de ®

Ensayos de microARN TaqMan

Protocolo

© Copyright 2005-6, Applied Biosystems. Todos los derechos reservados.

Solo para uso de investigación. No para uso en procedimientos de diagnóstico.
La información en este documento está sujeta a cambios sin previo aviso. Applied Biosystems no asume
ninguna responsabilidad por los errores que puedan aparecer en este documento. En ningún caso Applied
Biosystems será responsable de daños incidentales, especiales, múltiples o consecuentes en relación con o que
surjan del uso de este documento.
AVISO AL COMPRADOR: LICENCIA LIMITADA
Una licencia para realizar el proceso de nucleasa de 5' para la investigación requiere el uso de un Kit de Nucleasa
de 5' con licencia (que contiene una sonda con licencia), o la combinación de unkit de núcleo de nuclea se de 5'
autorizado más unasonda con licencia, o derechos de licencia que se pueden comprar a Applied Biosystems. Este
producto contiene Licensed Probe. Su precio de compra incluye una inmunidad limitada e intransferible
contra la demanda bajo las patentes estadounidenses Nos. 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787 y 6,258,569,
y las reclamaciones de patentes correspondientes fuera de los Estados Unidos, propiedad de Applera
Corporation, y los Estados Unidos. Patente No. 5.804.375 (reclamaciones 1-12 solamente) y correspondientes
reclamaciones de patent fuera de los Estados Unidos, propiedad de Roche Molecular Systems, Inc. o F.
Hoffmann-La Roche Ltd (ìRocheî), por utilizar únicamente esta cantidad de sonda en la práctica del proceso de
nucleasa 5í únicamente para la propia investigación interna de los compradores. Este producto también es una
sonda con licencia para su uso con sublicencias de servicio disponibles en Applied Biosystems. Este producto no
transmite ninguna informaciónbajo las patentes estadounidenses Nos. 5,210,015 y 5,487,972, o las reclamaciones
de patentes correspondientes fuera de los Estados Unidos, que reclaman 5í procesos de nucleasa, o bajo los
Estados Unidos. Patentes Nos. 5.476.774 y 5.219.727, o reivindicaciones de patentes correspondientes fuera
de los Estados Unidos, que reivindican la metodología de cuantificación, expresamente, por implicación, o
por estoppel. Por la presente no se concede expresamente, por implicación, o impedimento, ningún derecho en
virtud de ninguna otra reivindicación de patente (como reclamaciones de aparatos o sistemas) ni derecho a
realizar servicios comerciales de ningún tipo, incluidos, entre otros, la notificación de los resultados de las
actividades del comprador a cambio de una tarifa u otra contraprestación comercial. Este producto es solo para
uso de investigación. Los usos de diagnóstico requieren una licencia independiente de Roche.
Aviso al Comprador: Descargo de responsabilidad de licencia
El ensayo de microARN TaqManÆ está optimizado para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) cubierta por patentes propiedad de Roche Molecular Systems, Inc. y F. Hoffmann-La Roche Ltd.
Ninguna licencia bajo estas patentes para utilizar el Proceso de PCR se transmite expresamente o por
implicación al comprador por la compra de estos productos. Una licencia para utilizar el Proceso de PCR
para la propia investigación interna del comprador acompaña la compra de ciertos reactivos de Applied Biosystems
cuando se usan junto con un termociclador autorizado, o está disponible en Applied Biosystems.
Marcas
AB (Design), ABI PRISM, Applyd Biosystems y AmpErase son marcas comerciales registradas y Applera, FAM,
ROX, MicroAmp y MultiScribe son marcas comerciales de Applera Corporation o sus subsidiarias en los EE. UU.
y/o algunos otros países.
AmpliTaq Gold y TaqMan son marcas comerciales registradas de Roche
Molecular Systems, Inc. Todas las demás marcas comerciales son propiedad
de sus respectivos propietarios.

Número de 4364031
Rev. B 01/2006
 Contenido

Prefacio v.......................................................................................................................................................................................
Safety en Cómo................................................................................................................................ obtener soporte

Sección................................................................................................................................................................................................. 1

Introducción.............................................................................................................................................................................................
Visión general.............................................................................................................................................................................................................1
Propósito....................................................................................................................................................................................................................1
Acerca de los microARN............................................................................................................................................................................................1
Acerca de este producto............................................................................................................................................................................................2
Ensayos............................................................................................................................................................. de microARN TaqMan disponibles
.................................................................................................................................................................................................................................... 2
Acerca de este............................................................................................................................................................................................. protocolo
.................................................................................................................................................................................................................................... 2
Descripción..................................................................................................................................................................................................... general
..............................................................................................................................................................................................................de laquímica 3
Two-St ep................................................................................................................................................................. RT-PCR
...................................................................................................................................................................................3
.....................................................................................................................................................................................
Acerca de las sondas.......................................................................................................................................................................4
Proceso de ensayo de nucleasa................................................................................................................................................................. de
.................................................................................................................................................................................5'4
.....................................................................................................................................................................................
Materiales y Equipos.....................................................................................................................................................................6
Productos................................................................................................................................................disponibles6
Almacenamiento 6...................................................................................................................................................................................
Materiales y equipos no............................................................................................................................................... incluidos
...................................................................................................................................................................................6
.....................................................................................................................................................................................
Prevención de la contaminación...........................................................................................................................................................9
Visión general 9...................................................................................................................................................................................
Prácticas generales....................................................................................................................................................... de PCR
...................................................................................................................................................................................9
.....................................................................................................................................................................................
Resumen....................................................................................................................................deprocedimientos 10

Sección 2.......................................................................................................................................................................... Uso

............................................................................................................................................. de ensayos individuales
...................................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................................11
.....................................................................................................................................................................................
Transcripción...............................................................................................................................................inversa11
Visión general 11.................................................................................................................................................................................
Directrices de la plantilla de............................................................................................................................ARN11
Cantidad de........................................................................................................................................ entrada por reacción de
............................................................................................................................................................................ ARN
..........................................................................................................................................................................total11
.....................................................................................................................................................................................

