Recolección de muestra

Se recolectaron muestras de agua de fuentes termales (39◦56′46,7′ ′N 41◦06′ 17,7′ ′E) y se

recolectaron muestras de suelo contaminado con aceite de la Zona Industrial de Erzurum
(39◦55′27,1′ ′N 41◦dieciséis′55,8′ ′MI)

Detección de cepas para la actividad de la lipasa

Luego del cultivo se va a detectar cuales son las cepas para las cuales se va a realizar las
actividades de la lipasa, también se hará un cultivo donde se va a observar las zonas de
hidrólisis (donde serán bajas y altas) y se utilizarán las zonas de hidrólisis alta para la
producción de la lipasa.

Producción de lipasa

Los aislamientos que forman las zonas de hidrólisis más grandes en placas de TBA se cultivaron
en Caldo Nutriente a 30ºC. ◦C, 150 rpm durante la noche como precultivo. Al día siguiente, 100
ml de medio de caldo tributirina (TBB) [peptona al 0,5%, 0,3% de extracto de levadura, 1% de
tributirina (o aceite de oliva), pH 7,0] en matraces de 250 ml se inocularon con 1 mL de
precultivo (OD600 1) y se incubó a 30 ◦C, 150 rpm durante 3 días.

Ensayos de actividad de lipasa

Se van a realizar 3 ensayos con la misma cantidad de enzima cruda (enzima que no está
purificada) y con las mismas condiciones y diferentes tiempos, como sustrato será el palmitato
de nitroferol a 4Mm (micro molar) y TRIS-ácido clorhídrico (HCL) todo a temperatura
ambiente.

Identificación de aislamientos productores de lipasa

Se identificaron diez cepas bacterianas con la mayor actividad de lipasa mediante la

secuenciación del gen 16S rRNA y los métodos de identificación convencionales (color de la
colonia, forma de la colonia y exámenes de la forma celular, tinción de Gram, reacciones de
catalasa, proteasa y ureasa). Las secuencias del gen del ARNr 16S se depositaron en la base de
datos del NCBI con los números de acceso de GenBank.

Purificación de lipasa

2.6.1. Purificación parcial de lipasa por precipitación con sulfato de amonio

En la primera etapa de purificación enzimática, se prepararon 6 frascos con 100 mL de medio

TBB que contenían 1% de aceite de oliva y se autoclavaron a 121ºC. ◦C.Se inoculó e incubó el
mejor productor de lipasa en estos medios durante 3 días a 180 rpm y 30 ◦C. Se recogieron los
medios de cultivo y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 15 min y se descartaron las células
bacterianas. El sobrenadante libre de células (enzima bruta) se recogió en un vaso de
precipitados y se sometieron 500 ml del sobrenadante a precipitación con sulfato de amonio.

2.6.2. Purificación de lipasa por cromatografía de intercambio aniónico

El segundo paso de la purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio aniónico

utilizando Biologic LP Chromatography Systems (Biorad, EE. UU.). Después del lavado, se
pasaron 25 ml de solución enzimática concentrada a través de 0,22μm filtros de jeringa y se
cargó en una columna HiTrap Q HP (GE Healthcare) preequilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 7,8
(Tampón A).
Perfilado SDS-PAGE y determinación de constantes cinéticas (Km y Vmax)

Las fracciones de lipasa crudas y purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE en Gel de

poliacrilamida al 12% (v / v) teñido con Coomassie Brilliant Blue R-250 después de la
electroforesis. Los pesos moleculares de las muestras se calcularon comparando las
movilidades relativas utilizando Precision Plus Protein Unstained Standard (250-10 kDa).

Efectos del pH y la temperatura sobre la actividad y la estabilidad de la lipasa

El pH óptimo para la actividad de la lipasa se determinó realizando un ensayo enzimático en un

rango de pH de 3,0-11,0 en tampones 50 mM: acetato de sodio (pH 3,0-5,0), fosfato de potasio
(pH 6,0), tampón Tris-HCl (pH 7.0-8.0) y glicina-NaOH (pH 9.0-11,0). La temperatura, la
concentración de enzima purificada y la concentración de sustrato se mantuvieron constantes
como se indica en las condiciones de ensayo estándar.

Efectos de los iones metálicos, disolventes orgánicos y tensioactivos.

Los efectos de los iones metálicos sobre la estabilidad de la lipasa se examinaron preincubando
la enzima purificada en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 con 1 mM de Ag +, Ba2+, California2+,
CD2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, Mg2+, Minnesota2+, Mes2+, Ni2+, y Zn2+ a los 25 ◦C durante 1 h.
Después de la incubación, se midieron las actividades enzimáticas mediante el ensayo de
actividad estándar. Las actividades relativas se calcularon comparándolas con la solución de
enzima de control preincubada en las mismas condiciones sin iones metálicos.

Efectos de los detergentes sobre la actividad y la estabilidad.

Para determinar los efectos de los detergentes comerciales sobre la actividad, se llevaron a
cabo ensayos de actividad de la lipasa en condiciones estándar en presencia de 1% de
detergente líquido para ropa, detergente para lavavajillas y detergente para lavar a mano.

Evaluación del rendimiento de lavado

La aplicación de lipasa como aditivo de detergente para ropa se evaluó en términos de

rendimiento de lavado en 5 × 5 cm de tejidos de algodón blanco.

Diapo 5

Un ensayo triple se cambia las dependientes