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BIOQUÍMICA GENERAL

BIOQ200
BLOQUE 2

INSTITUTO DE BIOQUÍMICA y MICROBIOLOGÍA


FACULTAD DE CIENCIAS
UACH

2018
PURIFICACIÓN DE LISOZIMA

INTRODUCCIÓN
La lisozima (muramidasa) es una enzima que hidroliza los enlaces glicosídicos β-1,4 entre
residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina de un péptidoglicano que se encuentra
en la pared celular de ciertas bacterias. De esta manera la lisozima sirve como la primera línea de
defensa contra infecciones bacterianas. Lisozima se encuentra ampliamente distribuida en la
naturaleza, en animales y plantas. La lisozima que ha sido más estudiada es la lisozima de huevo
de gallina, que fue la primera enzima cuya estructura tridimensional se determinó. En mamíferos
se encuentra en secreciones como lágrimas y saliva, en leche, en ciertas células de hígado y de
riñón, etc. La lisozima de la orina humana ha sido cristalizada y caracterizada. Se ha señalado que
esta lisozima puede ser un mediador de la función anti-tumoral de macrófagos, los cuales secretan
esta enzima.
Existe gran interés en la lisozima como agente antibacteriano natural y como una ayuda en
el diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, en leucemia monocítica y mono-mielocítica se han
encontrado niveles elevados de lisozima plasmática y urinaria. La presencia de la enzima en el
fluido cerebroespinal es indicativa de tumor en el sistema nervioso central.
Tarea: Indagar acerca de características moleculares de la lisozima de huevo de gallina (PM,
estructura, punto isoeléctrico, estabilidad, etc.)

Sesión I: Purificación de la lisozima de la clara de huevo

La enzima se purificará desde un extracto de clara de huevo por cromatografía de


intercambio catiónico usando un gradiente salino. La fase estacionaria para la cromatografía es
carboximetil sefarosa, que contiene grupos –CH2-COOH unidos a un polisacárido, sefarosa, como
matriz. A valores de pH superiores a 3, estos grupos presentan una carga negativa (-CH2-COO-), y
unen a moléculas de carga neta positiva. Las proteínas de carga neta positiva son retenidas en la
columna, mientras que las proteínas de carga neta negativa o de carga neta cero no son retenidas.
El punto isoeléctrico de la lisozima es de 11, y como la cromatografía se realizará a pH 8,2, la
lisozima tendrá una carga neta positiva y se unirá a la columna. Muchas proteínas de la clara de
huevo, las cuales deseamos separar de la lisozima tienen una pI inferior a 8,2. De modo que, al
aplicar la muestra de clara de huevo en la columna, se espera las proteínas mencionadas no se
unan a la columna, eluyendo en el lavado inicial.
Para eluir la lisozima de la columna se usa un buffer de mayor concentración salina
(gradiente de elusión). Los cationes de la sal compiten por los grupos carboxilato de la CM-
sefarosa y tienden a desplazar a las proteínas unidas. Si se aumenta gradualmente la
concentración salina, las proteínas retenidas eluyen en un orden que refleja su afinidad a la
columna. Las proteínas que se unen débilmente eluyen primero, a bajas concentraciones de sal,
mientras que las proteínas que se unen fuertemente, como la lisozima, eluyen recién a una
concentración salina relativamente alta. En este práctico se usará una sola concentración de sal
para la elusión.
Tarea: Indagar acerca de la composición proteica de la clara de huevo.
Materiales

Reactivos
Buffer A: buffer Tris –HCl 50 mM, pH 8.2, conteniendo 50 mM NaCl
Buffer B: buffer Tris-HCl 50 mM, pH 8.2, conteniendo 600 mM NaCl
CM- sefarosa en buffer A

Insumos
1 Huevo fresco
Gasa

Equipamiento

Columna para cromatografía y soporte universal con pinza para tomar la columna
Pipeta plástica pasteur para llenar la columna
27 Tubos de ensayos
Vasos de precipitados,
embudo,
probeta
1 Tubo falcon de 15 ml
1 Tubo falcon de 50 ml

Procedimiento

Preparación de un extracto de clara de huevo:

1. Rompa el huevo sobre un vaso de precipitados, y deje caer la clara al vaso. Filtre la clara
de huevo a través de varias capas de gasa colocadas en un embudo (aprox. 8) hacia una
probeta.

Importante: no fuerce el paso de la clara de huevo, no aplique presión. La obtención de un


líquido que no sea vizcoso ni gelatinoso en esta etapa favorecerá la posterior
cromatografía en la columna. Después de haber colectado unos 15 ml de líquido descarte
la gasa con los residuos de clara.

