Nota de aplicación

Autores
Mariana Fitarelli Kiehl La familia de sistemas MagNA Pure: soluciones
Científico Senior de
Aplicaciones escalables y robustas que permiten la extracción de ADN
Drew Cheney*
Especialista en de alto rendimiento para aplicaciones de secuenciación
aplicaciones de campo,
secuenciación de próxima generación (NGS) posteriores
Spencer Debenport
Administrador de Los sistemas MagNA Pure 24 y MagNA Pure 96 ofrecen una solución escalable para
aplicaciones satisfacer las necesidades de extracción de ADN para los flujos de trabajo de secuenciación
Esteban McCune
Científico de Aplicaciones
de próxima generación (NGS). Los resultados que se muestran aquí demuestran un
Jennifer Pavlica*
rendimiento equivalente a mejorado por los sistemas MagNA Pure en comparación con la
Administrador de extracción manual de ADN en términos de calidad de ácido nucleico (rendimiento total,
aplicaciones degradación y cantidades relativas de monocatenario). vs ADN de doble cadena) y
Rachel Kasinskas
Director de Apoyo Científico y
métricas de secuenciación (incluidas lecturas duplicadas, lecturas en el objetivo,
Aplicaciones profundidad de cobertura y uniformidad de cobertura), siguiendo la preparación de la
Secuenciación y Ciencias de la biblioteca y el enriquecimiento de objetivos basado en la hibridación. Por lo tanto, tanto
Vida, Roche Diagnostics los sistemas MagNA Pure 24 como MagNA Pure 96 permiten un mayor rendimiento y
Corporation, Wilmington, MA, una mayor automatización sin sacrificar la calidad de los datos.
EE.UU.

*Autores que ya no son Introducción

empleados de Roche
La extracción de ácidos nucleicos es uno de los pasos más críticos de los flujos de trabajo de
Fecha de la primera NGS; también puede ser uno de los que más tiempo consume. A medida que aumenta el
publicación: 16 de rendimiento de los flujos de trabajo ngs en términos de preparación de bibliotecas aguas abajo y
agosto de 2021 capacidad de secuenciación, también aumenta la necesidad de una mayor escalabilidad y un tiempo
Fecha de publicación de práctico reducido para la extracción de ácidos nucleicos. La extracción automatizada utilizando
de
esta versión: 16 de agosto los sistemas MagNA Pure 24 y MagNA Pure 96 ofrece una mayor escalabilidad al tiempo que
2021
mantiene un rendimiento de muestra de alta calidad.
Los sistemas MagNA Pure 24 y MagNA Pure 96 son sistemas totalmente automatizados para la
extracción de ácidos nucleicos de hasta 24 y 96 muestras, respectivamente, de una amplia variedad
de tipos de muestras. Ambas plataformas utilizan un método de extracción basado en la tecnología
patentada MagNA Pure Magnetic Glass Particle (MGP) (Figura 1), que incluye los siguientes pasos
clave: 1) lisis de muestra; 2) ácido nucleico unido a la superficie de sílice del MGP en presencia de
un tampón caotrópico; 3) separación magnética del complejo MGP-ácido nucleico de sustancias
no unidas en 4) pasos de lavado repetidos; y 5) elución de ácidos nucleicos puros de los MGP.
Ambos sistemas MagNA Pure ofrecen varios protocolos optimizados que producen ácidos nucleicos
purificados de alta calidad compatibles con múltiples aplicaciones posteriores, incluida la
construcción de bibliotecas cuantitativas de PCR / RT-PCR y NGS.
Este estudio evaluó múltiples protocolos MagNA Pure System para comparar el rendimiento, la
calidad y el rendimiento del ADN en los flujos de trabajo NGS posteriores. Se utilizaron
muestras de sangre entera y plasma humano como entrada, y los resultados se compararon
con los controles de flujo de trabajo de extracción manual.

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
2 | Magna Además Sistemas para NGS

1 2 3 4 5
Lisis de MgP adición Separación Múltiples pasos Elución de ácidos
muestras, de unión de magnética de de lavado. nucleicos
inactivación de ácidos complejos purificados de
nucleasas y nucleicos a MGP/ácido MGP.
liberación de MGP. nucleico de la
ácidos muestra lisada.
nucleicos.