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo iii

 Preparación de RT Reaction Master Mix....................................................................................................................................12
Preparación de la............................................................................................................................................................. reacción
............................................................................................................................................................................RT13
.....................................................................................................................................................................................
Realización de la transcripción inversa......................................................................................................................................14

Amplificación......................................................................................................................................por PCR14
Visión general 14..........................................................................................................................................................................
PCR P................................................................................................................................................................rocess 14
Directrices para la preparación de reactivos.............................................................................................................................15
Componentes de reacción por.............................................................................................................................................PCR15
Preparación de la placa de reacción.................................................................................................................................... pcrista 16
Configuración del docu............................................................................................................................................................. 17
de la......................................................................................................................................................................
placa
Corriendo la placa............................................................................................................................................................18

Sección 3 Análisis de datos.............................................................................................................................................21

Proceso................................................................................................................................................general21
Herramientas para................................................................................................................................ analizar los resultados del
ensayo de microARN............................................................................................................................ TaqMan 21
..............................................................................................................................................................................
Recursos para el análisis de datos.........................................................................................................................................22

Bibliografía 23..........................................................................................................................................................................

iv TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

Prefacio

Este prefacio contiene:

Seguridad..................................................................................................................v
Cómo obtener soporte..........................................................................................ix

Palabras de alerta de seguridad y seguridad

Cuatro palabras de alerta de seguridad aparecen en la documentación del usuario de
Applied Biosystems en los puntos del documento en los que debe estar al tanto
de los peligros relevantes. Cada palabra de alerta –IMPORTANTE,
PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA, PELIGRO– implica un nivel particular
deobservación o acción, como se define a continuación:
¡IMPORTANTE! – Indica la información que es necesaria para el correcto
funcionamiento del instrumento, el uso preciso del kit de químicao el uso seguro deun
producto químico.

– Indica una situación potencialmente peligrosa que, si no

se evita, puede resultar en lesiones menores o moderadas. También se
puede utilizar para alertar contra prácticas inseguras.

– Indica una situación potencialmente peligrosa que, si

no se evita, podría resultar en la muerte o lesiones graves.

– Indica una situación inminentemente peligrosa que, si no

se evita, resultará en la muerte o lesiones graves. Esta palabra clave debe
limitarse a las situaciones más extremas.

Advertencia de peligro químico

PELIGROQUÍMICO. Algunos de los productos químicos

utilizados con los instrumentos y protocolos de Applied Biosystems son
potencialmente peligrosos y pueden causar lesiones, enfermedades o la muerte.

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo v

 Directrices de seguridad química
Para minimizar los peligros de los productos químicos:

• Lea y comprenda las Hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS)

proporcionadas por el fabricante de productos químicos antes de
almacenar, manipular o trabajar con cualquier producto químico o
material peligroso. (Consulte "Acerca de las MSDS" a continuación).
• Minimizar el contacto con productos químicos. Use el equipo de
protección personal adecuado cuando manipule productos químicos (por
ejemplo, gafas de seguridad, guantes o ropa protectora). Para obtener
directricesadicionales de seguridad, consulte la MSDS.
• Minimizar la inhalación de productos químicos. No deje abiertos los
recipientes de productos químicos. Úselo solo con ventilación adecuada
(por ejemplo, campana extractora de humos). Para obtener pautas de
seguridad adicionales, consulte la MSDS.
• Revise regularmente si hay fugas o derrames químicos. Si se produce
una fuga o derrame, siga los procedimientos de limpieza del fabricante
según lo recomendado en la MSDS.
• Cumplir con todas las leyes y regulaciones locales, estatales / provinciales o
nacionales relacionadas con el almacenamiento, manejo y eliminación de
productos químicos.

Acerca de las MSDS

Los fabricantes de productos químicos suministran las hojas de datos de seguridad
de materiales (MSDS) actuales con envíos de productos químicos peligrosos a
nuevos clientes. También proporcionan a las MSDS el primer envío de un
producto químico peligroso a un cliente después de que se haya actualizado una
MSDS. Las MSDS proporcionan la información de seguridad que necesita para
almacenar, manipular, transportar y desechar los productos químicos de forma
segura.
Cada vez que reciba unMSDS ne w empaquetado con un producto químico
peligroso, asegúrese de reemplazar el MSDS apropiado en sus archivos.

Obtención de MSDS
La MSDS para cualquier producto químico suministrado por Applied
Biosystems está disponible para usted de forma gratuita las 24 horas del
día. Para obtener MSDS:

1. Ir a https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html
2. En el campo Buscar de la página Búsqueda de MSDS:
a. Escriba el nombre del producto químico, el número de pieza u
otra información que espera que aparezca en la MSDS de
interés.

vi TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 b. Seleccione el idioma de su elección.
c. Haga clic en Buscar.
3. Para ver, descargar o imprimir el documento de interés:
a. Haga clic con el botón secundario en el título del documento.
b. Escoger:
• Abrir – Para ver el documento
• Guardar destino como: para descargar una versión PDF
del documento en un destino que elija
• Destino de impresión: para imprimir el documento
4. Para que se envíe una copia de una MSDS por fax o correo electrónico,
en la página Resultados de la búsqueda:
a. Seleccione Fax o Correo electrónico debajo del título del documento.
b. Haga clic en RECUPERAR DOCUMENTOS al final de la
lista de documentos.
c. Introduzca la información requerida.
d. Haga clic en Ver/Entregar documentos seleccionados ahora.
Nota: Para las MSDS de productos químicos no distribuidos por
Applied Biosystems, póngase en contacto con el fabricante de productos
químicos.

Peligro de residuos químicos

PELIGRO DE RESIDUOS QUÍMICOS. Algunos

desechos producidos por el funcionamiento del instrumento o sistema son
potencialmente peligrosos y pueden causar lesiones, enfermedades o la muerte.

Directrices sobre la seguridad de los residuos químicos

Para minimizar los peligros de los desechos químicos:

• Lea y comprenda las Hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS)

proporcionadas por los fabricantes de los productos químicos en el
contenedor de desechos antes de almacenar, manipular o desechar los
desechos químicos.
• Proporcionar contenedores de residuos primarios y secundarios. (Un
recipiente primario de residuoscontiene los residuos inmediatos. Un
contenedor secundario contiene derrames o fugas del contenedor primario.
Ambos contenedores deben ser compatibles con el material de desecho y
cumplir con los requisitos federales, estatales y locales para el
almacenamiento de contenedores).

