GUIÓN DE PRÁCTICAS

BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA

Grado en Biotecnología

Dpto. Bioquímica y Biología Molecular y Celular

Laboratorio 2

Profesora: Patricia Meade (pmeade@unizar.es)

INTRODUCCIÓN
La biotecnología microbiana se define como como el conjunto de técnicas y
procedimientos que utilizan microorganismos vivos o sus partes para producir una amplia
variedad de productos. Desde tiempos remotos, el hombre ha utilizado la capacidad
fermentativa de ciertos microorganismos para producir alimentos como el pan, el vino, la
cerveza, el queso o el yogurt.
La introducción de la técnica de DNA recombinante en la segunda mitad del siglo XX dio
origen a lo que hoy conocemos como biotecnología moderna. El uso de la ingeniería
genética, por medio de la cual el hombre fue capaz de transferir genes de interés de un
microorganismo a otro y expresar de manera eficiente fenotipos deseados, incluyendo
macromoléculas de gran relevancia biomédica o industrial, marcó un hito en la historia de
la biotecnología.
En esta práctica trataremos dos temas de interés en el campo de la Biotecnología
Microbiana moderna. En primer lugar, abordaremos el uso de Escherichia coli como
biofábrica para la producción de proteínas recombinantes de interés biotecnológico. En
segundo lugar, analizaremos la composición y eficacia de productos de uso sanitario
(sistemas comerciales de limpieza de lentillas) que contienen algún componente producido
gracias a la biotecnología.
En la práctica de laboratorio los alumnos desarrollarán un pequeño proyecto de
investigación en el que se abordarán dos objetivos independientes:
1. Expresión recombinante y análisis de Western blot de la flavodoxina de Anabaena sp.
PCC 7120 en Escherichia coli
2. Análisis de la composición y efecto antimicrobiano de sistemas comerciales de limpieza
de lentillas

La flavodoxina (Fld) de Anabaena sp. es una pequeña proteína redox soluble de unos 20
kDa aprox. Bajo condiciones de estrés férrico, las cianobacterias y ciertas algas
eucarióticas sustituyen la ferredoxina (Fd) por Fld en la cadena transportadora de
electrones fotosintética. Mientras la Fd contiene un grupo sulfoférrico [2Fe-2S] como
centro redox activo, la Fld intercambia electrones a través de un grupo flavin
mononucleótido (FMN) que no contiene iones Fe. De esta forma, el microorganismo es
capaz de continuar con sus funciones metabólicas esenciales disminuyendo al mismo
tiempo el consumo de hierro por la célula.
Tanto la Fd como la Fld participan en la cadena de transporte fotosintética transfiriendo
electrones desde el fotosistema I a la enzima ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR), la cual
cataliza la formación de poder reductor mediante la reducción del NADP+ (Figura 1).
La flavodoxina de cianobacterias es una proteína de gran interés biotecnológico. Su
expresión recombinante en plantas incrementa la tolerancia de los cultivos a diferentes
estreses ambientales como la radiación ultravioleta, las altas intensidades de luz, las
temperaturas extremas, la desecación o la acción de herbicidas. Asimismo, la flavodoxina
de algunas bacterias patógenas como Helicobacter pylori es considerada en la actualidad
como una prometedora diana terapéutica para el desarrollo de nuevos fármacos
antimicrobianos.

1
 Fd/Fld

© 2012 Pearson Education, Inc.

Figura 1. Papel de la ferredoxina y flavodoxina en la cadena de transporte

electrónico fotosintética

En esta práctica se sobreexpresará la flavodoxina de Anabaena sp. PCC 7120 empleando

el sistema de expresión E. coli DH5α / pTrc99a. En este sistema de expresión, el
hospedador es la cepa DH5α de E. coli y el vector de expresión un plásmido comercial,
pTrc99a, inducible por IPTG (Figura 2A).
Este vector de expresión cuenta con un promotor fuerte e inducible (Ptrc), cuya actividad
se encuentra regulada negativamente por el represor transcripcional LacI. En ausencia de
lactosa en el medio de cultivo, el promotor Ptrc se encuentra reprimido por LacI y la
expresión del gen de interés es baja o nula. La incorporación de isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG), un análogo no hidrolizable de la lactosa, inactiva al represor
y permite la transcripción controlada del gen de interés. A diferencia de los promotores T7,
los cuales requieren el uso de cepas hospedadoras conteniendo el gen de la T7 RNA
polimerasa (Ej: BL21(DE3)), el promotor Ptrc será reconocido eficientemente por la RNA
polimerasa de cualquier cepa de E. coli, incluso DH5α, una cepa comúnmente usada en el
laboratorio de biología molecular para trabajos de clonaje y amplificación de vectores
plasmídicos. El sistema E. coli DH5α / pTrc99a es capaz de producir grandes cantidades
de proteína recombinante con tan solo 2 horas de inducción con IPTG.
Previo a la práctica, el gen de la flavodoxina (isiB) de Anabaena sp. ha sido clonado en el
vector pTrc99a en los sitios de restricción NcoI y HindIII (Figura 2B).