Figura 1. Principio de aislamiento de ácidos nucleicos realizado por los sistemas MagNA Pure 24 y MagNA Pure 96. Ambos sistemas utilizan la
tecnología MagNA Pure Magnetic Glass Particle (MGP).

Materiales y métodos Los rendimientos finales y la calidad de los ácidos nucleicos

Muestras de sangre total
Extracción, cuantificación y control de calidad del ADN
genómico:
Una sola muestra biológica de sangre entera humana fresca
(10 ml; que contiene 1,8 mg de anticoagulante EDTA por ml de
sangre) se obtuvo de Zen-Bio y se dividió en alícuotas de 200 μL.
El ADN genómico se extrajo con el sistema MagNA Pure 24 y el
sistema MagNA Pure 96 utilizando los métodos enumerados
en la Tabla 1; como control, se realizó en paralelo la
extracción manual con el kit QIAamp DNA Blood Mini
Extraction (Qiagen).
El protocolo magNA Pure 24 System MP24_hgDNA ds 200 se
modificó específicamente para la extracción de ADN de doble
cadena (dsDNA), lo cual es importante para los flujos de
trabajo de preparación de la biblioteca NGS; el paso final de
elución de este protocolo ocurre a una temperatura más baja
en comparación con el otro MagNA Pure System protocolos
utilizados aquí (ver Tabla 1), reduciendo la desnaturalización
del dsDNA a ADN simple (ssDNA). Los otros protocolos
(MP24_hgDNA 200 para el sistema MagNA Pure 24 y MP96_
DNA Blood SV para el sistema MagNA Pure 96) se diseñaron
originalmente para extraer ADN genómico total para su uso en
aplicaciones posteriores como PCR y qPCR; estas muestras
contienen mayores cantidades de ssDNA debido a las
temperaturas de elución más altas. 1, 2
Para Investigación Uso Solamente. No para uso en
diagnóstico Procedimientos.
extraídos se midieron utilizando dos métodos: (1) el Qubit
dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific), que detecta la
cantidad total de ADN de doble cadena pero no detecta ADN
de cadena simple, y
(2) el KAPA hgDNA Quantification and QC Kit, que es un kit
basado en qPCR que evalúa tanto la cantidad como la calidad del
ADN en una muestra, incluidos ssDNA y dsDNA. El kit KAPA
contiene un conjunto de estándares de ADN prediluidos y
premezclas de imprimación que se dirigen a diferentes posiciones
de un locus humano de una sola copia altamente conservado; los
amplicones resultantes son de 41 pb, 129 bp, y 305 pb de
tamaño. El amplicón más pequeño (41 pb), cuando se utiliza con
los estándares incluidos, proporciona una cuantificación absoluta
de las muestras de ADN. En contraste, la amplificación de los
fragmentos más largos es inhibida por el daño de la plantilla,
como cortes y roturas de doble cadena; por lo tanto, la relación
entre el rendimiento de los amplicones más largos (305 pb) y el
rendimiento de los amplicones más cortos (41 pb), denotada
como Q305/41, o la relación Q, es indicativa de la calidad del
ADN. Por lo tanto, la relación Q de ~ 1.0 indica que una muestra
de ADN contiene principalmente ADN de longitud completa .
Preparación de la biblioteca NGS y control de calidad:
Un total de 20 bibliotecas (cinco réplicas por método de
extracción; ver Tabla 1) se construyeron simultáneamente
utilizando el kit KAPA HyperPrep y un sistema automatizado de
manejo de líquidos (el
 Magna Además Sistemas para NGS Aplicaciones
|3

Sistema MagNA Pure 24 Sistema MagNA Pure 96 Extracción manual

Kit de extracción Kit de aislamiento MagNA Pure MagNA Pure 96 DNA y Viral NA QIAamp DNA Blood Mini Kit
24 Total NA Kit de Pequeño Volumen de extracción (Qiagen)

hgDNA ds 200 hgDNA 200

Nombre del (denominado ( denominado como DNA Blood SV Purificación de ADN a
protocolo "MP24_hgDNA ds "MP24_hgDNA 200" (denominado "MP96_DNA partir de sangre o
200" en esta en esta AppNote) Blood SV" en esta AppNote) fluidos corporales
AppNote) (Protocolo de giro)

