Análisis de proteínas

Western Blot

Biología Celular e Histología, 1º Grado en Biología

José Álvarez del Hoyo, Ignacio Amo Tascón, Alicia Castejón Sánchez
Índice
1. Visión general ……………………………………………………………………………1

2. Preparación de la muestra………………………………………………………………1

3. Electroforesis …………………………………………………………………………….4

4. SDS PAGE ……………………………………………………………………………….5

5. Montaje del dispositivo ………………………………………………………………….6

6. Transferencia electroforética a una membrana ……………………………………...7

7. Bloqueo de la membrana e hibridación del anticuerpo ……………………………..8

8. Detección de las bandas y análisis ……………………………………………………8

Visión general
El Western blot o inmunoblot es una técnica muy utilizada para el estudio de las
proteínas. Fue desarrollada en el laboratorio de George Stark en 1979. Su nombre le
fue dado por W. Neal Burnette debido a la analogía de esta técnica con otra que
utiliza ADN, la cual se denomina Southern blot en referencia a su descubridor, Edwin
Southern.

Para llevar a cabo un Western blot, se separan las proteínas atendiendo a su peso
molecular mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida. Tras ello, las
proteínas se transfieren a una membrana, en la cual quedan inmovilizadas.
Entonces se adicionan anticuerpos primarios que se unen específicamente a un tipo
de proteína, y posteriormente anticuerpos secundarios, que se acoplan a los
primarios. Una vez se han llevado a cabo estos procedimientos y se han eliminado
aquellos anticuerpos que no se hayan adherido a las proteínas, se utilizan distintas
técnicas de detección que permiten visualizar las macromoléculas en cuestión.

Además de sus usos en investigación, esta técnica es también útil para el

diagnóstico. Por ejemplo, el Western blot es una de las pruebas de confirmación que
se utilizan cuando la prueba ELISA para VIH tiene una resultado positivo. Para ello,
se analiza la presencia de anticuerpos contra el virus en el suero sanguíneo. Así,
también se utiliza para diagnosticar FIV en gatos, solo en el caso de que no estén
vacunados contra ello. También se utiliza en ocasiones para el diagnóstico de la
enfermedad de Lyme, pero no es un método muy preciso para este caso. Otra
afección que puede ser detectada gracias a esta técnica es la encefalopatía
espongiforme bovina; esto se dio a conocer tras su extensión en Europa, cuando fue
necesario el desarrollo de métodos rápidos de diagnóstico.

Preparación de la muestra
Antes de realizar el Western blot, es necesario extraer las proteínas mediante
procesos químicos o mecánicos. El método utilizado dependerá de el tipo de
muestra, la localización de las proteínas y las condiciones óptimas que necesite el
anticuerpo primario para reconocer el epítopo proteico.

Normalmente se requiere el uso de un proceso mecánico cuando se quieren extraer

proteínas de un tejido, tanto animal como vegetal. También es necesario en el caso
de células que posean una pared celular.

Este tipo de procesos tiene algunas desventajas. Por ejemplo, la muestra puede
calentarse, lo que llevaría a la desnaturalización de las proteínas. Además, las
diferencias entre las máquinas de cada laboratorio y la dificultad de medir las fuerza
generada hacen más difícil repetir el experimento en las mismas condiciones.
Dependiendo de las características de la muestra, tales como tamaño o
procedencia, se utilizará un método u otro. Algunos de los procesos mecánicos e
instrumentos más utilizados son:

§ Licuadora: cuando se posee una gran cantidad de tejido, este se tritura con
cuchillas rotatorias.
§ Homogenizador Dounce: se suele utilizar cuando se posee una pequeña
cantidad de tejido. La pared celular se rompe por acción de corte al hacer
pasar las células por un espacio pequeño. Además, esta técnica es útil
cuando se pretende llevar a cabo un enriquecimiento de proteínas nucleares
o mitocondriales.
§ Homogenizador de ultrasonidos: esta técnica se utiliza cuando se quieren
lisar células con un pared celular menos resistente, como bacterias u hongos.
Para ello, se utilizan ondas de sonido de alta frecuencia.
§ Pulverización en nitrógeno líquido: este método se aplica cuando se poseen
tejidos animales o vegetales, así como bacterias u hongos. Para lisar estas
células, se utiliza un mortero, y el proceso se realiza en presencia de
nitrógeno líquido, que congela la muestra y hace las células más frágiles, lo
que facilita el proceso.
§ Perlas de vidrio: se utiliza sobre todo cuando se estudian levaduras. Para
romper las células, estas se agitan en presencia de perlas de vidrio. Sin
embargo, este método puede no lisar completamente las células.

Posteriormente, se lleva a cabo un proceso químico de lisis celular, utilizando una

solución tampón que contiene detergentes, lo que rompe las membranas celulares y
solubiliza las proteínas. El objetivo de esto es enriquecer la proteína de interés en la
muestra final.

Los detergentes poseen una parte polar y otra no polar, y se pueden clasificar según
las características de la primera. Así, se denominan iónicos si la parte polar tiene
carga, no iónicos si no las poseen o zwiteriónicos si poseen carga positiva y negativa
pero la carga neta es cero.

La elección de la solución tampón y el detergente depende mayoritariamente de la

localización de la proteína que se quiere estudiar. Además, también hay que tener
en cuenta que algunos detergentes, sobre todo los iónicos, desnaturalizan las
proteínas, y deben evitarse cuando el anticuerpo solo sea capaz de reconocer a la
proteína nativa (no desnaturalizada o no reducida). Esto puede conseguirse
mediante el uso de detergente no iónicos o con el uso de una solución tampón sin
detergentes, caso en el cuál deberán utilizarse procesos mecánicos.

Las soluciones tampón y detergentes más utilizados son:

§ Tris-HCl: se utiliza cuando se quiere estudiar una proteína soluble en el

citoplasma. Puede combinarse con métodos mecánicos, como por ejemplo el
homogenizador Dounce.
 § Tris-Triton: se aplica en aquellos casos en los que se estudian proteínas
asociadas al citoesqueleto. Además se puede utilizar cuando se requiere que
la proteína no se desnaturalice, ya que los detergentes Triton son suaves y no
iónicos.
§ NP-40 y Triton X-100: son utilizados cuando se quieren extraer proteínas de
la membrana plasmática o mitocondrial, de la envoltura nuclear o cuando se
realiza un lisado de la célula completa. Se aplican en aquellos casos en los
que la proteína no debe estar desnaturalizada, ya que contiene detergentes
no iónicos. Sin embargo, debido a esto puede ocurrir que las proteínas no se
extraigan correctamente, casos en los cuales deberán utilizarse detergentes
iónicos, como los que contiene RIPA.
§ RIPA: se usa en aquellos casos en los que la proteína que se quiere estudiar
se encuentra en la membrana plasmática o mitocondrial, en la envoltura
nuclear o cuando realiza la lisis completa de la célula. Contiene múltiples
detergentes, y en aquellos casos en los que se pueda, su uso es preferible al
de NP-40 o Triton X-100, ya que al contener detergentes iónicos es más fácil
extraer completamente las proteínas.

Al producirse la lisis celular, se liberan proteasas y fosfatasas que pueden degradar

y desfosforilar las proteínas. Para evitar esto, se añaden inhibidores de estas
enzimas, los cuales variarán según el tipo de proteasa o fosfatasa cuya actividad se
quiera detener. Algunos de estos inhibidores son: aprotinina (inhibe proteasas de
serina, como la tripsina, la quimotripsina y el plasminógeno), leupeptina (inhibe
proteasas lisosomales de serina y cisteína), pepstatina A (inhibe proteasas de ácido
aspártico), PMSF (inhibe proteasas de serina y cisteína), EDTA (inhibe
metaloproteasas que requieren magnesio y manganeso) , EGTA (inhibe
metaloproteasas que necesitan calcio), β-glicerofosfato (inhibe fosfatasas de serina y
treonina) y fluoruro sódico (inhibe fosfatasas de serina y treonina).