2. Transfiera 10 ml del filtrado de clara de huevo a un vaso de precipitado de 100 ml y


dilúyalo con 70 ml de Buffer A. Pase esta solución a través de un embudo que contenga
lana de vidrio no muy apretada. Si observa alguna partícula sólida en el filtrado, filtre otra
vez usando una lana de vidrio más apretada. El filtrado final debe ser translúcido, no debe
contener partículas sólidas o tipo jalea. Este filtrado final se llama “extracto crudo de clara
de huevo”. Este extracto se entregará preparado.

3. Para montar la columna de CM-sefarosa cierre la llave de paso y coloque 5 ml del buffer A
en la columna. Agite el intercambiador con una varilla de vidrio para obtener una
suspensión. (Evite la formación de burbujas, ya que pueden formar grietas o canales en la
columna. Las grietas reducen el volumen efectivo de la columna, ya que el líquido tiende a
fluir preferentemente a través de estos canales, evitando el contacto de las proteínas con
la resina.)
Abra la llave de paso de la columna y comience a colocarle el intercambiador. Importante:
La superficie del lecho del intercambiador en la columna nunca se debe secar, sobre esta
superficie siempre debe quedar un poco del buffer, tanto durante el montaje de la
columna como durante la elusión.
Continúe hasta tener 3 ml de intercambiador sedimentado en la columna.

4. Mida la velocidad de flujo de su columna colectando las gotas que caen en un determinado
tiempo (ej. 5 min). El flujo de la columna debería ser de al menos 20 gotas por minuto (1
gota cada 2-3 segundos). Si el flujo es muy lento, verifique que su columna no contenga
burbujas de aire en la salida.

5. Numere 30 tubos de ensayos colocados en una gradilla (Nos 1-30). Coloque 3 ml de agua en
un tubo similar a los numerados y marque el nivel con un lápiz permanente. Luego marque
los 15 primeros tubos a este nivel. Repita lo mismo usando ahora 1 ml de agua, para
marcar los tubos del número 16 en adelante.

6. Coloque un tubo marcado como “0” bajo la columna y recoja aproximadamente 1 ml de


buffer. Este tubo permitirá conocer la absorbancia al inicio del cromatograma,
correspondiente a la ausencia de proteínas.

Aplique la muestra y lave la columna como sigue:

7. Aplique 5 ml del extracto de clara de huevo a la columna de la siguiente manera: Remueva


el exceso de buffer de la parte superior de la columna, abriendo la llave, hasta dejar
solamente 1-2 mm de tampón sobre el lecho de sefarosa. Cierre la llave. Con una
micropipeta P-1000 agregue lentamente por las paredes de la columna (para no perturbar
la resina) 5 ml de extracto de clara de huevo.

8. Coloque el tubo de ensayo rotulado con el N° 1 bajo la columna, abra la salida de la


columna y recoja las gotas dentro del tubo. Cambie al tubo N°2 cuando se completen los 3
ml de la fracción. Drene la columna hasta que 1-2 mm del extracto permanezcan sobre el
lecho de sefarosa. Cierre la salida y lave cuidadosamente las paredes interiores de la
columna con 1,0 ml de buffer A. Abra la salida y permita que el líquido llegue hasta 1-2 mm
de la sefarosa. Repita esta operación una vez más con 0,5 ml de buffer A. Cambie a un
nuevo tubo cada vez que se completen los 3 ml de fracción.

9. Coloque cuidadosamente en la columna (sin perturbar el lecho) 9 ml de buffer A. Abra la


llave y continúe colectando fracciones. Cuando sea necesario, coloque nuevamente
tampón en la columna. Colecte fracciones hasta la N°10 inclusive.

10. Elusión de las proteínas con el buffer B. Retire el resto del tampón A que pueda haber
quedado sobre la columna mediante una pipeta.
Coloque cuidadosamente en la columna (sin perturbar el lecho) 15 ml de buffer B.

11. Continúe con la colección de fracciones, esta vez de 1 ml, hasta completar 25 fracciones
totales.

12. Mida la absorbancia de las fracciones a 280 nm en una cubeta de cuarzo.


Junte en un tubo falcon las fracciones de la etapa de lavado que presenten absorbancias
≥0,050 y en otro tubo falcon las fracciones de A ≥ 0,050 de la etapa de elusión formado los
“pool”. Rotule los tubos falcon, indicando si corresponden a lavado o a elusión y coloque
su nombre. Guarde además en un tubo Eppendorf 1 ml del extracto crudo. Después de
haber efectuado la cuantificación de las proteínas, como se indica a continuación,
congele sus muestras hasta la próxima sesión. (Habrá penalización a los alumnos que
pierdan sus muestras).