2
 A

Figura 2. Vector de expresión pTrc99a. A: Estructura del vector indicando sus

elementos esenciales. B: Clonaje del gen isiB (flavodoxina) entre los sitios NcoI y HindIII

3
Como segundo objetivo de la práctica se analizará la composición y el efecto
antimicrobiano de dos sistemas comerciales de limpieza de lentillas fabricados por la
empresa Avizor: el sistema EverClean, cuyo principio activo es el peróxido de hidrógeno, y
el sistema Solución Única, cuyo principio activo es el antiséptico polihexanida (Figura 3).

Figura 3. Sistemas comerciales de limpieza de lentillas

evaluados en esta práctica

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Sesión 1 Sesión 2 Sesión 3

-Sobreexpresión de la proteína -SDS-PAGE -Incubación con anticuerpos

-Preparación geles SDS-PAGE
-Recogida muestras SDS-PAGE
-Inóculos de E. coli
-Tinción/transferencia geles
-Efecto antimicrobiano del
líquido lentillas
-Bloqueo membrana
-Interpretación resultados placas
-Concentración de H2O2
-Actividad catalasa
-Revelado Western Blot

La práctica se desarrollará en tres sesiones consecutivas de aproximadamente 4 horas.

Los estudiantes se distribuirán por parejas, ya que la mayoría de los procedimientos se
ejecutarán por parejas, para la realización de algunas técnicas se formarán grupos
mayores.
Los resultados de cada experimento serán recogidos minuciosamente y al finalizar las
sesiones de prácticas cada estudiante deberá entregar un informe escrito individual con
sus resultados y la discusión de los mismos. La fecha de entrega del informe será
informada por el profesor durante la práctica.
Las técnicas y procedimientos que se desarrollarán en cada sesión de prácticas se
describen a continuación:

4
Sesión 1 (primer día de prácticas)
Objetivo 1: Expresión recombinante y análisis de Western blot de la flavodoxina de
Anabaena sp. PCC 7120 en Escherichia coli
• Cultivo de E. coli DH5α conteniendo el vector pTrc99A con el gen de la flavodoxina
(isiB) de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120
• Inducción de la expresión de la flavodoxina recombinante
• Toma de muestras del proceso de expresión recombinante
• Preparación de geles de poliacrilamida con SDS
Objetivo 2: Análisis de la composición y efecto antimicrobiano de sistemas comerciales de
limpieza de lentillas
• Preparación de inóculos de E. coli para valorar el efecto de dos líquidos de lentillas
(suministrados por el profesor)

Sesión 2 (segundo día de prácticas)

Objetivo 1: Expresión recombinante y análisis de Western blot de la flavodoxina de
Anabaena sp. PCC 7120 en Escherichia coli
• Obtención de extractos crudos de proteínas solubles de E. coli recombinante
• Separación de proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
(SDS-PAGE)
• Identificación de la proteína recombinante (flavodoxina) mediante tinción con azul de
Coomassie
• Transferencia de proteínas a membrana de PVDF
• Bloqueo de la membrana
Objetivo 2: Análisis de la composición y efecto antimicrobiano de sistemas comerciales de
limpieza de lentillas
• Ensayo de evaluación de efecto antimicrobiano de dos líquidos de lentillas sobre
diferentes concentraciones de E. coli

Sesión 3 (tercer día de prácticas)

Objetivo 1: Expresión recombinante y análisis de Western blot de la flavodoxina de
Anabaena sp. PCC 7120 en Escherichia coli
• Inmunodetección de la flavodoxina recombinante expresada en E. coli
Objetivo 2: Análisis de la composición y efecto antimicrobiano de sistemas comerciales de
limpieza de lentillas
• Valoración y comparación del efecto inhibitorio de dos líquidos de lentillas sobre el
crecimiento de E. coli
• Análisis de la composición de un sistema comercial para limpieza de lentillas.
Determinación de la concentración de peróxido de hidrógeno y de la actividad
catalasa.
• Análisis espectroscópico de los componentes de un sistema comercial para limpieza
de lentillas (pastilla neutralizadora).

5
EVALUACIÓN
La calificación final de las prácticas reflejará la preparación previa del estudiante para la
práctica, la asistencia, la puntualidad, el desempeño y la participación del estudiante
durante las sesiones de prácticas, así como el grado de análisis y aplicación de los
conocimientos obtenidos durante las sesiones de prácticas. Para valorar estos criterios, la
calificación final se obtendrá de la siguiente forma:
Asistencia, puntualidad y desempeño en el laboratorio: 50%
Informe final individual: 30%
Cuestionario en ADD previo a la práctica: 10%
Cuestionario en ADD final: 10%