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo vii

 • Minimizar el contacto con productos químicos. Use el equipo de
protección personal adecuado cuando manipule productos químicos (por
ejemplo, gafas de seguridad, guantes o ropa protectora). Para obtener
pautas de seguridad adicionales, consulte la MSDS.
• Minimizar la inhalación de productosquímicos. No deje abiertos los
recipientes de productos químicos. Úselo solo con ventilación adecuada
(por ejemplo, campana extractora de humos). Para obtener pautas de
seguridad adicionales, consulte la MSDS.
• Manipule los desechos químicos en una campana extractora de humos.
• Después de vaciar el contenedor de residuos, selle con la tapa
proporcionada.
• Deseche el contenido de la bandeja de residuos y la botella de
residuos de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio y las
regulaciones ambientales y sanitarias locales, estatales / provinciales o
nacionales.

Eliminación de residuos
Si se generan residuos potencialmente peligrosos al operar el
instrumento, debe:

• Caracterizar (mediante análisis si es necesario) los residuos generados por las

aplicaciones particulares, reactivos y sustratos utilizados en su
laboratorio.
• Garantice la salud y la seguridad de todo el personal de su laboratorio.
• Asegúrese de que los desechos del instrumento se almacenen,
transfieran, transporten y eliminen de acuerdo con todas las
regulaciones locales, estatales / provinciales y / o nacionales.
¡IMPORTANTE! Los materiales radiactivos o biopeligrosas pueden requerir
un manejo especial, y pueden aplicarse limitaciones de eliminación.

Seguridad de los peligros biológicos

RIESGO BIOLÓGICO. Las muestras biológicas como

tejidos, fluidos corporales, agentes infecciosos y sangre de humanos y otros
animales tienen el potencial de transmitir enfermedades infecciosas. Siga todas las
regulaciones locales,estatales / provinciales y / o nacionales aplicables. Use el
equipo de protección adecuado, que incluye, entre otros: gafas protectoras,
protector facial, ropa / bata de laboratorio y guantes. Todo el trabajo debe
llevarse a cabo en instalaciones debidamente equipadas utilizando el equipo de
seguridad adecuado (por ejemplo, contención física).

vi TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 dispositivos). Las personas deben ser capacitadas de acuerdo con los requisitos
reglamentarios y de la empresa / institución aplicables antes de trabajar con
materiales potencialmente infecciosos. Lea y siga las pautas aplicables y / o
los requisitos reglamentarios en lo siguiente:

• Directrices del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los

Estados Unidos publicadas en Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories (stock no. 017-040-00547-4;
http://bmbl.od.nih.gov)
• Seguridad y Salud Ocupacional Standards, Patógenos transmitidos por la
sangre (29 CFR§1910.1030; http://www.access.gpo.gov/
nara/cfr/waisidx_01/29cfr1910a_01.html ).
• Los protocolos del Programa de Bioseguridad de su empresa/institución
para trabajar con/manipular materiales potencialmente infecciosos.
Cómo obtener
Apoyo Información adicional sobre las pautas de riesgo biológico está disponible en:
http://www.cdc.gov

Para obtener los servicios más recientes y la información de soporte para todas
las ubicaciones, vaya a http://www.appliedbiosystems.comy, a continuación,
haga clic en el enlace Soporte.
En la página de soporte, puedes:

• Buscar a través de preguntas frecuentes (FAQs)

• Envíe una pregunta directamente al Soporte Técnico
• Solicitar documentos de usuario de Applied Biosystems, MSDS,
certificados de análisis y otros documentos relacionados
• Descargar documentos PDF
• Obtener información sobre la formación de clientes
• Descargar actualizaciones y parches de software
Además, la página de soporte proporciona acceso a números de teléfono y fax
de todo el mundo para ponerse en contacto con las instalaciones de soporte técnico
y ventas de Applied Biosystems.

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo ix

x TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo
 Química Visión
Sección 1 Introducción general

Visión general

Propósito Los ensayos de MicroARN deTaqMan®están diseñados para detectar y cuantificarcon

precisión los microARN maduros (miARN) utilizando instrumentos de PCR en

Introducción
tiempo real de Applied Biosystems.
Los ensayos de microARN de TaqMan ofrecen varias ventajas distintas sobre los
métodos convencionales de detección de miARN, que incluyen:

• Datos cuantitativos de alta calidad: los ensayos pueden detectar y

cuantificar miRNA en más de seis registros de rango dinámico.
• Sensibilidad: los ensayos pueden detectar miRNAs en tan solo 1 a 10 ng
de ARN total, lo que le permite conservar muestras limitadas.
• Alta especificidad: los ensayos detectan solo miRNA maduro, no su
precursor, con discriminación de base única.
• Metodología rápida y sencilla: el protocolo de dos pasos tarda menos de
cuatro horas y se puede utilizar con cualquier instrumento de PCR en
tiempo real de Applied Biosystems.

Acerca de los microARN Los microARN son ARN endógenos, de aproximadamente 22 nucleótidos de
largo, que desempeñan importantes funciones reguladoras en animales y plantas
al dirigirse a las transcripciones de ARNm para el ahorro o la represión
traslacional (Bartel, 2004). Hasta la fecha, se han identificado cientos de miRNAs
únicos y maduros en todas las especies, y se siguen descubriendo más.
Sus niveles de expresión varían mucho entre especies y tejidos (Kim
et al., 2004).
Los miRNAs poco abundantes han sido difíciles de detectar en base a las tecnologías
actuales, como la clonación, la hibridación del norte (Lim et al., 2003), microarreglos
y otras técnicas.

