncer cervicouterino, por lo
cual, aplicarla en las mujeres mexicanas es de vital importancia ya que así podemos
prevenir si no en su mayoría, por lo menos un cierto porcentaje de este padecimiento, así
como el número de defunciones que ocurren por no tener una detección temprana del
cáncer.

Fase 2: técnica molecular para detectar la fase activa del agente causal de CaCu.

2.1 Nombre y descripción del fundamento teórico de la técnica:

La técnica escogida en este caso para la detección de la infección activa del cáncer
cervicouterino es la “Captura de Híbridos 2”, dicha técnica se describe a continuación.

La prueba de Captura de Híbridos 2 (CH2) es la prueba más antigua utilizada en

tamizaje y ha sido validada clínicamente en múltiples estudios. Permite la detección de
VPH-AR a través del uso de un cóctel de sondas para los 13 VPH-AR.

Como su nombre lo indica, es una técnica en la cual se identifican híbridos ADN

con sondas de ARN.

2.2 Proceso molecular en el que está basada la técnica:

La función que tiene esta técnica es desnaturalizar el ADN y posteriormente

mezclarlo con un híbrido que funciona como sonda; posteriormente, se añaden anticuerpos
ligados a un marcador enzimático, que emite quimioluminiscencia en los lugares donde
ocurre la unión del híbrido con las secuencias complementarias. Además, utiliza un formato
de hibridización líquida seguido de una amplificación de señal para detectar 13 subtipos
diferentes de VPH de alto riesgo.
En la siguiente imagen se aprecia el proceso de sobre esta técnica de la Captura
Híbrida 2.

Imagen 6. Secuencia del proceso de Captura de híbridos 2.

2.3 Descripción y posibles resultados de la técnica:

La toma de la muestra se realiza mediante un cepillo que se introduce en el canal

endocervical por algún médico u enfermera previamente capacitados. Este cepillo se coloca
posteriormente en el tubo que acompaña la prueba de CH2, que contiene el medio para su
transporte al laboratorio.

Posteriormente, en el laboratorio la muestra es sometida al proceso molecular (ver

imagen 1) para poder detectar si la paciente es positiva o no a alguno de los 13 tipos de
VPH-AR.
A continuación, se muestra una imagen que ejemplifica el proceso de la toma de la
muestra en una paciente.
 Imagen 7. Toma de la muestra y análisis de Captura de Híbridos 2.

En el laboratorio, la muestra obtenida de del cérvix es sometida a una solución

alcalina desnaturalizante que expone el material genético. Posteriormente, mediante el uso
de un cóctel de sondas de ARN (correspondientes a los 13 tipos de VPH-AR 16, 18, 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) y se produce en presencia de cualquiera de estos virus, la
formación de un híbrido ADN viral-ARN. La hibridación es identificada mediante
anticuerpos específicos y una solución quimio-luminiscente que produce una emisión de
luz cuando hay presencia de híbridos.

El siguiente mapa conceptual muestra los posibles resultados obtenidos al realizar la

prueba de Captura de Híbridos 2.

Resultados de la
Captura de Híbridos 2
 Emisión de luz Sin emisión de luz
bioluminiscente bioluminiscente

Positivo Negativo

Imagen 8. Células infectadas con VPH. Imagen 9. Células sin infección de VPH.

2.4 Aplicación de la técnica en las mujeres mexicanas:

La técnica de Captura de Híbridos 2 es una de las pruebas más revolucionadas desde

el año 2000 para la detección de cáncer cervicouterino, por lo cual, su aplicación en las
mujeres mexicanas es de vital importancia para detectar a tiempo el CaCu y llevar a cabo
los tratamientos necesarios para combatirlo.

Desafortunadamente, hoy en día todavía existe una gran desinformación en la

población mexicana sobre el desarrollo del cáncer, especialmente en las mujeres que viven
en zonas rurales.

Así, concluyo que para la aplicación de esta prueba es necesario llevar a cabo
primeramente campañas de información sobre el cáncer cervicouterino y las consecuencias
que desencadena, y así posteriormente promocionar la aplicación de esta prueba.