a. Los cuestionarios en ADD

Antes de la primera sesión de prácticas de cada grupo y al finalizar la última, los
estudiantes deberán cumplimentar un pequeño cuestionario evaluativo que estará
disponible en el ADD de la asignatura. Los cuestionarios se cumplimentarán de manera no
presencial e individual. Los cuestionarios contendrán preguntas de tipo Verdadero/Falso,
de opción múltiple o de selección de las palabras que faltan. El estudiante dispondrá de 10
minutos para responder el cuestionario, trascurridos los 10 minutos el cuestionario se
cerrará y no será posible su modificación. La evaluación del cuestionario será suministrada
al estudiante de forma automática a través del ADD. Estos cuestionarios serán fácilmente
cumplimentados si el estudiante estudia los contenidos (Guion de Prácticas y Materiales
de Estudio Previo) que estarán disponibles en el ADD con suficiente tiempo de antelación
a la práctica y si el estudiante se mantiene atento a las explicaciones aportadas por el
profesor y a las discusiones conjuntas durante las sesiones de prácticas.
El primer cuestionario (previo a las prácticas) abarcará los temas que el estudiante deberá
conocer de forma previa a su participación en las prácticas de laboratorio, con el fin de
lograr una mejor comprensión y aprovechamiento de las sesiones de prácticas. Para
cumplimentar este cuestionario previo, el estudiante deberá repasar de forma no
presencial los aspectos teóricos reflejados en este Guion de Prácticas y en cualquier otro
material didáctico que el profesor ponga a su disposición en el ADD. El material de estudio
previo a la práctica estará disponible en el ADD al menos una semana antes del inicio de
la primera sesión de prácticas de cada grupo. Una vez que el estudiante repase el material
suministrado por el profesor, podrá cumplimentar el cuestionario previo a la práctica de
forma individual y no presencial (fuera de clase). Los cuestionarios estarán disponibles dos
días antes de la primera sesión de prácticas de cada grupo de laboratorio. Las dudas
sobre las preguntas del cuestionario previo serán analizadas junto a los profesores durante
la primera sesión de prácticas.
Tras finalizar la última sesión de prácticas, los profesores pondrán a disposición de los
estudiantes un nuevo cuestionario que estará disponible una semana después de
terminada la práctica. En este cuestionario se incluirán aspectos del conocimiento teórico-
práctico adquirido durante las sesiones de prácticas.

b. Informe final
Cada estudiante deberá elaborar y entregar un informe final escrito donde se detallen los
resultados obtenidos en cada experimento de la práctica y se discutan estos resultados. La
discusión de los resultados deberá reflejar si los mismos eran esperados o no, analizar
cualquier variación de los resultados individuales respecto a los resultados esperados,
indicar cualquier error experimental o cambio en el protocolo inicialmente propuesto y
argumentar sobre las posibles implicaciones de estos cambios o errores en el resultado
obtenido. Se incluirán en el informe las fotos, esquemas, cálculos, diagramas, gráficas,
etc. que el estudiante estime necesario para reflejar y discutir sus resultados. Más que el
resultado en sí, se evaluará la entrega a tiempo del informe, la calidad en la escritura y, en

6
especial, la profundidad en la discusión de los resultados obtenidos. La extensión del
informe final no puede exceder de 10 páginas. La fecha de entrega de los informes para
cada grupo será definida e indicada por el profesor durante la práctica.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

En el laboratorio será de obligado cumplimiento algunas normas de bioseguridad que se
detallan a continuación:
1. Seguir con atención las indicaciones del profesor antes de manipular cualquier
instrumento, sustancia biológica, tampón o reactivo.
2. Solicitar inmediatamente la ayuda del profesor ante cualquier incidencia.
3. Uso obligado de bata de laboratorio en todo momento.
4. No fumar, comer o beber dentro del laboratorio.
5. El uso de móviles sin autorización expresa del profesor está prohibido. Los móviles
deberán permanecer en modo silencio durante toda la práctica.
6. Las heridas y lesiones en la piel deberán estar debidamente cubiertas.
7. Se deberán usar guantes, gafas y otros medios de protección durante la manipulación
de determinadas sustancias químicas que pueden ser tóxicas e irritantes al contacto con la
piel y los ojos.
8. Extremar las precauciones durante el uso de mecheros de alcohol. Se recomienda
recogerse el pelo.
9. Extremar las precauciones durante la manipulación de equipos de alto voltaje
(electroforesis, electrotransferencia).
10. No ingerir, oler, ni mantener contacto directo de la piel o mucosas con los
microorganismos, sustancias biológicas o sustancias químicas empleadas en el
laboratorio.
11. Está absolutamente prohibido pipetear cualquier sustancia con la boca.
12. Mantener los objetos personales alejados de las zonas de trabajo.
13. Desechar los materiales contaminados apropiadamente.
14. Lavarse las manos cuidadosamente antes de abandonar el laboratorio.

MARCHA EXPERIMENTAL
Durante las sesiones de prácticas, los estudiantes trabajarán por parejas. A cada pareja se
le asignará el material de laboratorio que necesitará durante cada sesión de prácticas.
Es responsabilidad de cada estudiante comprobar la disponibilidad de los materiales al
principio de la práctica y asegurarse de recoger y limpiar su puesto de trabajo una vez
concluida cada sesión.
Los estudiantes ejecutarán con sus propias manos las técnicas y procedimientos descritos,
con la ayuda del profesor y siguiendo las indicaciones descritas en este Guion de
Prácticas. Es responsabilidad de cada estudiante imprimirlo y acudir a cada una de las
sesiones de práctica con el Guion de Prácticas.