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo xi

Acerca de este producto
Los ensayos de microARN de TaqMan utilizan RT-PCR de imprimación en
bucle, un nuevo método de cuantificación en tiempo real, para detectar con
precisión miRNAs maduros.
Cada ensayo de microARN de TaqMan incluye:

• Un tubo que contiene un cebador RT específico de miRNA

• Un tubo que contiene una mezcla de:
TaqMan disponible – Cebador de PCR hacia adelante específico de miRNA
Ensayos de microRNA – imprimación PCR inversa específica
– Sonda TaqMan MGB específica de miRNA
Los ensayos de microARN de TaqMan están disponibles para una variedad de
especies. Debido a que muchas secuencias maduras de miRNA son idénticas en
todas las especies relacionadas, muchos ensayos para humanos también son
Acerca de este
válidos para ratones y ratas.
protocolo
Póngase en contacto con el soporte técnico o visite
www.appliedbiosystems.com para obtener más información.
Para obtener la lista más reciente de ensayos, consulte el sitio web de
Applied Biosystems:

http://www.appliedbiosystems.com/http://www.appli edbiosystems.com
Este protocolo proporciona:

• Información general sobre los ensayos de microARN de TaqMan

• Una lista de equipos y materiales necesarios para el protocolo
• Procedimientos para el uso de ensayos de microARN de TaqMan

xi TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 Química Visión
general
Descripción general de la química

RT-PCR de
dos pasos La cuantificación utilizando los ensayos de microARN de TaqMan se realiza
mediante RT-PCR de dos pasos:

Introducción
1. En el paso de transcripción inversa (RT), el ADNc se transcribe inversamente
de muestras de ARN total utilizando cebadores específicos de miRNA de los
ensayos de MicroARN de TaqMan y reactivos del Kit de Transcripción
Inversa de MicroARN de TaqMan®.

2. En el paso de PCR, los productos de PCR se amplifican a partir de muestras

de ADNc utilizando el ensayo de microARN TaqMan junto con la
mezcla maestra de PCR universal de TaqMan®.

Paso 1 = RT

Extensión de la
imprimación sobre
miRNA Imprim
5 3 ación
Mirna
RT en
bucle

Síntesis de la primera hebra de ADNc

3 5
Paso 2 = PCR en tiempo real

Extensión de la imprimación sobre el ADNc

Imprimación delantera
3 5
Ciclo #1 
Síntesis de segundo aDNc
hebra
5
3

3 5

Ciclo #2 Amplificación por PCR del
ADNc

Imprimación delantera
5
3 
3
5 

Imprimación inversa

Figura 1 RT-PCR en dos pasos

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 3

 Acerca de las sondas; Las sondas TaqMan MGB contienen:
• Un tinte reportero (FAM ™ tinte) vinculado al extremo 5' de la sonda
• Un aglutinante de ranura menor (MGB) en el extremo 3' de la sonda Esta
modificación aumenta la temperatura de fusión (T m) sin aumentar la longitud
de la sonda (Afonina et al., 1997; Kutiavín et al., 1997), que permite el diseño
de sondas más cortas.
• Un quencher no fluorescente (NFQ) en el extremo 3' de la sonda
Debido a que el quencher no emite fluorescencia, los sistemas de detección de
secuencia de Applied Biosystems pueden medir las contribuciones de
colorantes reporteros con mayor precisión.

Proceso de ensayo de
nucleasa de 5' El proceso de ensayo de nucleasa5' (Figuras 2 a 6)tiene lugar durante la
amplificación por PCR. Este proceso ocurre en cada ciclo y no interfiere con la
acumulación exponencial del producto.
= No fluorescente Extintor
NFQ MGB R
= Aglutinante de ranura menor
P
= Reportero
= ADN polimerasa de arranque en caliente

Figura 2 Leyenda para 5' figuras del proceso de ensayo de nucleasa

Durante la PCR, la sonda TaqMan MGB se recorre específicamente a una

secuencia complementaria entre los sitios de cebado hacia adelante y hacia atrás
(Figura3).
Cuando la sonda está intacta(Figuras 3 y 4), la proximidad del tinte reportero al
tinte quencher resulta en la supresión de la fluorescencia del reportero
principalmente por transferencia de energía tipo Förster (Förster, 1948;
Lakowicz, 1983).

Cartilla delantera

5 P
3 5
5 3
5 P
NFQ R
Imprimación inversa
MGB

Figura 3 Polimerización

4 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 Química Visión
general

Cartilla delantera

5 P
3 5
5 3

Introducción
5 P
NFQ
R Imprimación inversa
MGB

Figura 4 Desplazamiento de hebras

La ADN polimerasa escinde solo sondas que se hibridan al objetivo (Figura 5). La
escisión separa el tinte reportero del tinte quencher; la separación del tinte
reportero del tinte quencher da como resultado un aumento de la fluorescencia por
parte del reportero. El aumento de la señal de fluorescencia ocurre solo si la
secuencia objetivo es complementaria a la sonda y se amplifica durante la PCR.
Debido a estos requisitos, no se detecta la amplificación inespecífica.

Forward Primer
5 P
3 5
5 3
5 P
NFQ
Imprimación inversa
MGB
R

Figura 5 Escisión

La polimerización de la hebra continúa, pero debido a que el extremo 3 de la

sonda está bloqueado, no hay extensión de la sonda durante la PCR
(Figura_bookmark19 6).

Cartilla
delantera
5
3 5
5 3
5
Imprimación inversa
R
NFQ

MGB

Figura 6 Finalización de la polimerización

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 5

 Materiales y Equipos

Productos disponibles
Los ensayos de microARN de TaqMan están disponibles para una variedad de
especies. Para obtener la lista más reciente de ensayos, consulte el sitio web de
Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com
Cada ensayo consiste en:

• Un tubo de imprimación RT
• Un tubo de ensayo TaqMan (imprimación preformulada
forward/reverse y sonda MGB)
• Suficiente material para 150 reacciones de PCR en tiempo real (a un
volumen total de reacción de 20 L)
¡IMPORTANTE! Los ensayos de microARN de TaqMan están específicamente
optimizados para trabajar con la transcriptasa inversa de MuLV contenida en el kit
de transcripción inversa de microARN de TaqMan. Applied Biosystems no puede
garantizar el rendimiento del ensayo si utiliza otras enzimas de transcriptasa
inversa.
Además, Applied Biosystems recomienda que utilice TaqMan® 2✕ Universal PCR
Master Mix, No AmpErase® UNG con ensayos de microARN TaqMan.