Tecnología Tecnología de
Principio del de partículas de vidrio Tecnología de partículas Tecnología de membrana de
método partículas magnético (MGP) de vidrio magnético sílice , basada en
de vidrio (MGP) columnas
magnético
(MGP)

Resultados esperados ADN

genómico ADN genómico ADN genómico ADN total
de doble
cadena

Aplicaciones
descendentes de destino NGS PCR y qPCR PCR y qPCR PCR , qPCR, NGS

Rendimiento máximo
24 24 96 Depende del usuario

Replica ( extracción y
preparación de
bibliotecas) 5 5 5 5

Replica 5 5 5 5

Tabla 1: Descripción general de los protocolos para la extracción de ADN genómico a partir de muestras de sangre total.

Hamilton NGS STAR para Library Prep) utilizando los siguientes
parámetros: 100 ng de ADN cortado mecánicamente (tamaño
objetivo de ~ 200 pb); Adaptadores de doble índice KAPA de
15 μM; selección de tamaño de doble cara posterior a la
ligadura (relaciones de perlas 0.7X / 0.9X); y 11 ciclos de PCR.
Antes del enriquecimiento multiplexado de objetivos, las
bibliotecas se combinaban en cinco grupos; cada grupo
contenía una biblioteca generada utilizando la entrada de ADN
de cada uno de los cuatro protocolos de extracción. Los cinco
grupos de bibliotecas se enriquecieron utilizando el Panel de
Oncología Humana SeqCap EZ (2,75 Mb) y el KAPA HyperCap
Workflow v2.0. Las distribuciones de tamaño de biblioteca
previa y posterior a la captura se evaluaron utilizando un
bioanalizador 2100 y el kit de alta sensibilidad de ADN (Agilent
Technologies), y los rendimientos finales de la biblioteca se
midieron utilizando el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Thermo
Fisher Scientific) y el kit de cuantificación de la biblioteca
KAPA.
Secuenciación y análisis:
Las bibliotecas normalizadas y agrupadas se secuenciaron con un
secuenciador Illumina® NextSeq® 500 y un kit de alta salida (2 x 75
pb). Las lecturas sin procesar se submuestrearon aleatoriamente
a lecturas emparejadas de 3M y se procesaron con la tubería
SeqCap, que incluía recorte y filtrado de calidad con Trimmomatic,
alineación de secuencia a GRCh38 con BWA-MEM y BAM análisis
de archivos con Picard, GATK, SAMtools Flagstat y BEDTools. La
cobertura de GC se calculó con una ventana deslizante de 100
bases.
Muestras de plasma
Extracción de ADN libre de células (cfDNA) y control de
calidad:
Una sola muestra biológica de plasma humano recuperado
(200 ml; Anticoagulante EDTA) se obtuvo de Zen-Bio, y se
utilizaron alícuotas de 4 ml para la extracción de cfDNA
circulante con el sistema MagNA Pure 24 y el sistema MagNA
Pure 96, así como manualmente con el kit de aislamiento
AVENIO cfDNA (Tabla 2). Para permitir la llamada variante, se
agregó gDNA de control pre-cizallado que contenía
mutaciones conocidas al plasma a granel en una proporción
de 50 ng gDNA por plasma de 4 ml. Los protocolos de
extracción cfDNA para el sistema MagNA Pure 24 (MP24_cfNA
ds 4000 hp) y el MagNA

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
4 | Magna Además Sistemas para NGS

Sistema MagNA Pure 24 Sistema MagNA Pure 96 Extracción manual

Kit de aislamiento MagNA Pure 24 MagNA Pure 96 DNA y Viral NA Kit AVENIO cfDNA
Kit de extracción Total NA de Gran Volumen Kit de aislamiento

cfNA ds 4000 CV cfNA ds 4000

Nombre del protocolo ( denominado "MP24_cfNA ds 4000 ( denominado "MP96_cfNA ds N/A
hp" en esta AppNote) 4000" en esta AppNote)

Tecnología de partículas Tecnología de partículas

Principio del método de vidrio magnético de vidrio magnético Basado en columnas
(MGP) (MGP)

Resultados esperados ADN libre de células de doble ADN libre de células de doble ADN libre de células de doble
cadena cadena cadena

Aplicaciones
descendentes de NGS PCR y qPCR NGS
destino

Rendimiento máximo 24 48 16

Replica (extracción y
preparación de 4 4 4
bibliotecas)

Replica
(secuenciación) 2 2 2

Tabla 2: Descripción general de los protocolos utilizados para la extracción de ADN libre de células a partir de plasma.