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1. SESIÓN 1 (primer día)
1a) Sobreexpresión de flavodoxina recombinante en E. coli y toma de muestras para
SDS-PAGE
En la primera sesión de prácticas se realizarán los primeros experimentos encaminados a
cumplimentar el primer objetivo de la práctica: Expresión recombinante y análisis de
Western blot de la flavodoxina de Anabaena sp. PCC 7120 en Escherichia coli
Previo a la práctica, el gen de la flavodoxina (isiB) de Anabaena sp. ha sido clonado en el
vector pTrc99a. El vector recombinante fue transformado en células de E. coli DH5α
competentes mediante shock térmico a 42ºC. A partir de una colonia de E. coli DH5α
conteniendo el vector pTrc99A-isiA se sembró un precultivo de 10 ml en medio Luria-
Bertani (LB) + 50 µg/ml Ampicilina y se incubó toda la noche (O/N) a 37ºC con agitación
vigorosa (200-250 rpm) empleando un incubador orbital.
Partiendo de este precultivo O/N de E. coli DH5α / pTrc99A-isiA, por parejas se inducirá la
expresión de la proteína de la siguiente manera:
1. Sembrar un nuevo precultivo de E. coli DH5α / pTrc99A-isiA (por duplicado) en medio
LB + 50 µg/ml Ampicilina, empleando como inóculo 200 µL del precultivo crecido O/N.
Incubar ambas réplicas del precultivo a 37ºC y agitación vigorosa (200-250 rpm)
empleando un incubador orbital, hasta alcanzar la fase exponencial del crecimiento
(D.O.600 = 0,6-0,8).
2. Añadir a una de las réplicas isopropil-ß-D tiogalactósido (IPTG) a concentración final 1
mM (stock 1M). A la otra réplica del cultivo no se adicionará IPTG y se tomará como
control no inducido. Incubar ambos cultivos durante 1-2 horas, a 37º con agitación vigorosa
(200-250 rpm) empleando un incubador orbital.
3. Transcurrido el tiempo de inducción, tomar muestras de 1 mL de cada precultivo
(inducido y no inducido) e identificar bien cada muestra. Centrifugar las muestras a 14.000
rpm durante 2 minutos. Desechar el sobrenadante y conservar el pellet a -20ºC hasta su
análisis.

1b) Preparación de los geles de acrilamida para SDS-PAGE

El grupo completo de esta sesión de prácticas se dividirá en dos subgrupos. Cada uno de
los 2 subgrupos preparará dos geles de poliacrilamida al 15%, uno de los geles se
empleará para teñir con azul de Coomassie y visualizar las proteínas; el otro gel se
empleará para electrotransferir las proteínas hacia una membrana de PVDF y realizar un
Western blot.
Para la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) se empleará el
sistema MiniProtean de la empresa BioRad. Este sistema está constituido por una cámara
vertical de electroforesis con capacidad para dos geles, un soporte plástico para
confeccionar los geles, cristales, peines y accesorios para aplicar las muestras (Figura 4).
Siguiendo atentamente las indicaciones del profesor, los geles se prepararán de la
siguiente manera:
1. Lavar los cristales con agua y detergente. Aclarar con abundante agua del grifo y agua
destilada. Aplicar etanol 70% y secar cuidadosamente empleando papel para secar las
manos.
2. Montar los cristales con la ayuda del soporte plástico para confeccionar los geles.
Observar las indicaciones del profesor.

8
 Soporte para
confeccionar geles
Cámara electroforesis

Accesorios de
aplicación

Peines

Cristales

Figura 4. Sistema MiniProtean para electroforesis de BioRad

3. Preparar la mezcla del gel separador al 15% de acrilamida/bisacrilamida. Utilizar

guantes y manipular cuidadosamente los reactivos químicos. Emplear pipetas automáticas
para las cantidades pequeñas y pipetas serológicas para cantidades mayores a 3 mL.
Nunca pipetear con la boca.
Mezclar los siguientes reactivos en un vaso de precipitado limpio, agregar cada uno en el
orden que se indica.
Antes y después de adicionar APS y TEMED se debe homogenizar la mezcla agitando el
frasco cuidadosamente. Añadir el TEMED justo antes de verter el gel en los cristales.

Gel separador:
Agua destilada………………………….…..2,8 mL
Tris/HCl 1,5 M pH=8,8………………….…….3 mL
bisacrilamida/acrilamida (0,8/30%)…….…...6 mL
SDS 20%.....................................................60 µL
APS 10%...................................................100 µL
TEMED……………….………………………...5 µL

Una vez preparada y homogenizada, verter inmediatamente la mezcla de gel entre los
cristales previamente montados. Se adicionará gel separador hasta 1 cm por debajo de los
pocillos que forman los peines. Una vez adicionado el gel separador, adicionar entre los
peines 500 µl de isopropanol que se repartirá a lo largo de toda la superficie del gel. El
isopropanol es inmiscible en la mezcla del gel, su incorporación aísla la mezcla del gel
separador del oxígeno, favoreciendo la polimerización, pero además garantiza una
superficie totalmente horizontal y homogénea del gel polimerizado, sobre la cual se
depositará posteriormente el gel concentrador.
Una vez adicionado el isopropanol, dejar polimerizar el gel al menos durante 30 minutos.

9
4. Una vez polimerizado el gel separador, retirar con cuidado el isopropanol, lavar la
superficie del gel polimerizado con agua destilada y con ayuda de un papel de filtro retirar
el agua remanente de entre los cristales antes de verter la mezcla de gel concentrador.
5. Preparar la mezcla del gel concentrador. Utilizar guantes y manipular cuidadosamente
los reactivos químicos. Emplear pipetas automáticas para las cantidades pequeñas y
pipetas serológicas para cantidades mayores a 3 mL. Nunca pipetear con la boca.
Mezclar los siguientes reactivos en un vaso de precipitado limpio, agregar cada uno en el
orden que se indica.
Antes y después de adicionar APS y TEMED se debe homogenizar la mezcla agitando el
frasco cuidadosamente. Añadir el TEMED justo antes de verter el gel en los cristales.

