Electrotransferencia

ElWestern blot,inmunobloto electrotransferencia , es

una
tcnica
analtica
usada
para
detectarprotenasespecficas en una muestra determinada
(una mezcla compleja de protenas, como un extracto
tisular).

El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George

Stark, en la Universidad de Stanford. El nombre (Western,
occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette.

Tcnica
Mediante una electroforesis en gel se separan las
protenas atendiendo al criterio que se desee: peso
molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi
tantas posibilidades como tipos de electroforesis
existentes. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF)
para poder buscar la protena de inters con
anticuerpos especficos contra ella.
Mini Trans-Blot Cell

 Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por

actividad enzimtica o fluorescencia, entre otros
mtodos. De esta misma forma se puede estudiar la
presencia de la protena en el extracto y analizar su
cantidad relativa respecto a las otras protenas.

Membranas utilizadas
El nitrato de celulosa, nitrocelulosa, fulmicotn,
celuloide o algodn plvora es un slido parecido al
algodn, o un lquido gelatinoso ligeramente amarillo o
incoloro con olor a ter. Fue sintetizado por primera vez
en el ao 1846 por Christian Schnbein. Se emplea en
la elaboracin de explosivos, propulsores para cohetes,
celuloide (base transparente para las emulsiones de las
pelculas fotogrficas) y como materia prima en la
elaboracin de pinturas, lacas, barnices, tintas,
selladores y otros productos similares.

Polifluoruro de vinilideno
El polifluoruro de vinilideno o PVDF o fluoruro de
polivinilideno es un fluoropolmero termoplstico
altamente inerte qumicamente. Se suele emplear en
condiciones que requieren mucha pureza, fortaleza y
elevada resistencia a cidos, bases y disolventes, a
altas temperaturas, al envejecimiento y a los rayos
ultravioleta. Adems, es fcil de moldear en
comparacin con otros fluoropolmeros debido a su
punto de fusin relativamente bajo, 177 C.
Se emplea en la tcnica Western blot por su capacidad
para adsorber polipptidos de forma inespecfica.

 Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un

tampn de transferencia para llevar las protenas desde
el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el
orden descrito los siguientes elementos (del polo
negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios
papeles filtro empapados en buffer de transferencia,
gel, membrana, ms papeles filtro empapados y otra
esponja. Este montaje, llamado coloquialmente
sndwich. (gel de poliacrilamida)

Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse
a protenas de forma inespecfica, es preciso bloquear los
lugares de unin que han quedado libres tras la
transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de
naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede
unirse a ellos, dificultando la distincin del complejo
antgeno-antgeno que se forma con la protena que se
busca.

 En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin

de protenas, tpicamente de albmina de suero bovino
o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA).
De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su
antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y
los falsos positivos.

Detencin
En la deteccin se comprueba la presencia en la
membrana de una determinada protena. Para ello se
emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a
enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una
reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma,
se hace patente la unin con el antgeno, la protena,
as como su localizacin

Mtodo en dos pasos

Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del
anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario.
Anticuerpo primario: El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo
primario contra la protena buscada. ste se consigue inoculando dicha
protena o uno de sus eptopos.
Anticuerpo secundario: Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo
primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. ste
reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo primario.
Suelen estar marcados para ser detectables (unin a biotina, fosfatasa
alcalina o la peroxidasa del rbano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos
se unirn a cada anticuerpo primario, amplificando la seal.

luminol

Mtodo en un paso
Debido a la llegada de los anlisis de protenas de alto
rendimiento y los menores lmites de deteccin ha
crecido el inters por desarrollar sistemas de deteccin
en un solo paso que aumentaran la rapidez del proceso
al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere
un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la
protena de inters y una "etiqueta" detectable. Se
incuba de manera similar al anticuerpo primario del
proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya
se puede detectar directamente

Anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se
procede a la deteccin de aquellas que s se han unido
a la protena de inters.

Deteccin quimioluminiscente
Requieren la incubacin de la membrana con un
sustrato, que emitir luminiscencia al ser expuesto al
conjugado que trae unido el anticuerpo secundario. La
luz emitida es captada por una pelcula fotogrfica o,
ms recientemente, por cmaras CCD, que toman una
imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen
por densitometra para evaluar la cantidad relativa de
mancha y cuantifica el resultado en trminos de
densidad ptica. Actualmente hay programas que
permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican
ciertos estndares, como la obtencin del peso