Almacenamiento Almacene los ensayos de microARN de TaqMan a 15 a 25 C.

Materiales y equipos no
La Tabla 1 incluye equipos y materiales requeridos y opcionales para el
Incluido uso de ensayos de microARN de TaqMan. A menos que se indique lo contrario,
muchos de los artículos enumerados están disponibles en los principales
proveedores de laboratorios.

Cuadro 1 Materiales y equipos suministrados por el usuario

Materiales y Equipos Fuente

Obligatorio
TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kita Biosistemas aplicados
• 200 reacciones • 4366596 PN
• 1000 reacciones • 4366597 PN
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, Sin 4324018 PN de
Applied
AmpErase® UNGb
Biosystems

6 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

Materiales y Equipo

Cuadro 1 Materiales y equipo suministrados por los usuarios (continuación)

Materiales y Equipos Fuente

Materiales y equipos adicionales

Introducción
Applied Biosystems 7900HT Sistema rápido de PCR
en tiempo real Póngase en contacto
Applied Biosystems 7300/7500/7500 Sistema rápido de con su oficina local
PCR en tiempo real de ventas de Applied
Biosystems.
GeneAmp® termociclador PCR System 9700
ABI PRISM® placa de reacción óptica de 96 pozos con 4326659 PN de
código de barras (código 128) Applied
Biosystems
®
ABI PRISM placa de reacción óptica transparente de 4309849 PN de
384 pozos con código de barras (código 128) Applied
Biosystems
ABI PRISM ® Cubiertas adhesivas 4311971 PN de
ópticas (cantidad 100) Applied
Biosystems
Cubiertas adhesivas ópticas (cantidad 25) 4360954 PN de
Applied
Biosystems
®
ABI PRISM Tapas ópticas, 8 tapas/tira 4323032 de PN de
Applied
Biosystems
®
Herramienta de instalación de abi pRISM cap 4330015 PN de
Applied
Biosystems
Kit aplicador de sello adhesivo 4333183 PN de
Applied
Biosystems
™
MicroAmp películas adhesivas transparentes 4306311 PN de
Applied
Biosystems
Almohadillas de compresión óptica (cantidad 5) 4312639 de PN de
Applied
Biosystems
Tubos de reactivo de Applied Biosystems con tapas, 4305932 de PN de
10 ml Applied
Biosystems
Centrífuga con portaplazas Principal
proveedor de
laboratorio
(MLS)
Guantes desechables MLS
Microcentrífuga MLS
Puntas de pipeta, resistentes a aerosoles, sin nucleasas: MLS
rango de 1 a 20L, rango de 20 a 200-L, rango de
100 a

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 7

 Rango 1000-L
Pipetadores (desplazamiento positivo, desplazamiento MLS
de aire o multicanal): rango de 1 a 20 L, rango de
20 a 200- L, rango de 100 a 1000-L
Tubos de polipropileno MLS

8 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 Cuadro 1 Materiales y equipo suministrados por los usuarios (continuación)

Materiales y Equipos Fuente

Agua filtrada estéril sin RNasa MLS
Vórtice MLS
Microsoft Excel o software equivalente de hoja de Proveedores
®
de
cálculo y análisis software
a. Los ensayos de microARN de TaqMan están específicamente optimizados para
trabajar con la transcriptasa inversa de MuLV contenida en el kit de
transcripción inversa de microARN de TaqMan. Applied Biosystems no puede
garantizar el rendimiento del ensayo si utiliza otras enzimas de transcriptasa
inversa.
b. Applied Biosystems recomienda encarecidamente que utilice estos
reactivos de Applied Biosystems con los ensayos de microARN de
TaqMan.

Tabla 2 Documentos de Applied Biosystems

Documentos Número de pieza

TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit
®
4367038
Product Insert
Guía del usuario de Applied Biosystems 7900HT 4351684
Fast Real-Time PCR System and SDS Enterprise
Database
Applied Biosystems 7300/7500/7500 Guía rápida de 4347828
introducción a la instalación y mantenimiento del
sistema PCR en tiempo real
Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real- Time 4347825
PCR System Absolute Quantification Guía de
introducción
Guía de química de sistemas de PCR en tiempo real 4348358

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 9

 Prevención de la
Prevención de la contaminación contaminación

Los ensayos de PCR requieren prácticas especiales de laboratorio para evitar

amplificaciones de falsos positivos (Kwok y Higuchi, 1989). El alto rendimiento y
la repetición de estos ensayos pueden conducir a la amplificación de una sola
molécula de ADN (Saiki et al. , 1985; Mullis y Faloona, 1987).

Introducción
General PCR
Prácticas Prácticas generales de PCR para prevenir la contaminación:

• Mantenga áreas separadas, equipos dedicados y suministros para:

– Preparación de muestras
– Configuración de PCR
– Amplificación por PCR
– Análisis de productos de PCR
• No lleve productos de PCR amplificados al área de configuración de PCR.
• Use una bata de laboratorio limpia (que no se haya usado previamente
mientras manipula productos de PCR amplificados o que se use durante la
preparación de muestras) y guantes limpios cuando prepare muestras para
la amplificación de PCR.
• Cámbiese los guantes cada vez que sospeche que están
contaminados.
• Abra y cierre cuidadosamente todos los tubos de muestra y placas de
reacción. Trate de no salpicar o rociar muestras de PCR.
• Mantenga las reacciones y los componentes tapados tanto como sea
posible.
• Use puntas de pipeta de desplazamiento positivo o resistentes a aerosoles.
• Limpie los bancos y equipos de laboratorio periódicamente con una
solución de lejía al 10% recién diluida.