Esquema de fracciones a colectar: (observación: los números de las fracciones no


corresponden al protocolo usado actualmente)

Cuantificación de proteínas totales

PROCEDIMIENTO:

La cuantificación de la concentración de proteínas se llevará a cabo por el método de


Bradford (Sección “Comparación de métodos de cuantificación de proteínas”), usando una sola
solución estándar, de concentración 100 µg/ml. Determine la concentración de proteínas en las
siguientes soluciones: 1) extracto crudo, 2) pool de lavado y 3) pool de la elusión. Si en un ensayo
obtiene una absorbancia mayor a la obtenida con el estándar, repita el ensayo con la muestra
diluída. Si es necesario diluir, informe como efectuó la dilución (volúmenes), la concentración de la
muestra diluída y la concentración de la muestra en sí.
Sesión II: Determinación de la actividad enzimática de la lisozima

Las fracciones de lisozima cruda, lavado y lisozima semi-purificada serán ensayadas para
determinar su actividad enzimática y así poder establecer el grado de pureza relativa alcanzado
para la enzima y el porcentaje de rendimiento de la cromatografía.

Fundamento del ensayo de actividad de lisozima

La actividad catalítica de lisozima puede cuantificarse gracias a su capacidad de lisar


bacterias Gram positivas tales como Micrococcus luteus. Al adicionar la muestra conteniendo la
enzima a una suspensión de bacterias liofilizadas y resuspendidas en un tampón fosfato, la lisis de
las bacterias provoca una disminución de la turbidez de la suspensión en el tiempo. El cambio de
turbidez se puede medir como cambio de absorbancia a 450 nm.
Según la definición más usada, una unidad de actividad enzimática es la cantidad de
enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato a producto por minuto en
condiciones estándar. Sin embargo, como en el caso del ensayo de actividad de lisozima no es
posible calcular micromoles de producto formado, se usa la siguiente definición:
Una unidad de actividad enzimática (U) de lisozima es la cantidad de enzima que genera un
∆A/min igual a 0,001, en las condiciones del ensayo.

Reactivos:

1. Sustrato tamponado (medio para el ensayo): Micrococcus luteus, 0,25 mg/ml suspendido
en tampón fosfato de sodio 40 mM pH 6,2, solución temperada a 25°C. (Esta solución se
debe preparar en el día del práctico).
2. Tampón fosfato de sodio 40 mM pH 6,2
3. Solución de lisozima de huevo de gallina 0,025 mg/ml.

Soluciones almacenadas a -20°C para la preparación de los reactivos:


- Solución stock de lisozima de huevo de gallina (Sigma) 50 mg/ml, disuelta en agua
destilada estéril, alicuotada.
- Micrococcus luteus liofilizado (Sigma).
- Tampón fosfato stock 0,4 M; pH 6,2 (opcional).

Procedimiento

Dilución de las muestras con tampón fosfato pH de 6,2 para el ensayo: Mezcle 10 µl del
extracto crudo con 990 µl de tampón. Para la dilución del pool de elusión y del lavado use factores
de dilución adecuados (considere los resultados obtenidos previamente). La actividad de la
solución de lisozima 0,025 mg/ml se mide sin diluir.
Se usarán los espectrofotómetros con portacubetas termoregulable y el programa para
cinéticas. Corrobore que el Peltier esté encendido y la temperatura fijada en 25°C. En la
programación del ensayo se ingresan la longitud de onda, 450 nm, los intervalos de lectura, 15
seg, y el tiempo total del ensayo, 2 min. Los espectrofotómetros estarán programados.
1.- Coloque una cubeta con agua en el espectrofotómetro y calibre presionando “Measure
Blank”. Retire la cubeta.
2.- Coloque 0,95 ml de medio para el ensayo en una cubeta, adicione 50 µl de la muestra diluída,
tape con Parafilm, mezcle por inversión rápidamente, coloque la cubeta en el instrumento y
presione “Measure Sample”.
3.- Anote el valor de ∆A/min informado por el instrumento al concluir el ensayo.

Presentación y evaluación de resultados (Informe):

Sesión I:
- Tabla de datos Absorbancia de las fracciones colectadas.
- Perfil de elusión.
- Cuantificación de proteínas totales: presente una tabla que contenga para cada muestra el valor
de la A medida, la concentración calculada directamente, la concentración calculada considerando
la dilución, el volumen y la cantidad de proteína total de la muestra. En el caso del extracto crudo
use el volumen aplicado en la columna.