Como medidas adicionales para evitar la degradación, desfosforilación o

desnaturalización de las proteínas, todos los procesos deberían realizar a bajas
temperaturas (unos 4º C) y evitando excesivos ciclos de congelación y
descongelación.

Una vez se ha producido la lisis celular, se debe medir la cantidad total y

concentración de proteína que hay en la muestra, de manera que pueda colocarse
en cada carril exactamente la misma cantidad. Para ello, se utilizan principalmente
tres métodos:

§ Ensayo de Bradford: en este método se utiliza el colorante azul de

Coomassie, el cual se une a las proteínas, sufriendo así un cambio de color
en condiciones ácidas, el cual tiene su absorbancia entre 465 nm (rojo) y 595
nm (azul) . Es rápido, sencillo y preciso, pero en presencia de detergentes
iónicos, sus resultados no son fiables.
 § Ensayo de Lowry: esta técnica utiliza cobre y el reactivo de Folin-Ciocalteu. El
cobre reacciona con las proteínas, y el reactivo de Folin-Ciocalteu se reduce,
formando un producto azul con una absorbancia a 750 nm. Este método es
sencillo, barato, preciso y fácil de reproducir.
§ Ensayo del ácido bincocínico (BCA): este método utiliza cobre y ácido
bincocínico. El cobre reacciona con las proteínas, produciendo iones. Estos
iones reaccionan a su vez con el ácido, formando un producto violeta con una
absorbancia a 560 nm. Esta técnica es sencilla, barata y fácil de reproducir,
pero algunos aminoácidos pueden interferir en los resultados.

Después de llevar a cabo cualquiera de estas técnicas, los resultados deben ser
analizados por equipos de lectura, como un espectrofotómetro.

Electroforesis
La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas cargadas (ácidos
nucleicos y proteínas) presentes en una muestra gracias a la carga y tamaño que
presenten las mismas. El fundamento de este método es la diferente movilidad
electroforética presentada por las macromoléculas bajo la influencia de un campo
eléctrico.

Las proteínas (macromolécula en la que se centra este trabajo) migrarán por el gel o
matriz porosa a diferentes velocidades una vez aplicado el campo eléctrico. Cuando
esta fuerza cese obtendremos bandas de proteínas situadas en diferentes lugares
de la matriz.

La posibilidad de visualización de estas bandas se debe al uso de diferentes

métodos de tinción, siendo el más frecuente el azul de Comassie.

La velocidad de las cadenas polipeptídicas depende de diversos factores como son:

intensidad del campo eléctrico, carga neta, tamaño y forma de las moléculas así
como diferentes propiedades del medio en el que se mueven (viscosidad,
temperatura, entre otras).

El desplazamiento vendrá condicionado por la carga y el tamaño. De esta manera,

recorrerán un mayor espacio aquellas macromoléculas con una carga mayor y un
tamaño menor pues presentarán menor dificultad para atravesar los poros del gel.

El sentido de desplazamiento será hacia el polo que presente carga opuesta a la de

la proteína dirigiéndose hacia el ánodo si presentan carga negativa o hacia el cátodo
en el caso contrario.
Atendiendo a qué factores utilicen principalmente para la separación distinguimos
tres tipos de electroforesis principales:

§ Nativa: tamaño y punto isoeléctrico.

§ Desnaturalizante (SDS) : tamaño
§ Isoelectroenfoque: punto isoeléctrico.

Además se puede recurrir a tres tipos de soporte distintos según cuales sean las
macromoléculas a separar:

§ Poliacrilamida
§ Agarosa
§ Almidón

SDS PAGE
La técnica electroforética más común y la utilizada para la realización del Western
Blot es SDS-PAGE. Tal y como indica su propio nombre, para esta electroforesis se
requieren geles de poliacrilamida (PAGE =Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
además de un detergente aniónico denominado SDS (dodecilsulfato sódico).