Gel concentrador:
Agua destilada……………………….…..…..2,9 mL
Tris/HCl 0,5 M pH=6,8………………….….1,25 mL
bisacrilamida/acrilamida (0,8/30%)…….…0,85 mL
SDS 20%.......................................................25 µL
APS 10%.......................................................50 µL
TEMED…………………………………….....1,75 µL

Una vez preparada y homogenizada la mezcla del gel, verter inmediatamente entre los
cristales previamente montados hasta rebozar la superficie, colocar los peines
rápidamente evitando la formación de burbujas. Dejar polimerizar el gel durante al menos
20 minutos.
Tras la polimerización del gel concentrador, retirar los cristales cuidadosamente del
soporte plástico de montaje (sin retirar el peine) y envolver en papel de secar las manos
limpio. Ubicar los cristales con los geles así envueltos horizontalmente en recipientes
limpios y cubiertos con tampón de electroforesis 1X. Conservar en la cámara fría hasta la
próxima sesión de prácticas.

2. SESIÓN 2 (segundo día)

2a) Preparación de las muestras de proteínas para SDS-PAGE
Como parte del primer objetivo de la práctica: Expresión recombinante y análisis de
Western blot de la flavodoxina de Anabaena sp. PCC 7120 en Escherichia coli, en la
primera sesión de prácticas se indujo la expresión de flavodoxina recombinante en células
de E. coli DH5α y se tomaron muestras del cultivo sin inducir e inducido con IPTG durante
2 horas.
En la segunda sesión de prácticas se realizará la electroforesis en gel de poliacrilamida
con SDS (SDS-PAGE) para comprobar la sobreexpresión de la proteína.
Se aplicarán las muestras del cultivo en dos geles de poliacrilamida al 15%. Tras la
migración electroforética, uno de los geles se teñirá con azul de Coomassie para visualizar
la sobreexpresión proteica y el otro gel será electrotransferido a una membrana de PVDF
para iniciar la ejecución de un Western blot con anticuerpos específicos para la flavodoxina
de Anabaena sp.
Para preparar las muestras para SDS-PAGE se seguirá el siguiente procedimiento:

10
1. Descongelar las muestras conservadas a -20ºC, correspondientes al pellet obtenido tras
centrifugar 1 mL de cultivo.
2. Resuspender el pellet completamente en 50 µL de solución salina (emplear vortex).
3. Adicionar 10 µL de tampón de carga (6X) a cada muestra y mezclar suavemente.
Tampón de carga 6X:
Tris/HCl 0,5 M pH=6,8....................60 mM
SDS....................................................10%
Glicerol...............................................42%
Azul de bromofenol…………………0,06%

4. Calentar las muestras durante 10 minutos a 95ºC en termobloque para lisar las células,
solubilizar las membranas celulares y promover la desnaturalización proteica.
5. Centrifugar las muestras a 14.000 rpm durante 2 minutos para sedimentar detritos
celulares. Las proteínas celulares solubles, incluyendo la flavodoxina recombinante,
permanecerán en el sobrenadante.

2b) SDS-PAGE
Una vez preparadas las muestras, están listas para su aplicación en los geles de
poliacrilamida. Los geles preparados durante la sesión de prácticas anterior fueron
conservados a 4ºC en tampón de electroforesis.
Para realizar el SDS-PAGE se procederá de la siguiente manera:
1. Retirar con cuidado el papel que cubre los cristales con los geles de poliacrilamida. Sin
retirar el peine, secar con papel de manos los cristales y marcar con un rotulador
permanente la posición de los pocillos formados por los dientes del peine en el gel.
2. Con la ayuda del profesor, colocar los cristales con los geles de poliacrilamida en el
compartimento de electrodos de la cámara de electroforesis. Colocar dos geles en la
misma cámara de electroforesis y cubrir completamente con tampón de electroforesis 1X
el espacio entre los dos geles. Adicionar además tampón de electroforesis por fuera de los
cristales hasta cubrir aproximadamente la mitad del tanque.
Tampón de electroforesis:
Tris............................25 mM
Glicina.....................192 mM
SDS.............................0,1%
pH=8,3

3. Retirar los peines cuidadosamente y limpiar los pocillos con la ayuda de una jeringa
según las indicaciones del profesor.
4. Aplicar las muestras convenientemente según el orden acordado. Tanto el SDS-PAGE
como el Western blot se realizarán en dos subgrupos, los mismos que se organizaron para
confeccionar los geles en la primera sesión de prácticas.
Cada pareja deberá aplicar sus muestras en dos geles idénticos, uno para la tinción con
azul de Coomassie y el otro para Western blot y será responsable de apuntar la ubicación
de sus muestras en los geles, a fin de indicarla en los resultados que se presenten en el
informe final. El orden de aplicación en cada gel será acordado conjuntamente con el
profesor.

11
Aplicar 10-15 µL de cada muestra por pocillo, con la ayuda de pipetas automáticas y
puntas blancas.
Además, aplicar en el gel un patrón de peso molecular y el control definido por el profesor
(flavodoxina recombinante pura).
5. Cerrar la cámara de electroforesis convenientemente, conectar los electrodos a la
fuente y aplicar una corriente de 35 mA por gel (70 mA total, 2 geles por cámara), dejando
los parámetros de voltaje y tiempo libres.
6. Detener la migración electroforética cuando el azul de bromofenol llegue al final del gel.
Apagar la fuente y desconectarla de la corriente antes de manipular la cámara de
electroforesis.