Pure 96 System (MP96_cfNA ds 4000) está optimizado para la
extracción de dsDNA (Tabla 2), aunque solo el protocolo
cfDNA MagNA Pure 24 System está diseñado específicamente
para NGS. 1, 3
Se realizaron cuatro extracciones replicadas utilizando cada
método, para un total de 12 muestras. Como los rendimientos
de cfDNA del plasma suelen ser muy bajos, solo se realizó un
método de control de calidad para preservar cfDNA para la
preparación de la biblioteca NGS; Los rendimientos y la calidad
de cfDNA se midieron utilizando el bioanalizador Agilent 2100 y
el kit de ADN de alta sensibilidad. El examen visual de los perfiles
del bioanalizador verificó la presencia de un pico en el rango de
160-200 pb (el rango de fragmentos esperado para cfDNA) y la
ausencia de grandes cantidades de ADN contaminante de alto
peso molecular (>2000 bp), lo que indicaría contaminación por
gDNA.
Preparación de la biblioteca NGS y control de calidad:
Después de la evaluación del cfDNA extraído, se realizó un paso
de purificación utilizando perlas AMPure XP (Beckman Coulter)
a una relación perla-muestra de 3X para reducir el volumen
total de cada muestra a 50 uL. El rendimiento total de cfDNA
de cada una de las 12 muestras extraídas se utilizó como
entrada para la preparación de la biblioteca y el
enriquecimiento de objetivos utilizando el kit expandido
Para Investigación Uso Solamente. No para uso en
diagnóstico Procedimientos.
AVENIO ctDNA de acuerdo con los parámetros de procesamiento
estándar de AVENIO. 4 La calidad de las bibliotecas previas y
posteriores a la captura se evaluó a través del kit de ADN agilent
2100 bioanalyzer y de alta sensibilidad, y los rendimientos se
midieron utilizando el kit de cuantificación de la biblioteca KAPA.
Secuenciación y análisis:
Dos de las cuatro bibliotecas replicadas del método de extracción
each se secuenciaron utilizando un kit Illumina® NextSeq® 500
High Output (2 x 150 bp). El análisis bioinformático se realizó
utilizando el software de análisis oncológico AVENIO v2.0.0 para
generar las métricas clave de rendimiento y el informe de
llamadas variantes.
Resultados y discusión:
Muestras de sangre total
En este estudio, los cuatro métodos de extracción produjeron
ADN más que suficiente para la construcción de bibliotecas aguas
abajo (100 ng, para estas muestras); sin embargo, la extracción
manual resultó en mayores rendimientos que los tres protocolos
magna pure System (Figura 2).
Cuando la muestra es limitada, el rendimiento total de ADN a
menudo se considera la métrica más importante para el
rendimiento de los métodos de extracción de ADN; sin
embargo, la disponibilidad de muestras más grandes
 Magna Además Sistemas para NGS Aplicaciones
|5

Rendimiento de ADN extraído (ng): Sangre total

7500

6000

4500
MP24_hgDNA ds 200
MP24_hgDNA 200
3000
5909 Manual de
4465
1500 3093 MP96_DNA
3556
2063
1680 1835 Blood SV
1248

0
Qubit
Qubit
(Fluorimétrico)
KAPA
KAPAhgDNA QQC (qPCR)
hgDNA QQC
(Fluorimétrica) (qPCR)

Figura 2. Todos los métodos probados arrojaron cantidades de ADN más que suficientes para la construcción de bibliotecas a partir de sangre total. Los
rendimientos de ADN extraídos se evaluaron mediante un método fluorimétrico (Qubit) y por el método qPCR (KAPA hgDNA Quantification and QC Kit). Las
barras representan la media de 5 extracciones replicadas, y las barras de error indican la desviación estándar .