1 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 Resumen del procedimiento

Preparar ARN total o

Realizar transcripción inversa

65 minutos
Termociclador Instrumentos de PCR en tiempo
real

Crear y configurar un software SDS

de documento de placa

15 minutos
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AB C D E F G

Preparar la placa de reacción de

Placa óptica de Placa óptica de
PCR
ciclo térmico de 96 ciclo térmico de 384
pozos pozos

15 minutos

Ejecute la placa de reacción de

PCR Biosistemas aplicados
7900HT Rápido / 7300 / 7500 /
7500 Rápido Sistema de PCR en
90 minutos Tiempo Real

Analizar
resultados (2
min)

10 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

Sección 2 Uso de ensayos individuales

Transcripción inversa

Descripción general Sintetizar ADNc monocatenario a partir de muestras totales de ARN

utilizando el kitde transcripción inversa de microARN de ® TaqMan. El proceso
implica los siguientes procedimientos:

1. Preparación de la mezcla maestra rt

2. Preparación de la placa de reacción RT
3. Realización de transcripción inversa
¡IMPORTANTE! Los ensayos de microARN de TaqMan están específicamente
optimizados para trabajar con la transcriptasa inversa de MuLV contenida en el kit
de transcripción inversa de microARN de TaqMan. Applied Biosystems no puede
garantizar el rendimiento del ensayo si utiliza otras enzimas de transcriptasa
inversa.

Plantilla de ARN
Directrices Para el rendimiento óptimo del kit de transcripción inversa de microARN
de TaqMan y de los ensayos de microARN de TaqMan, Applied Biosystems
recomienda utilizar ARN con las siguientes características:

• Libre de inhibidores de transcripción inversa y PCR

• Disuelto en búfer compatible con PCR
• Libre de actividad RNasa
• No desnaturalecido

Uso de ensayos
individuales
Cantidad de ¡IMPORTANTE! No desnaturalizar el ARN. La desnaturalización del
entrada por reacción de ARN puede reducir el rendimiento del ADNc para algunos objetivos
ARN total de miARN.

Utilice de 1 a 10 ng de ARN total por reacción rt de 15- L.

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 11

 Preparación del RT
Reaction Master Prepare la mezcla maestra rt utilizando los componentes del kit de
transcripción inversa de MICROARN TaqMan antes de preparar la
Mezclar reacción.

PELIGROQUÍMICO. 10✕ RT Buffer puede causar

irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Lea el MSDS y siga las
instrucciones de manejo. Use gafas protectoras, ropa y guantes apropiados.
Para preparar la mezcla maestra rt:

1. Permita que los componentes del kit se descongelen en el hielo.

2. En un tubo de polipropileno, prepare la mezcla maestra rt escalando los

volúmenes que se enumeran a continuación al número deseado de
reacciones RT. Applied Biosystems recomienda agregar entre un 10 y
un 20% de exceso para tener en cuenta las pérdidas de pipeteo.
¡IMPORTANTE! Este procedimiento supone que está
cuantificando miRNA a partir de una sola muestra total de
ARN.

Volumen de
Componente mezcla maestra/
15-L Reacción
a
DNTP 100 metros (con dTTP) 0.15
MultiScribe™ Transcriptasa Inversa, 1.00
50 U/L
10✕ Búfer de transcripción inversa 1.50
Inhibidor de la RNasa, 20U/L 0.19
Agua libre de nucleasas 4.16
un. Cada
Total reacción RT de 15-L consta de 7 L demezcla
7.00 maestra, 3
L de imprimación y 5 L de muestrade ARN.

3. Mezclar suavemente. Centrífuga para llevar la solución a la parte

inferior del tubo.

4. Coloque la mezcla maestra RT sobre hielo hasta que

prepare la reacción de microARN.

12 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

Transcripción inversa

Preparando el RT
Para preparar la reacción RT:
Reacción
1. Para cada reacción RT de 15-L combinar la mezcla
maestra de RT (del paso 2 en la página 12) con el
ARN total en la proporción de:
7 L RT maestro
mezclar un
5 L de ARN total
Por ejemplo, combinar 7.7 L de mezcla maestra RT
con 5.5 L de ARN total. Recuerde incluir la misma
proporción de exceso de volumen de ARN total que para la
mezcla maestra Rt. En este ejemplo, se incluyó Uno
exceso de volumen del 10% tanto para la mezcla maestra
de RT como para el ARN total.
Nota: Applied Biosystems recomienda utilizar de 1 a 10
de la ARN total por reacción.
2. Mezclar suavemente. Centrifugadora para llevar la
solución al fondo del tubo.
¡IMPORTANTE! No exceda las 2000 RPM o 5 minutos al
centrifugar.

3. Antes de abrir los tubos RT Primer, descongele los

tubos en hielo y mezcle mediante vórtice, luego
centrífucelos.
4. Para cada reacción RT de 15-L dispensar 12.0 L de
mezcla maestra Rt que contenga ARN total (desde el paso

Uso de ensayos
1 en la página 13)en un tubo de reacción de polipropileno

individuales
de 0.2 Ml. (Este eso el tubo de reacción RT.)
Nota: Alternativamente puede despedir en único pozo
de una placa de reacción de 96 pozos.

5. Transfiera 3 L de imprimación RT (tubo etiquetado

rt primer) de cada conjunto de ensayo al tubo de reacción
RT correspondiente o al pozo de plato.

6. Éste el tubo y mezcle suavemente. Centrífuga para llevar

la solución un la parte inferior del tubo.

7. Incuba el tubo en hielo durante 5 minutos y mantenlo

en hielo hasta que estés listo para cargar el

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 13

 Realizar Marcha atrás
Transcripción Para realizar la transcripción inversa:

1. Dejando el termociclador en el modo de emulación 9600

(predeterminado), utilice los siguientes valores de parámetro
para programar el termociclador:
Tiem Temperatura
Tipo de ( C)
po
paso (min)
SOSTENE 30 16
R
SOSTENE 30 42
R
SOSTENE 5 85
R
SOSTENE  4
R

2. Ajuste el volumen de reacción un 15.0 L.

3. Cargue el tubo o la plato de reacción en el termociclador.

4. Inicie la ejecución de transcipción inversa.

Amplificación por PCR

Durante la etapa de amplificación del objetivo, la ADN polimerasa AmpliTaq®

Gold amplifica el ADNc objetivo sintetizado a partir de la muestra de ARN,
utilizando cebadores específicos de la secuencia de las placas de ensayo
TaqMan.
¡IMPORTANTE! Debe realizar el paso de PCR en un sistema de PCR en
tiempo real. Los termocicladores tradicionales no se pueden utilizar porque no
pueden detectar y registrar las señales fluorescentes generadas por la escisión de
las sondas TaqMan.