2c) Tinción con azul de Coomassie

Tras finalizar la electroforesis, los geles destinados a la tinción con azul de Coomassie
serán extraídos de la cubeta. Los geles destinados a la electrotransferencia se
mantendrán sumergidos en el tampón de electroforesis para evitar que se deshidraten.
Para la tinción con azul de Coomassie se procederá de la siguiente manera:
1. Separar cuidadosamente los cristales que contienen el gel, con la ayuda de una
espátula plástica. El gel quedará adherido a uno de los dos cristales.
2. Cortar y desechar el gel concentrador.
3. Depositar cuidadosamente el gel separador en una cubeta plástica. Incubar en solución
de tinción con agitación lenta durante 30 minutos.
4. Retirar la solución de tinción (reciclar), eliminar el exceso de colorante mediante lavado
con agua destilada.
5. Sumergir el gel en solución de destinción. Incubar con agitación lenta hasta que las
porciones del gel que no tengan proteína se vuelven incoloras (día siguiente).
Solución de tinción: 45% metanol, 6% ácido acético, 0.5 g/L de Brilliant Blue-R, en agua
destilada.
Solución de destinción: 25% metanol, 10% ácido acético, 2% glicerol, en agua destilada.
6. Analizar la imagen del gel en el analizador de imágenes GelDoc (día siguiente).
Documentar los resultados con fotografías del gel.

2d) Electrotransferencia y bloqueo de la membrana de PVDF

Para el Western blot se empleará el sistema Mini Trans-Blot de la empresa BioRad. Este
sistema está constituido por una cámara vertical de electrotransferencia con capacidad
para transferir dos geles, un soporte con electrodos, una carpeta plástica para ubicar los
geles en contacto con las membranas de PVDF, esponjas y pastilla de hielo (Figura 5).
Siguiendo atentamente las indicaciones del profesor, la electrotransferencia se preparará
de la siguiente manera:

12
 Cubeta electrotransferencia

Soporte con electrodos

Pastilla de hielo

Esponjas

Carpeta para ubicar gel/membrana

PVDF

Figura 5. Módulo Mini Trans-Blot® para Western blot de BioRad

1. Recortar papeles de filtro y membrana de PVDF al tamaño apropiado. Usar guantes

limpios para manipular la membrana para evitar adherir cualquier proteína o suciedad de
las manos o guantes sucios.
2. Sumergir la membrana de PVDF en metanol durante 2 segundos.
3. Sumergir la membrana en agua destilada durante 2 minutos.
4. Sumergir la membrana en tampón de transferencia durante 2 minutos.
Tampón de transferencia:
Tris............................25 mM
Glicina.....................192 mM
SDS..............................0,1%
Metanol.........................20%
pH=8,3

5. Remojar los papeles de filtro y las esponjas (2/gel) en tampón de transferencia durante
varios segundos.
6. Retirar el gel de poliacrilamida que se va a transferir de entre los cristales de la
electroforesis. Manipular el gel cuidadosamente, empleando guantes.
7. Poner en contacto el gel con la membrana de PVDF mediante la confección de una
especie de “sándwich”:
abajo (parte transparente) = papel filtro - membrana PVDF - gel de poliacrilamida - papel
filtro = arriba (parte oscura)
Señalar con un pequeño corte en ángulo, la esquina superior izquierda del gel y de la
membrana, como referencia del inicio de la aplicación de las muestras. Es importante

13
ubicar el gel sobre la membrana de una vez, no se puede cambiar de posición una vez que
se hayan puesto en contacto.
8. Presionar ligeramente el “sándwich” de un lado a otro con ayuda de una pipeta
serológica plástica para retirar el exceso de líquido y evitar pequeñas burbujas entre el gel
y la membrana.
9. Ubicar el sándwich en la carpeta plástica protegido a cada lado por las esponjas. El gel
deberá ubicarse hacia la cara gris oscura de la carpeta (cátodo) y la membrana de PVDF
hacia la cara transparente de la carpeta (ánodo).
10. Ubicar las carpetas dentro del soporte con los electrodos, respetando la disposición de
colores: la parte gris oscura de la carpeta hacia la parte negra del soporte.
11. Colocar el bloque de hielo dentro de la cámara y cubrir con tampón de transferencia
frío. Cerrar el equipo convenientemente y ubicar dentro de un contenedor con hielo picado
que cubra por fuera la cámara de transferencia sin llegar a tocar la tapa.
12. Conectar la cámara a la fuente. Aplicar 400 mA durante 40 min.
13. Transcurrido el tiempo de electrotransferencia, apagar la fuente y desconectarla de la
corriente antes de manipular el equipo de transferencia.
14. Retirar la membrana de PVDF con ayuda de guantes y una pinza limpia. Colocar la
membrana en una cubeta limpia de dimensiones ajustadas, teniendo cuidado de
posicionar la cara que estuvo en contacto con el gel (donde se adhirieron las proteínas)
mirando hacia arriba.
15. Lavar 2 veces la membrana de PVDF con tampón TBS durante 5 minutos con
agitación lenta para eliminar el tampón de transferencia. Es importante que no se
agreguen las soluciones directamente sobre la membrana, se podrían despegar las
proteínas adheridas durante la transferencia.
Tampón TBS: 50 mM Tris-HCl (pH=7,5), 150 mM NaCl, en agua destilada.
16. Bloquear con tampón TBS + 5% (w/v) de leche desnatada, incubar a 4ºC sin agitación
hasta el día siguiente.
17. Teñir el gel de poliacrilamida transferido con azul de Coomassie para comprobar la
eficiencia de la transferencia (protocolo en 2c).