(como suele ser el caso con las muestras de sangre whole)

permite la consideración de otros factores para aumentar la
calidad del ADN de entrada y simplificar el flujo de trabajo de
NGS, mejorando así el éxito general de las aplicaciones
posteriores.
La evaluación de la calidad de cada muestra de ADN a través del
KAPA HgDNA Quantification and QC Kit DNA y la relación
Q305/41 resultante (Figura 3A y Métodos) demuestran que los
dos protocolos del sistema MagNA Pure 24 produjeron el
rendimiento más alto ADN de calidad, con una relación Q
cercana a 1.0.
También se examinó la fracción de dsDNA presente en cada
muestra, ya que la mayoría de los kits de preparación de
bibliotecas de ADN disponibles comercialmente requieren
ADN de doble cadena (dsDNA) para una ligadura exitosa del
adaptador. En esta evaluación, se calculó la relación entre los
rendimientos de ADN determinados por qPCR (que mide
ssDNA y dsDNA) y por Qubit (que mide solo dsDNA) (Figura
3B); valores superiores a 1,0 indican un aumento de la
contaminación por SSDNA. Los resultados de la Figura 3B
muestran que el protocolo MP24_hgDNA ds 200, desarrollado
para aplicaciones NGS, dio como resultado la relación
qPCR/Qubit más baja, lo que indica

U
Pregunta B qPCR/Qubit
n
305/41 3.0
1.5

1.0 2.0
MP24_hgDNA ds 200
MP24_hgDNA 200

Manual de
0.5 1.0 MP96_DNA
Blood SV

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
6 | Magna Además Sistemas para NGS
1.00 0.99 0.91 0.90 2.16 1.84
1.47 1.66

0.0 0.0

Figura 3. Evaluación de la calidad del ADN derivado de la sangre total. A) La calidad del ADN extraído se evaluó mediante un ensayo qPCR (Q305/41), donde
un valor de 1 indica una calidad ideal con cortes mínimos y roturas de dsDNA. Las barras representan la media de 5 extracciones replicadas, y las barras de
error indican la desviación estándar . B) La relación (qPCR/Qubit) de los rendimientos medios se calculó para evaluar la contaminación por cadena simple
(ssDNA). Los valores más altos indican niveles más altos de ssDNA presentes.

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
 Magna Además Sistemas para NGS Aplicaciones
|7

Lecturas duplicadas (%) Lecturas en destino (%)Profundidad media (X) Bases ≥50X
100
(%)

75

50

74 73 81 84 81
25 73 73 82 61
64 63 64

14 12 13 13
0

MP24_hgDNA ds 200
MP24_hgDNA 200 MP96_DNA Sangre Manual
SV

Figura 4. El rendimiento de secuenciación fue equivalente en todos los flujos de trabajo para la extracción de ADN de sangre total. Las barras representan la
media de 5 bibliotecas de réplica , y las barras de error indican la desviación estándar .

que estas muestras contenían la mayor proporción de dsDNA.

La uniformidad de la cobertura de la secuencia también se
En comparación, el protocolo MP24_hgDNA 200, diseñado
comparó entre los cuatro tipos de muestra mediante la
para ensayos de PCR y qPCR, dio como resultado la relación
evaluación de la cobertura normalizada en todas las regiones de
qPCR/Qubit más alta, lo que indica un mayor porcentaje de
contenido variable de GC, también conocida como sesgo de GC
ssDNA en comparación con las otras muestras.
(Figura 5A), y la penalización base fold-80 (Figura 5B).
Después del control de calidad, el ADN extraído se utilizó
Con respecto al sesgo GC, el MP24_hgDNA protocolo ds 200
como entrada para la preparación de bibliotecas enriquecidas
(diseñado para NGS) se desempeñó de manera equivalente al
con objetivos y secuenciados (ver Métodos). Todas las
método de control manual, mientras que el MP24_hgDNA 200
bibliotecas cumplieron los criterios de calidad recomendados,
mostró una preferencia por secuencias ricas en GC. El
incluido el rendimiento previo a la captura por encima de
rendimiento relativamente bueno del MP24_hgDNA ds 200 no es
1000 ng y el rendimiento posterior a la captura por encima de
inesperado, debido a la temperatura reducida del paso de
500 ng (datos no mostrados). Las métricas clave de secuenciación
elución final en este protocolo, que fue diseñado para reducir la
utilizadas para evaluar el rendimiento de la secuenciación
desnaturalización en la etapa de elución. Las temperaturas de
(rata de duplicación, lecturas en el objetivo, profundidad
elución más altas, como en el protocolo MP24_hgDNA 200,
media de cobertura y % de bases cubiertas ≥50X) fueron
pueden provocar la desnaturalización de las regiones ricas en AT,
equivalentes en todos los flujos de trabajo de extracción
lo que no hace
(Figura 4).