Proceso dePCR Realizar el paso de PCR requiere los siguientes procedimientos:

1. Preparación de la placa de reacción

2. Configuración del documento de placa
3. Correr el plato

14 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 PCR Amplificación

Reactivo
Preparación Seguir estas pautas garantiza un rendimiento óptimo de la PCR:
Directrices
• Mantenga todos los ensayos de microARN de TaqMan protegidos de la
luz, en el congelador, hasta que esté listo para usarlos. La exposición
excesiva a la luz puede afectar a las sondas fluorescentes.
• Antes de su uso, mezcle bien el TaqMan Universal PCR Master
Mix girando la botella.
Componentes de • Prepare la mezcla de reacción de PCR antes de transferirla a la placa de
reacción de PCR reacción para el ciclo térmico y el análisis de fluorescencia.

Applied Biosystems recomienda realizar cuatro réplicas de PCR por reacción rt. El
volumen de reacción recomendado es de 20 L. Prepare la placa de modo que
cada reacción de PCR contenga los componentes enumerados en la siguiente
tabla.

PELIGROQUÍMICO. TaqMan 2✕
Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG puede causar irritación de los
ojos y la piel. La exposición puede causar molestias si se ingiere o inhala. Lea el
MSDS y siga las instrucciones de manejo. Use gafas protectoras, ropa y
guantes apropiados.

Volumen
Componente (L) / 20-L
Reacción
Ensayo de microARN TaqMan (20✕) 1.00

Producto de la reacción RT (Dilución mínima 1:15) 1.33

TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase 10.00

UNGa

Uso de ensayos
individuales
Agua libre de nucleasas 7.67

Volumen total 20

a. Para un rendimiento óptimo de los ensayos de microARN de TaqMan,

Applied Biosystems recomienda encarecidamente que utilice Applied
Biosystems TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase
UNG.

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 15

 Preparación de la
reacción de PCR Applied Biosystems recomienda realizar cuatro réplicas de cada reacción de
20-L.
Plato
¡IMPORTANTE! En el siguiente procedimiento se supone que está probando un
ensayo individual.

PELIGROQUÍMICO. TaqMan 2✕
Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG puede causar irritación de los
ojos y la piel. La exposición puede causar molestias si se ingiere o inhala. Lea el
MSDS y siga las instrucciones de manejo. Use gafas protectoras, ropa y
guantes apropiados.

Para preparar el PCR reacción:

1. Escale los volúmenes enumerados a continuación al número

apropiado de reacciones RT. Applied Biosystems recomienda incluir
cuatro réplicas por reacción RT. Prepárate sobre hielo.

Volumen de mezcla
Reactivo maestra para una
reacción de 20-L
TaqMan 2✕ Mezcla maestra de PCR 10.00
universal sin AmpErase JOVEN
Agua libre de nucleasas 7.67

Volumen total 17.67

2. Mezclar suavemente. Centrífuga para llevar la solución a la parte

inferior del tubo.

3. Agregue 17.67 L de la mezcla maestra de PCR/mezcla de agua

por reacción de PCR de 20-L en un tubo de polipropileno (el
tubo de reacción de PCR), como se muestra en el siguiente
ejemplo.

Volumen para una

Ejemplo: Volumen para 4 réplicaUno
reacción de 20-
L
17.67 17,67 L x 4 réplicas = 70,68 L +
a. El cálculo incluye un volumen adicional del 12,5%
8.8 L exceso paraL
= 79.48 tener en
cuenta las pérdidas por pipeteo. Mantenga este volumen adicional
proporcional con el volumen adicional en los siguientes dos pasos.

16 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 PCR Amplificación

Para preparar el PCR reacción: (continuación)

4. Transfiera 1.0 L de 20✕ mezcla de ensayo de microARN TaqMan

(etiquetada en tiempo real) al tubo de reacción de PCR, como se
muestra en el siguiente ejemplo.

Volumen para una

Ejemplo: Volumen para 4 réplicaUno
reacción de 20-
L
1.0 1.0 L x 4 réplicas = 4 L + 0.5
L exceso
a. El cálculo incluye un volumen adicional del 12,5%
= 4.5
paraL
tener en
cuenta las pérdidas por pipeteo.

5. Transfiera 1.33 L del producto RT del tubo de reacción RT al tubo

de reacción PCR, como se muestra en el siguiente ejemplo.

Volumen para una Ejemplo: Volumen para

reacción de 20- 4 réplicaUno
L
a. El cálculo 1.33
incluye un volumen1.33
adicional
L x del 12,5% para
4 réplicas tenerL
= 5.32 en
cuenta las pérdidas por pipeteo. + 0.68 Lexceso = 6.0 L

6. Mezclar suavemente. Centrífuga para llevar la solución al fondo de

la placa.

Uso de ensayos
7. Prepare la placa de reacción de PCR dispensando 20 L de la

individuales
mezcla maestra de PCR completa (incluido el producto de
imprimación y RT) en cada uno de los cuatro pozos.

8. Selle la placa con una cubierta adhesiva óptica, luego centrífuga la

placa brevemente para hacer girar el contenido y eliminar cualquier
burbuja de aire.

Ajuste Hacia
arriba el Plato Consulte la guía del usuario del instrumento correspondiente para obtener
Documento instrucciones sobre cómo configurar el documento de placa.

• Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and SDS

Enterprise Database User Guide (PN 4351684)

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 17

 • Applied Biosystems 7300/7500/7500 Guía de introducción a la
cuantificación absoluta del sistema de PCR en tiempo real rápido
(PN 4347825)
Cuando Crear plato Documentos uso el siguiente Parámetros:

Parámetro Valor

Modo de ejecución Emulación 9600 (predeterminada)

Volumen de muestra 20 L

Parámetros de
ciclo térmico Amplifica
Taq Oro®
PCR
activación
Paso enzimática
SOSTENE CICLO (40 ciclos)
R
Desnatural Anneal/
izar Extende
r
Hora 10 15 60
minutos segundos segundos
Temp 95 95 60
eratur
Configuración Acepte los valores predeterminados. (El valor
de incremento predeterminado es 0.)
automático
Configuraci Acepte los valores predeterminados. (El valor
ón de la tasa predeterminado es Estándar).
de rampa
Recogida de datos Acepte los valores predeterminados. (El valor
predeterminado es 60 C.)

