Analisis de proteinas

jueves, 29 de septiembre de 2022 13:26

Generalidades: técnicas de biología molecular

• Acidos nucleicos PCR
• Proteínas (WB / M confocal / inmunoprecipitación / ELISA
• Se aprovechan propiedades de las proteinas en solución para separar mezclas de estas
basandose en:
○ Tamaño o peso molecular
§ Las pares de bases del DNA determina la longitud del ácido nucleico.
§ Las proteínas tiene su unidad de medida llamada KDa
○ Solubilidad
○ Carga eléctrica
○ Afinidad biológica por otras moléculas
§ Al tener la capacidad de pegarse a otros compuestos, con el fin de
identificar clínicamente otras proteinas o moléculas, usando anticuerpos.
Proteínas
• Pueden ser estructurales, contráctiles, de transporte, hormonas, enzimas, anticuerpos,
• Una proteína es una secuencia de aminoácidos.
Métodos de cuantificación
De proteínas totales: se lisa a la célula donde se obtiene muchas proteinas en un tubo.
• Absorción ultravioleta
• Ensayo de Bradford / azul de comassie (el mas usado en el 99% de los casos).
• Ensayo de Lowry
• Ensayo CBQCA (3-(4-Carboxibenzoil) quinolina-2-carboxialdehído).
De proteínas específicas:
• Ensayo de Western-Blot
• ELISA
• Espectroscopía de masas
• Nanopartículas
Cuantificación de proteínas totales
Ensayos colorimétricos
Entre más proteínas haya en el papel, mas colorida es la muestra.
El color más oscuro contiene mayor concentración de proteinas.
• El azul de comassie debe cambiar a amarillo para representar la cantidad de moléculas
proteicas, si sigue azul, la concentración es baja.
• Un espectofotometro detecta cuanta luz retiene una muestra, entre mas luz reteñida,
mas proteínas hay.
• 595 nanómetros es la longitud usada para cuantificar proteínas.
Método de bradford: pasos : completar
1. Se obtiene la muestra proteica
2. Se añade Bradford (preparación de difusiones: 0-200 ug / mL) y 0.75 ml Bradford.
3. Se deja en reposo durante 5 minutos
4. Se lee a 595 nm y UV
Diseño de Curva estándar o curva de calibración : completar
• Se hacen por disoluciones seriadas (división por volúmenes a porciones mitades).
BSA: albumina serica bovina (se usa para
Se utiliza la concentración conocida de BSA y la cantidad de luz que retiene conocida
(empleando disoluciones seriadas), para calcular el peso o concentración de la muestra
Bradford a partir de la absorbancia de luz obtenida.
• En él ecuación de la pendiente, la y representa la absorbancia y x es la concertación
desconocida.
• X = y-b / m
La regresión lineal (R cuadrada) nos permite determinar que tan buena se hizo la curva de
calibración, o sea que tanto se aproximan los puntos a la linea de la pendiente.
• Una buena R cuadrada debe ser aproximado a 1 (.99)
Ventajas Desventajas
• Sencillez • Baja sensibilidad no detecta diferencias sutiles entre
• Costo bajo muestras (menor del 5% es relativo)
• Equipamiento portátil • Falta de exactitud
• Fácilmente interpretable
• No requiere personal
capacitado
Cuantificación de proteínas específicas
Específica el funcionamiento, participación y presencia de proteínas particulares.
• Obtención, fijación e identificación y análisis.
• Tenemos que descartar toda aquella proteína que no nos sirve.
Western-Bloot
1. Obtenemos la celula de donde se sacarán las proteínas.
2. Obtención de proteínas por lisis celular
3. Se aíslan concentradas en una muestra (hay que saber cuantas proteinas tenemos)
a. En cada muestra que se usa se emplea un 1 mg de proteína.
4. Hacemos un corrimiento electroforetico (separarlos mediante sus cargas e ir
diferenciando su peso)
a. En el DNA se usa gel de agaraso, y en proteínas se usa el gel SDS / PAGE
b. El gel de acrilamida (bis-acrilamida) (SDS / PAGE) es de naturaleza
desnaturalizante que actua desnaturalizando las proteínas