A GC-Sesgo Distribución B Plegable-80 Base Pena

3.00
1.6

1.2
2.00 MP24_hgDNA ds 200
Uniformidad de cobertura

MP24_hgDNA 200
normalizada

0.8

Manual de
1.00
0.4 2.31 MP96_DNA
2.79 2.46
2.35
Blood SV

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
8 | Magna Además Sistemas para NGS
0
0.00
020406080100
Contenido de la secuencia , GC %

Figura 5. La uniformidad de cobertura de las bibliotecas generadas con ADN de sangre total fue similar tanto para la extracción manual como para los
métodos MagNA Pure System .
A) Los datos de uniformidad de cobertura normalizada se trazaron con respecto al contenido de GC de la región de destino utilizando una ventana deslizante de
100 bases. Los gráficos de líneas representan la media de 5 bibliotecas replicadas. B) Se calculó la penalización base Fold-80, una estimación de la secuenciación adicional
requerida para llevar el 80% de las bases a la cobertura media, para todas las bibliotecas. Los valores más bajos indican una cobertura más uniforme. Las barras
representan la media de 5 bibliotecas replicadas, y las barras de error muestran la desviación estándar .

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
 Magna Además Sistemas para NGS Aplicaciones
|9

Rendimiento de cfDNA extraído (ng): Plasma

45
una mayor uniformidad de cobertura en toda la región
objetivo. Al igual que los resultados de sesgo de GC, el
protocolo MP24_hgDNA ds 200 compatible con NGS y el flujo
30 de trabajo manual dieron como resultado una uniformidad de
MP24_cfNA ds 4000
cobertura similar (Figura 5B) que superó el rendimiento de los
CV MP96_cfNA ds 400
otros dos flujos de trabajo. El protocolo MP96_DNA Blood SV
Manual
15 mostró una uniformidad de cobertura ligeramente reducida,
mientras que el protocolo MP24_hgDNA 200 resultó en la
32.3
30.2 uniformidad de cobertura más baja. Estos hallazgos
18.2
probablemente sean el resultado de diferencias en las
0
temperaturas de elución, como se discutió anteriormente.

Figura 6. La extracción de ADN libre de células con los sistemas MagNA

Pure 24 y MagNA Pure 96 dio como resultado mayores rendimientos en
comparación con un flujo de trabajo de extracción manual. Los rendimientos
de ADN libre de células extraído del plasma fueron evaluados por Agilent 2100
Bioanalyzer y DNA High Sensitivity Kit. Las barras representan la media de 4
extracciones replicadas, y las barras de error indican la desviación estándar .
no siempre se rehbrida correctamente al enfriarse. Estos
fragmentos desnaturalizados a menudo permanecen de una
sola cadena a través de la preparación de la biblioteca, lo que
los hace no disponibles para la ligadura del adaptador y da
como resultado la caída de secuencias ricas en AT. En
comparación, el protocol MP96_DNA Blood SV, recomendado
para aplicaciones de PCR y qPCR, funciona significativamente
mejor que su contraparte MagNA Pure 24 (MP24_hgDNA
200), aunque no tan bien como el MP24_hgDNA Protocolo ds
200 y flujos de trabajo manuales.
La métrica de penalización de base Fold-80 indica cuánta
secuenciación adicional se requeriría para cubrir el 80% de las
bases objetivo a la profundidad de cobertura media actual; los
valores más bajos indican
Muestras de plasma
Las muestras de plasma tienden a ser más desafiantes que las
muestras de sangre entera debido a los rendimientos de
extracción significativamente más bajos y los tamaños de
fragmentos de ADN más pequeños. Por lo tanto, maximizar los
rendimientos de cfDNA es importante para la preparación y
secuenciación exitosa de la biblioteca NGS, lo que hace que el
ADN yield sea un comparador crítico entre los flujos de trabajo
de extracción. En este estudio, ambos protocolos MagNA
Pure, MP24_cfNA ds 4000 hp y MP96_cfNA ds 4000, dieron
como resultado mayores rendimientos en comparación con el
flujo de trabajo manual (Figura 6), según lo medido por Agilent
Bioanalyzer. Además, los tres métodos de extracción se
desempeñaron de manera equivalente con respecto a
minimizar la contaminación de ADN de alto peso molecular
(datos no mostrados).
Después de la preparación de la biblioteca y el enriquecimiento
de objetivos, todas las bibliotecas finales mostraron los
rendimientos esperados para el kit de análisis de CTDNA de
AVENIO , y fueron suficientes para la secuenciación (datos no
mostrados). Cada una de las bibliotecas secuenciadas produjo un
número casi equivalente de pares de lectura (Figura 7A), lo que
hace posibles comparaciones directas entre los métodos de
extracción. Mientras que el flujo de trabajo manual produjo un
porcentaje ligeramente mayor de lecturas mapeadas (Figura 7B),
las bibliotecas produjeron