Fase 3: técnica molecular para detectar la presencia de biomarcadores de riesgo en

mujeres.
3.1 Nombre y descripción del fundamento teórico de la técnica:

Para la detección de las oncoproteínas causantes del cáncer cervicouterino se ha

escogido la técnica de "Electroforesis en gel de poliacrilamida”, mejor conocida como
SDS-PAGE.

Esta técnica permite la separación de una mezcla de proteínas según su peso

molecular y es la prueba de entrada para la purificación de tales proteínas y así poder ser
analizadas por espectrometría de masas, estimación del peso molecular, la identificación de
variaciones existentes en la expresión genética o en la estructura de las mismas proteínas.

Imagen 10. Proceso de detección de biomarcadores por la técnica de electroforesis en gel.

En la imagen anterior se plasma la prueba de SDS-PAGE. En este proceso se

aplica un campo eléctrico para mover moléculas cargadas a través de una solución en
todas las formas de electroforesis.

3.2 Etapa del Dogma Central de la Biología Molecular en que se producen los
biomarcadores:

Tanto la proteína p53 y la Rb se producen en la etapa G1 del ciclo celular, que es

cuando la célula se prepara para dividirse. Los biomarcadores p53 y Rb son algunos de los
puntos de control dentro del ciclo celular.

Se sabe que la elevación de los niveles p53 incita a las células a detenerse al final de
la fase G1, sin embargo, no interrumpen el ciclo celular aún después de que el ADN haya
sufrido daños. La alteración de lose biomarcadores p53 y Rb provocan la degradación del
gen.

Las siguientes imágenes muestran la función de p53 (imagen 3) y Rb (imagen 4)

dentro del dogma central de la biología molecular.

Imagen 11. Intervención del biomarcador p53 en el ciclo celular.

Imagen 12. Función del biomarcador p53 en el ciclo celular.

3.3 Descripción y posibles resultados de la técnica:

Para poder llevar a cabo este estudio, es necesario extraer una muestra de sangre de
la paciente por parte del equipo médico y posteriormente es enviada al laboratorio, donde
se realiza el procedimiento de la electroforesis en gel.
Una vez en el laboratorio, se llevan a cabo los siguientes pasos:

1. Se añade un detergente (dodecilsulfato de sodio) a la solución donde se tienen las

proteínas.
2. Se prepara el gel de poliacrilamida para analizar las proteínas (gel separador).
3. Uno de los carriles del gel se prepara con un marcador de peso molecular.
4. El gel de poliacrilamida se carga con las soluciones de las proteínas.
5. Se aplica un campo eléctrico al gel para que se pueda mover (parte negativa al
inicio y la positiva al final del gel).
6. Finalmente, el gel se tiñe con un colorante específico de proteínas para poder
visualizar las bandas.

A continuación, se muestra una imagen donde se resume el procedimiento llevado a

cabo para la realización del análisis.

Imagen 13. Procedimiento del SDS-PAGE

En el siguiente mapa conceptual, se muestran los posibles resultados obtenidos del

análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

Resultados del SDS-

PAGE para p53 y Rb
 Sin presencia Presencia de
de las proteínas las proteínas

Positivo a CaCu Negativo a CaCu

Imagen 14. SDS-PAGE sin presencia de p53 y Rb. Imagen 15. SDS-PAGE con presencia de p53 y
Rb.

En el mapa anterior, se muestra que cuando en la técnica de SDS-PAGE los

biomarcadores p53 y Rb son visibles en los carriles del gel de poliacrilamida una vez
terminado el estudio, se puede decir que la paciente es negativa para CaCu. Por el contrario,
si estos biomarcadores no son visibles, la paciente es positiva para CaCu.

3.4 Aplicación de la técnica en las mujeres mexicanas:

El análisis de electroforesis en geles de poliacrilamida es una técnica muy útil para
la detección de los biomarcadores p53 y Rb en el diagnóstico del cáncer cervicouterino, por
lo que aplicarlo en las mujeres mexicanas sería muy útil para una detección temprana de
cáncer cervicouterino.

Para poder llevar a cabo estos estudios aquí en México, es necesario realizar
primeramente campañas informativas sobre los problemas que desencadena el cáncer
cervicouterino (ya que desafortunadamente estas enfermedades son un tabú principalmente
en sectores rurales de la población), y posteriormente, promocionar la aplicación de la
SDS-PAGE.
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