c. Son geles verticales
d. Antes de colocarlo en los pozos del gel, se debe linear la muestra
(desnaturalizar), es decir, llevarla a las estructuras primarias aplicando calor a
baño maría.
e. Se deben colocar el marcador de peso antes de hacer correr las proteinas sobre
el gel.
f. Mientras las muestras vayan descendiendo, se van desnaturalizando más,
g. El gel se compone de dos fracciones: la parte de arriba se llama compactador
(la muestra comienza a compactar o apretarse entre ellas) y la parte de abajo se
llama separador. Ambos se diferencian por el PH, el primero es de 6.8 y el otro
de 8.8.
h. El gel tiene que volverse solido mediante la polimerizacion, se forman mallas
compactadas para determinar que proteinas se quedan atoradas o pasan por el
gel.
i. Se tiene que colocar un agente polimerizante, en esto caso son: Temed o
Tetrametiletilendiamina y APS o persulfato de amonio (cuando interactúa
detonan la polimerizacion (reacción exotérmica) del gel)
5. Segunda fase: transferencia a una matriz solida
6. Una vez hecho el corrimiento electroforetico, por cargas, hacer que las proteínas
migren a la membrana de nitrucelulosa.
a. La transferencia puede ser húmeda o semihúmeda (ambos filtros están húmedos
con PH buffer)
7. Arriba se coloca papel filtro, después el gel, de ahí la membrana , y despues otro
papel filtro.
8. Se colocan cargas para que las proteinas se desplacen del gel a la membrana, y se
tiene como resultado una membrana de nitrocelulosa con proteínas fijadas.
9. Tercera etapa
10. Para asegurarse qué hay proteinas, se utiliza roño de Ponceu para detectar la presencia
en la membrana.
11. Lo despintas lavando con buffer.
12. Se agarra la membrana y se utilizan anticuerpos diseñados para unirse
específicamente a cierta proteína
a. Se utilizan los abs monoclonales: se une solo a una región de la proteína
(subunidad proteica)
b. Se utilizan abs policlonales (reconoce a varios epitopes de la proteína): mas
usados y baratos
13. Se hace un bloqueo de membrana en los espacios donde no hay proteína, se hace para
mejor una superficie de contacto y se utiliza la leche para rellenarlos.
14. La membrana se cubre con anticuerpos (disueltos en buffer con un poquito de leche)
a. Se puede hacer en frío (cuarto frío y toda la noche se deja) o en temperatura
ambiente (se deja 2 horas).
15. Incubacion
16. Una vez pasado el tiempo, se lava la membrana para retirar el exceso de solución de
anticuerpos
17. Posteriormente, como los Abs se pegaron, se debe colocar otro anticuerpos (anti
especie) que reconozca al primero, hechos en otro animal.
18. El anticuerpo secundario tiene incorporado un fluoroforo (emite luz bajo ciertas
condiciones).
19. Después se incuba dos horas
20. Se lava y ya se tiene una membrana preparada (se le añade una sustancia llamada
ECL, al unirse al fluoroforo para que brille, hecho en cuarto oscuro
21. Cuando brilla se toma una placa fotográfica, se deja pasar el tiempo y se guarda (la
luz quema a la placa)
Ejemplo práctico del análisis de proteinas
Microscopia con focal
Se fundamenta en el marcaje de proteinas en células
• Las técnicas de inmunomarcado (inmunocitoquímicas), ha surgido en respuesta a la
necesidad de la caracterización y de localización específica de diferentes componentes
tisulares y celulares.
• La formación del complejo antígeno-anticuerpo puede ser reconocida y visualizada
con diferentes marcadores o sistema de marcadores.
• El núcleo celular siempre será azul (DAPI), el verde es casi siempre para la proteína
buscada, el citoesqueleto siempra va de rojo
• El campo donde se agrupan todos los colores se llaman MERGED.
Aplicaciones:
• Reconstrucción fotográfica 3D de tejidos
• Cuantificación de volumen
• Procesos cinéticos.