Pares ARead (X
B Lecturas mapeadas C Lecturas en el D Profundidad de
106) (%) fragmentos
objetivo (%)
únicos (X)
100
7,500
45 100

75
75 15
30

2525

5050

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
10 | Magna Además Sistemas para NGS
6,000
3,000

4,500
1,500

76 72
0 0 0 76
0

MP24_cfNA ds 4000 CV MP96_cfNA ds 4000

Manual 6,497 6,316
4,993

Figura 7. El ADN libre de células (cfDNA) extraído con MagNA Pure Systems generó bibliotecas de secuenciación de alta calidad . Los datos se analizaron
para cuantificar el A) número total de pares de lectura, B) porcentaje de lecturas mapeadas , C) porcentaje de lecturas en el objetivo y D) profundidad de
secuencias únicas Fragmentos de ADN. Las barras representan la media de 2 bibliotecas de réplica, y las barras de error indican 0,5 del rango.

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
 Magna Además Sistemas para NGS Aplicaciones
| 11

U Variantes detectadas en AF <1%

n
1.0%

0.8%

0.6%

0.4%

0.2%

0.0%
s
AKT1:Glu CTNNB1:Thr
BRAF:Val6 EGFR: EGFR:7Thr
BRAF:Val6 EGFR: 8Leu
KRAS:GlyKRAS:Gly EGFR: KRAS:Gln6 NRAS:Gly1KRAS:GlyNRAS:GlnNRAS:Gly
NRAS:Gly1KRAS:Gln KRAS:Gly
PIK3CA:Glu5 BRAF:Val60
NRAS:Gln6
NRAS:Gln PIK3CA:Glu5
KRAS:Gly1 NRAS:Gln6
KRAS:Gly
17Lys 00Gly 00Ala Gly719Ala 0Met 41Ala 12Arg 12Val Leu858Arg 1Leu 1Gln6 2Asp 61His 3Asp 12Cys 61His 12Val 45Lys 12Al a 0Met 1Leu 61Lys 2A p 42Lys 1Arg 12Ser
9

B Variantes detectadas en AF
15.0% >1%
MP24_cfNA ds 4000
CV MP96_cfNA ds 400
Manual
10.0%

Figura 8. La variante que requirió muestras de cfDNA fue

similar en todos los métodos de extracción. Los datos de
5.0%
secuencia se analizaron para la presencia/ausencia de SNVs que
se sabe que están presentes en el gDNA de control que se
disparó en la muestra de plasma. Las frecuencias de los
alelos (FA) se evaluaron utilizando los datos de las muestras
0.0% extraídas manualmente como punto de referencia. A) Variantes
e
KRAS:Gly
1 BRAF:Val6 PIK3CA:His10 MAP2K1:Gln 9
r CTNNB1:Ser detectadas en <1%. B) Variantes detectadas en
56Pro S
3Asp 00Glu 47Arg EGFR 33Tyr >1%. Las barras representan la media de 2 bibliotecas de réplica, y
: las barras de error indican 0,5 del rango.
Gly71