Ejecución de la placa Consulte los siguientes documentos para obtener instrucciones detalladas
sobre la carga y el funcionamiento de las placas PCR:

• Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and SDS

Enterprise Database User Guide (PN 4351684)

18 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 PCR Amplificación

• Applied Biosystems 7300/7500/7500 Guía de introducción a la

cuantificación absoluta del sistema de PCR en tiempo real rápido
(PN 4347825)

Para ejecutar la placa:

1. En el software SDS, abra el documento de placa que

corresponde a la placa de reacción.

2. Cargue la placa de reacción en el instrumento.

3. Inicie la ejecución.

Uso de ensayos
individuales

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 19

20 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo
Sección 3 Análisis de datos

Consulte la guía del usuario del instrumento correspondiente para obtener

instrucciones sobre cómo analizar sus datos.

Procesogeneral El proceso general para analizar los datos de los ensayos de expresión
génica implica los siguientes procedimientos:

1. Ver los gráficos de amplificación.

2. Establezca los valores de línea base y umbral.

Herramient Normalización de ensayos con controles endógenos TaqMan®

as para
analizar Utilizando el método comparativo CT, puede utilizar controles endógenos
TaqMan
normalizar los niveles de expresión de los genes diana corrigiendo
MicroARN Ensayo
diferencias en la cantidad de ADNc cargado en reacciones de PCR.
Resultados
Para normalizar las muestras de ARN total humano, se debe seleccionar un
control endógeno apropiado expresado constitutivamente. Las transcripciones
comunes de control de ARNm están disponibles como TaqMan ® Controles
endógenos, pero deben validarse para las muestras individuales del investigador.
Puede obtenerse más información acerca de los controles endógenos de
TaqMan en el sitio web de Applied Biosystems.

Análisis de datos

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 21

 Recursos para el
análisis de datos Consulte los siguientes documentos para obtener más información
sobre el análisis de sus datos:

• Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and SDS

Enterprise Database User Guide (PN 4351684)
• Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR Systems
Absolute Quantification Guía de introducción (PN 4347825)
• Livak y Schmittgen, 2001 – Proporciona la derivación, suposiciones y
aplicaciones delmétodo 2CT y variaciones para analizar los cambios
relativos en la expresión génica a partir de experimentos de PCR
cuantitativa en tiempo real.
• Guía de química de sistemas de PCR en tiempo real (Capítulo
3) (PN 4348358)

22 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo

 Sección 3 Análisis de datos
Bibliografía

Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I. , et al. 1997. Cebado eficiente de PCR
con oligonucleótidos cortos conjugados a un aglutinante de ranura menor. Ácidos
nucleicos Res. 25:2657–2660.
Bartel, D. P. 2004. MicroRNAs: Genómica, Biogénesis, Mecanismo y Función.
Celda 116:281-287.
Förster, V. T. 1948. Migración de energía intermolecular y fluorescencia. Anales de
Física (Leipzig) 2:55–75.
Kim., J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G.D., Kosik, K.S., Church, G.M., y
Gary Ruvkun. 2004. Identificación de muchos microARN que copurifican con
poliribosomas en neuronas de mamíferos. PNAS 101:360—365.
Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., y Meyer, R.B. 1997.
Oligonucleótidos con dihidropiroindole tripéptidos conjugados: composición de
la base y efectos de la columna vertebral sobre la hibridación. Ácidos nucleicos
Res. 25:3718–3723.

Kwok, S. y Higuchi, R. 1989. Evitar falsos positivos con PCR.

Naturaleza 339:237–238.
Lakowicz, J.R. 1983. Transferencia de energía. En Principles of Fluorescence
Spectroscopy, Nueva York: Plenum Press 303–339.
Lim, L.P., Lau, N.C., Weinstein, E.G., Abdelhakim, A., Yekta, S., Rhoades, M.W.,
Burge, C.B., y David P. Bartel. 2003. Los microARN de Caenorhabditis
elegans. Genes & Dev. 17: 991–1008.
Livak, K.J. y Schmittgen, T.D. 2001. Análisis de datos relativos de
expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real y elmétodo
2CT. Métodos 25:402–408.
Longo, M.C., Berninger, M.S., y Hartley, J.L. 1990. Uso de uracilo ADN
glicosilasa para controlar la contaminación por carry-over en reacciones en
cadena de la polimerasa. Gen 93:125–128.
Mullis, K.B. y Faloona, F.A. 1987. Síntesis específica de ADN in vitro a
través de una reacción en cadena catalizada por polimerasa. Métodos
Enzymol. 155:335–350.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Amplificación enzimática de
secuencias genómicas -globina y análisis del sitio de restricción para el
diagnóstico de anemia de células falciformes. Ciencia 230:1350–1354.
Análisis de datos

TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo 23

24 TaqMan MicroARN Ensayos Protocolo
Ventas y soporte en todo el mundo

La vasta red de distribución y

servicio de Applied Biosystems,
compuesta por personal de soporte
y aplicaciones altamente
capacitado, llega a 150 países
en seis continentes.
Para ubicaciones de oficinas de
ventas y soporte técnico, llame
a nuestra oficina local o consulte
nuestro
Sitio web en www.appliedbiosystems.com.

Applera se compromete a
proporcionar la tecnología y la
información líderes en el mundo
para los científicos de la vida.
Applera Corporation está
formada por los negocios de
Applied Biosystems y Celera
Genomics.

Sede
850 Lincoln Centre
Drive Foster City,
CA 94404 USA
Teléfono: +1
650.638.5800
Línea gratuita (en América del
Norte): +1 800.345.5224 Fax: +1
650.638.5884

01/2006
www.appliedbiosystems.com Número de 4364031 Rev. B