2e) Comparación del efecto antimicrobiano de dos líquidos comerciales de limpieza

de lentillas
En esta segunda sesión de prácticas se realizarán los primeros experimentos
encaminados a cumplimentar el segundo objetivo de la práctica: Análisis de la
composición y efecto antimicrobiano de sistemas comerciales de limpieza de lentillas.
En esta sesión se realizará el ensayo de actividad antimicrobiana de los líquidos de
limpieza de lentillas EverClean y Solución Única, ambos de la empresa Avizor. Los
resultados del ensayo serán recogidos tras 24 horas, en la última sesión de prácticas.
Para realizar el ensayo por parejas se procederá de la manera siguiente:
1. Partiendo de un cultivo O/N de E. coli DH5α en medio LB, preparar 1 mL de una
suspensión bacteriana con 106 UFC/mL (D.O.600 = 0,250). Diluir el cultivo con medio LB
fresco si es necesario.
2. A partir de esta suspensión preparar 1 mL de suspensiones celulares con 105 y 104
UFC/mL. Emplear medio LB fresco para hacer las diluciones correspondientes.

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3. Mezclar 250 µL de cada suspensión bacteriana con 250 µL de cada líquido de lentillas.
Para los controles negativos del ensayo, mezclar 250 µL de cada suspensión bacteriana
con 250 µL de solución salina estéril.
4. Incubar todas las mezclas durante al menos 1 hora.
5. Transcurrido el tiempo de incubación, sembrar por diseminación las células tratadas con
los líquidos de lentillas y los controles en placas de agar LB.

Control EverClean Solución Única

6 6 6
10 10 10

4 5 4 5 4 5
10 10 10 10 10 10

Figura 6. Siembra en placas de agar LB con espátula de Drigalski para

comparar el efecto microbiano de líquidos de lentillas comerciales.

Dividir tres placas de agar LB en tres secciones cada una (106, 105 y 104 UFC/mL) usando
un marcador permanente. En la primera placa sembrar las muestras correspondientes al
líquido de lentillas EverClean, en la segunda placa sembrar las muestras correspondientes
al líquido de lentillas Solución Única y en la tercera placa sembrar las muestras controles
(Figura 6).
Añadir 20 µL de cada muestra y diseminar con espátula de Drigalski sobre la superficie del
agar (Figura 6), dejar que se absorba el inóculo.
6. Incubar las placas a 37ºC hasta el día siguiente.

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3. SESIÓN 3 (tercer día)
3a) Western blot: inmunodetección y revelado
Como parte del primer objetivo de la práctica: Expresión recombinante y análisis de
Western blot de la flavodoxina de Anabaena sp. PCC 7120 en Escherichia coli, en la
tercera sesión de prácticas se culminará el Western blot para identificar la flavodoxina
recombinante de Anabaena sp. dentro de una mezcla de proteínas celulares solubles de
E. coli, separadas previamente mediante SDS-PAGE. En la segunda sesión de prácticas
los geles fueron transferidos a una membrana de PVDF y tras la electrotransferencia se
bloquearon durante toda la noche con leche desnatada.
Para continuar con el Western blot se procederá de la manera siguiente:
1. Lavar 2 veces la membrana de PVDF con tampón TBSL durante 5 minutos con
agitación lenta.
Tampón TBSL: tampón TBS + 0,5% (w/v) de leche descremada
2. Incubar la membrana con antisuero policlonal anti-Fld diluido 1:1200 en tampón tampón
TBSL durante 1 hora con agitación lenta.
3. Lavar 3 veces la membrana con tampón TBST durante 10 minutos con agitación lenta.
Tampón TBST: tampón TBS + 0,1 % (v/v) de Tween 20
4. Incubar la membrana con conjugado anti-IgG peroxidasa diluido 1:3000 en tampón
TBSL durante 1 hora con agitación lenta.
5. Lavar 3 veces la membrana con tampón TBST durante 10 minutos con agitación lenta.
6. Lavar 2 veces la membrana con tampón fosfocitrato durante 5 minutos con agitación
lenta.
Tampón fosfocitrato:
Ácido cítrico............................24,3 mM
Na2HPO4................................5,14 mM
pH=5,3

7. Para el revelado, preparar al momento solución de desarrollo de color:

- Pesar 20 mg de TMB (3,3´,5,5´tetrametil-bencidina) y disolver en 1 mL de etanol absoluto
(calentar en termobloque 60ºC, agitación vigorosa en vortex).
- Pesar 80 mg de DONS (dioctil sulfosuccinato) y disolver en 1 mL de etanol absoluto
(calentar en termobloque 60ºC, agitación vigorosa en vortex).
- Adicionar ambas soluciones a 8 mL de etanol absoluto y homogenizar.
- Adicionar los 10 mL de la mezcla anterior a 30 mL de tampón fosfocitrato y homogenizar.
- Incorporar 15 µL de H2O2 y homogenizar.
8. Sumergir la membrana en solución de desarrollo de color en la oscuridad, agitando
suavemente hasta observar la aparición de las bandas. Detener la reacción con agua
destilada.
9. Documentar los resultados mediante fotografías.