Para la formación del gel de poliacrilamida se induce la polimerización de

monómeros de acrilamida dando lugar a cadenas lineales. Para poder formar una
matriz tridimensional se requiere incluir bisacrilamida generando así puntos de
ramificación y obteniendo por tanto PAGE. PAGE es un gel que constituye una
matriz porosa siendo precisamente estos poros los que permitirán separar las
proteínas según su peso molecular. El grado de porosidad vendrá determinado por
la concentración relativa de bislacrilamida respecto a la de acrilamida. Generando
fluctuaciones en esta relación obtendremos diferentes tamaños de poro posibilitando
así la separación de muestras de proteínas diferentes.

Estas redes de bisacrilamida/acrilamida se mantienen estables gracias a reactivos

entrecruzantes (crosslinker). El más común es la N,N'-metilenbisacrilamida

Por otro lado, el detergente SDS es capaz de unirse a las macromoléculas en

cuestión en una proporción constante (1,4g SDS/g de proteína) de forma que las
mantiene desnaturalizadas.

Esto provoca que el complejo SDS-proteína suponga la opacación de la carga del

polipéptido ya que todas las proteínas se encontrarán a partir de este momento con
carga negativa por ser esta la del detergente. Existirá además una relación
directamente proporcional entre el tamaño de la proteína y el valor de dicha carga
negativa.

De esta forma las proteínas se separan por su tamaño dado que todas migrarán
hacia el electrodo positivo cuando se aplique el campo eléctrico. Es importante el
hecho de que lo harán a diferentes velocidades según el valor de la carga (la cual
aumenta con el tamaño).

Montaje del dispositivo

Presenta dos geles:

§ Stacking gel (o gel acumulador): se trata de un gel concentrador que presenta

bajo grado de reticulación (presenta baja concentración de acrilamida) y pH
ligeramente ácido (6,8). Se encuentra en la parte superior del montaje y su
función es disponer las macromoléculas procedentes de los pocillos en una
banda angosta antes de entrar en el running gel.
§ Running gel (o gel separador): se posiciona justo debajo del otro gel.
Presenta por el contrario un pH básico (8,8) y una mayor concentración de
bisacrilamida lo que provoca una estrechez de los poros. Esto hace posible
que las proteínas se separen por su tamaño de manera que las pequeñas
migren más lejos y a mayor velocidad que las mayores.

Los geles se disponen entre dos placas de plástico o vidrio. La muestra de proteínas
se inyecta en los pocillos y los geles se unen a una fuente de voltaje dando
comienzo a la electroforesis.

Si la muestra contiene proteínas de bajo peso molecular se usa un gel con alta
concentración de acrilamida y viceversa. En otros casos, puede ser que no se
conozca el tamaño de las proteínas de la muestra, para lo que se usará un gradiente
de concentración de acrilamida.

Los geles de poliacrilamida necesitan aditivos que permitan la polimerización del gel.
Tenemos por ejemplo el persulfato de amonio que requiere del TEMED
(tetrametilendiamina) para catalizar la reacción. Además, la mezcla no debe
presentar oxígeno pues este interfiere en la reacción.
Se requiere también de la adición de ẞ-mercaptoetanol o DTT (ditioltreitol) que
rompen los puentes disulfuro de las proteínas al actuar como agentes reductores.
Tanto el SDS como los reductores se añaden al dispositivo en lo que se conoce
como tampón de carga /migración.
El proceso de desnaturalización así como el de reducción hacen posible el acceso
del anticuerpo al sitio de unión del polipéptido.

Transferencia electroforética a una membrana

Una vez que las proteínas se han separado, para poder continuar con la
identificación de las mismas es necesario su transferencia a una membrana. Esto se
debe a la dificultad de manipulación producida por la fragilidad del gel y a que no es
un soporte en el que los anticuerpos queden retenidos.

Para realizar este proceso se utilizan sistemas que poseen dos electrodos de grafito
entre los que se disponen el gel con las macromoléculas procedentes de la
electroforesis y la membrana en cuestión así como dos papeles de filtro saturados
de tampón de transferencia.