Sesión II: - Ensayos de actividad enzimática: presente una tabla que contenga para cada muestra el
valor de ∆A/min obtenido, la actividad enzimática en U/ml calculada directamente y la actividad
enzimática considerando la dilución.
- Incluya en el informe además la tabla que resume los datos de la concentración de proteínas
(datos de la sesión I).
- Tabla de purificación de lisozima. Confeccione una tabla del tipo siguiente:
(Falta colocar las unidades correspondientes a cada columna).

Volumen Proteína Unidades Actividad Rendimient Veces de


Etapa
etapa total totales Específica o purificación

I…

Para confeccionar la tabla de purificación es necesario conocer los siguientes conceptos:

Actividad específica : unidades de enzima


mg de proteínas

Rendimiento (%) : unidades totales (etapa X) x 100


unidades totales (etapa de referencia)

Purificación (veces) : actividad específica (etapa X)


actividad específica (etapa de referencia)

En general se utiliza la etapa I o la actividad del extracto crudo como referencia para calcular
la purificación y el rendimiento logrado.
La actividad específica se usa como un criterio de pureza de una muestra de enzima. Así, la
actividad específica de la lisozima debería aumentar después de la cromatografía de intercambio
iónico pues se van descartando otras proteínas contaminantes.

Sesión III. Electroforesis SDS-PAGE y Electrotransferencia para la Inmunodetección (Western blot


y Dot blot) de lisozima.

El montaje y preparación de los SDS-PAGE se realizará de igual manera que en la sesión de


prácticos de Bioquímica Instrumental (Bioq251)

PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS


1.- Preparar diluciones de las muestras 1) extracto crudo de la clara, 2) pool de lavado y 3) pool de
eluído, de tal manera que al agregar 20µL al gel, se estén aplicando 20 µg de proteína total, estos
cálculos deben VENIR HECHOS, habrá penalización en la nota si los cálculos son realizados en la
sesión de práctico. Considerar en los cálculos que el buffer carga se encuentra 5 veces
concentrada.
2.- Además se incluirá en el gel una muestra correspondiente a un estándar de peso molecular
para poder determinar posteriormente el peso molecular de las proteínas purificadas en forma
experimental. Dicho estándar se entregará preparado.
3.- Seguir las indicaciones de montaje, corrida y teñido de un SDS-PAGE como lo realizó en el
BIOQ251. Aplique un potencila de 200Volt por 45 min. Ver también en: http://youtu.be/XUjLO-
ek2C8; http://youtu.be/b-1dXzU4iOw

ELECTROTRANSFERENCIA “Semi-dry blot”


1.- Utilizaremos el sistema Semi-Dry de Pierce Power-Blot, Ver también en:
https://youtu.be/7SVHqK_mFtQ

INMUNODETECCIÓN DE LISOZIMA POR WESTERN BLOT Y/O DOT-BLOT

Procedimiento:

1.- La membrana se incuba primero por 1h en BLOTTO (leche descremada 5%/PBS/Tween 20


0,05%) para bloquear los sitios inespecíficos.
2.- Luego se incuba con el primer anticuerpo monoclonal anti lisozima de pollo preparado en ratón
(dilución será informada) en el mismo Blotto y se incuba por al menos 1h.
3.- Realizar 3 lavados cortos con PBS e incubar luego por 1h más con el segundo anticuerpo
conjugado con fosfatasa alcalina (anti IgG de ratón preparado en cabra y conjugado con fosfatasa
alcalina) cuya dilución de trabajo será informada. La dilución del segundo anticuerpo se hace en el
mismo tampón que el primero.
4.- A continuación, se realizan 3 lavados cortos con PBS y se equilibra la membrana en tampón de
fosfatasa (Tris-HCl 0,1M pH 9/NaCl 0,1M/MgCl2 0,05 M) por 5 min.
5.- Finalmente se preparan 5 ml de tampón de la enzima al que se adicionan los sustratos NBT 50
mg/ml en 70% dimetilformamida (33 l por cada ml de tampón) primero, se mezcla y luego se
adiciona el BCIP 50 mg/ml en 100% dimetilformamida (16,5 l por cada ml de tampón) y vuelve a
mezclar, revelando la actividad en la oscuridad (generalmente, las bandas inmuno-reactivas
aparecen a los pocos minutos). Una vez reveladas las bandas, se detiene la reacción lavando con
agua desionizada primero y luego con EDTA 0,2 M.
Presentación de resultados (Informe):

- Presente los resultados de la electroforesis y el western-blot.


- Incluya en el informe la tabla de purificación de la lisozima (contenida en el informe de la sesión
II)