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3b) Evaluación de los resultados del efecto antimicrobiano de los líquidos de
limpieza de lentillas
Como parte del segundo objetivo de la práctica: Análisis de la composición y efecto
antimicrobiano de sistemas comerciales de limpieza de lentillas, en la segunda sesión de
prácticas se realizó el ensayo de actividad antimicrobiana de dos líquidos de limpieza de
lentillas. En este ensayo se mezclan diferentes concentraciones de una suspensión
bacteriana de E. coli con cada uno de los líquidos de limpieza de lentillas. Tras un tiempo
de acción de la solución de limpieza sobre las células, se toma una muestra de cada
mezcla y se siembra en medio LB para estimar la capacidad de cada uno de los líquidos
desinfectantes de matar a las células de E. coli y evitar el crecimiento microbiano.
Tras 24 horas de incubación, en la tercera sesión de prácticas se observarán los
resultados obtenidos. Según los resultados observados, cada estudiante deberá analizar
los siguientes puntos:
- Valorar la existencia o no de acción antimicrobiana, comparando los tratamientos
(líquidos de lentillas) con los controles (solución salina), a cada una de las concentraciones
de células ensayadas.
- Comparar la actividad antimicrobiana de ambos sistemas de limpieza de lentillas.
- Valorar la efectividad de ambos sistemas comerciales para el uso que han sido
concebidos.
- Documentar los resultados obtenidos con fotos.

3c) Determinación de la concentración de peróxido de hidrógeno presente en la

solución desinfectante de un sistema comercial de limpieza de lentillas
En el sistema EverClean el principio activo de la solución desinfectante es el peróxido de
hidrógeno. Se determinará la concentración de peróxido de hidrógeno presente en el
líquido de limpieza de lentillas espectrofotométricamente, empleando la Ley de Beer-
Lambert.
Se medirá la absorbancia de la solución a 240 nm, tomando un valor para el coeficiente de
extinción molar igual a 43,6 M-1 cm-1 (Noble RW and Gibson QH. J Biol Chem 1970; 245:
2409-13).
Diluir 10 μL de líquido de lentillas en 990 μL de H2O milliQ.

3d) Estimación de la actividad catalasa presente en la pastilla neutralizadora de un

sistema comercial de limpieza de lentillas
Para estimar la actividad catalasa de la pastilla neutralizadora del sistema de limpieza de
lentillas EverClean se seguirá el método propuesto por Iwase y colaboradores (Iwase T et
al. Sci Rep 2013; 3: 3081). Al poner en contacto una mezcla de peróxido de hidrógeno y
Triton X-100 con diferentes concentraciones de catalasa, el oxígeno producido por la
descomposición del peróxido de hidrógeno quedará atrapado en burbujas del detergente
(Figura 7). La altura de la columna de espuma producida por las burbujas de oxígeno en
Triton X-100 será linealmente proporcional a la concentración de catalasa presente en la
mezcla.
Para la determinación de la actividad catalasa se seguirá el siguiente procedimiento:

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1. Preparar 5 diluciones de catalasa (20, 40, 60, 80 y 100 UI) en H2O milliQ, a partir de una
solución concentrada de la enzima. Preparar 100 μL de cada una de las diluciones, por
duplicado.
2. Confeccionar una recta de calibrado con las diferentes concentraciones de catalasa.
Para ello, mezclar en tubos de ensayo Pyrex 100 μL de cada dilución de la enzima con
100 μL de una solución al 1% de Triton X-100 y 100 μL de una solución de peróxido de
hidrógeno al 30%. Agitar los tubos vigorosamente (vortex) e incubar.
La generación de oxígeno cesará a los 5 minutos. La capa de espuma permanecerá
inalterable por un tiempo aproximado de 15 minutos.
3. Una vez que la reacción ha culminado, medir con ayuda de una regla la altura de la
columna de espuma formada en el tubo de cristal con cada dilución de catalasa.
Confeccionar una recta de calibrado (eje X: unidades de actividad catalasa; eje Y: altura
de la columna de espuma en milímetros).
4. Triturar una pastilla neutralizadora del sistema EverClean y disolverla completamente en
5 mL de agua destilada.
5. Tomar 100 μL de la suspensión resultante y mezclarla con igual volumen de Triton X-
100 1% y peróxido de hidrógeno 30% en un tubo de ensayo Pyrex. Agitar vigorosamente e
incubar. Medir por duplicado o triplicado.
6. Medir la altura de la columna de burbujas obtenida. Interpolar el valor obtenido en la
recta de calibrado previamente confeccionada para estimar la concentración de catalasa
presente en la pastilla.

Espuma

Triton X-100

Figura 7. Ensayo de Iwase. La altura de la columna de espuma

será linealmente proporcional a la concentración de catalasa.

3e) Análisis de la composición de la pastilla neutralizadora

Tomar 750 μL de la disolución que contiene la pastilla neutralizadora triturada. Diluir 1:100
con agua destilada. Tomar un espectro desde 250 a 700 nm. Tratar de identificar los
componentes de la pastilla en función de los picos de absorción que aparecen en el
espectro UV-visible obtenido.

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