con cfDNA de los protocolos MagNA Pure 24 y MagNA Pure 96

System (MP24_cfNA ds 4000 hp y MP96_cfNA ds 4000,
respectivamente) produjo un mayor % de lecturas en el objetivo y
una mayor profundidad de fragmentos únicos secuenciados
(Figuras 7C y D). Es importante destacar que la mayor
profundidad de secuenciación única obtenida con cfDNA aislado
con los sistemas MagNA Pure indica una mayor complejidad
molecular y, por lo tanto, más equivalentes genómicos
representados, en comparación con las bibliotecas generadas con
el cfDNA extraído manualmente. .
Aunque las métricas descritas anteriormente son importantes
para evaluar y comparar nuevos flujos de trabajo, es la precisión
de las llamadas variantes lo que en última instancia determina
la efectividad de cada método de extracción de cfDNA. Para
permitir una comparación directa de las llamadas variantes
entre métodos, gDNA de control precalcinado
se añadieron 32 SNV conocidos a la muestra de plasma a
granel antes de la alícuota y la extracción (como se describe
en los Métodos). Se detectaron los 32 SNV en todas las
bibliotecas, con frecuencias de alelos (AF) similares para cada
método de extracción (Figura 8). De los 32 SNV, los 26 SNV que
se sabe que están presentes en AF bajo se detectaron a AF bajo
(por debajo del 1%) en todas las muestras de cfDNA (Figura
8A), y los 6 SNV que se sabe que están presentes en AF
relativamente alto se detectaron en AF superior al 1% (Figura
8B), de acuerdo con los SNV proportion informados para el
control de pico (datos no mostrado). Juntos, estos hallazgos
muestran que las bibliotecas generadas con cfDNA extraído
utilizando los flujos de trabajo del sistema MagNA Pure 24 y
MagNA Pure 96 producen resultados de perfiles genómicos
similares a los del trabajo manual, pero con menos tiempo
práctico.

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.
 Magna Además Sistemas para NGS Aplicaciones
|9

Conclusión
Este estudio demuestra que los sistemas MagNA Pure 24 y
MagNA Pure 96 proporcionan métodos de extracción de ADN
totalmente automatizados, robustos y compatibles con NGS para
múltiples tipos de muestras. El ADN extraído de la sangre total
y del plasma utilizando los sistemas Magna Pure produjo datos de
secuenciación de alta calidad de bibliotecas enriquecidas con
objetivos; los resultados son comparables o mejores que los
resultados obtenidos con ADN preparado manualmente. Las
métricas de secuenciación evaluadas incluyen lecturas
duplicadas, uniformidad de cobertura,
% lee en el objetivo, la profundidad de cobertura, la complejidad
de la biblioteca y, para las muestras de plasma, la eficiencia de la
detección de SNV. En general, este estudio muestra que los
sistemas automatizados MagNA Pure 24 y MagNA Pure 96 que
ahorran tiempo ofrecen protocolos de extracción de ADN que son
compatibles con los flujos de trabajo NGS posteriores, incluida la
preparación de librarios enriquecidos con objetivos.

Referencias
1. Roche Diagnostics. Kit de aislamiento MagNA Pure 24 Total
NA . Instrucciones de uso. Versión 05, 2020.
2. Roche Diagnostics. MagNA Pure 96 DNA y Viral NA Small
Volume Kit. Instrucciones de uso. Versión 09, 2020.
3. Roche Diagnostics. MagNA Pure 96 DNA y Viral NA Kit de
Gran Volumen. Instrucciones de uso. Versión 09, 2020.
4. Roche Diagnostics. Kits de análisis AVENIO ctDNA. Guía
del usuario del flujo de trabajo de reactivos. Versión 1.3,
2020.

Para obtener más información sobre Roche MagNA Pure

Systems , visite: https://go.roche.com/magnapure

Publicado por:
Roche Secuenciación y Ciencias de la Vida
9115 Carretera de La Haya
Indianápolis, IN 46256
10 | Magna Además Sistemas para NGS

sequencing.roche.com

Nombre del proyecto : MagNA Pure into NGS 2019

Solo para uso de investigación. No para uso en procedimientos de diagnóstico.
MagNA Pure y KAPA son marcas comerciales de Roche. Todos los demás nombres de productos y marcas comerciales son propiedad de sus respectivos propietarios.
© 2021 Roche Secuenciación y Ciencias de la Vida. Todos los derechos reservados. MC-US-09844 APP700001 A507 8/21

Para Investigación Uso Solamente. No para uso en

diagnóstico Procedimientos.