El mecanismo es similar a la SDS-PAGE: se intercala una membrana entre el gel y

el electrodo positivo tal y como muestra el esquema. Los polipéptidos se adhieren a
la membrana con la misma disposición que en el gel al ascender hacia el polo
positivo pues continúan con la carga negativa proporcionada por el SDS.

El proceso puede realizarse en medio seco o húmedo siendo las ventajas y

desventajas de cada medio las siguientes:

§ Medio húmedo: factible para proteínas de alto peso molecular y, por tanto,
difíciles de transferir. Sin embargo, requiere un tiempo más largo.
§ Medio semi-seco: pese a ser más rápido acarrea el riesgo de que la
membrana se seque por completo dificultando e incluso impidiendo la
transferencia.

La membrana clásicamente utilizada es la de nitrocelulosa, aunque en los últimos

años está empezando a ser sustituida por la de polifluroro de vinilideno (PVDF) pues
esta presenta mejores condiciones. Como por ejemplo, el ser inerte a la mayoría de
los solventes y el retener de manera mucho más notable las proteínas de la
membrana.
Es de gran importancia la utilización de metanol dentro de los componentes del
tampón de transferencia si utilizamos un PVDF, esto hará que el gel no se deforme y
fortalecerá la unión de la proteína a la membrana.

Bloqueo de la membrana e hibridación del anticuerpo

Debemos bloquear en un primer paso la unión de proteínas a la membrana debido a

que estas pueden unirse en los espacios libres (de proteínas) de la membrana. Si no
realizamos este bloqueo, el anticuerpo, de naturaleza proteica, puede unirse en
estos huecos libres lo que supondrá una dificultad a la hora de distinguir el complejo
antígeno-anticuerpo.

Para bloquear, se suele usar una solución proteica, que incluye albúmina de suero
bovino, leche en polvo o caseína, y detergentes. Esta solución proteica rellena los
huecos libres, y como el anticuerpo que se usará es específico, no se unirá en estos
huecos con lo cual no nos molestarán para los siguientes pasos.

Después del proceso de bloqueo se produce el reconocimiento de una secuencia

determinada de aminoácidos por parte de anticuerpos, cuando la proteína necesita
estar plegada para ser reconocida se utilizan geles nativos para producir este
plegamiento. Los Anticuerpos Primarios pueden ser Monoclonales o Policlonales.
Los dos tipos tienen distintas propiedades y se diferencian en su síntesis. Para
producir ambos anticuerpos se inyecta un antígeno en un animal, para provocar una
respuesta inmune. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal, las células que
sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del
mieloma. Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir de suero de
animales que generalmente son mamíferos ornamentales, finalmente se purifican y
se prueban. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos (zona de
reconocimiento) del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen solo un único
epítopo de la proteína.
La afinidad del anticuerpo, la cantidad de la proteína en la muestra y la sensibilidad
del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. El periodo
de incubación óptimo es de 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC.

Detección de las bandas y análisis

Para detectar la proteína que queremos usaremos un anticuerpo unido a una

enzima, como hemos mencionado antes, que se unirá de manera específica a la
proteína produciéndose una señal, si encuentra su sustrato, pudiendo observarlo
mediante un segundo anticuerpo.
Antes de eso tenemos que llevar a cabo el lavado de la membrana de los
anticuerpos primarios que no se han unido de manera específica, para eso
usaremos TBS o T-TBS. Después de haber lavado la membrana varias veces,
usaremos un anticuerpo secundario marcado, el cual se unirá de forma específica al
anticuerpo primario.

Éste reconoce de forma específica una región concreta del anticuerpo primario, a la
cual se une, y estos secundarios suelen estar marcados para ser detectables por
diversos métodos como son el uso de la peroxidasa de rábano y la fosfatasa
alcalina.

Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, por lo que acaban
resultando en una amplificación del anticuerpo primario, y no solo eso, si no que
ahora podemos detectar al anticuerpo primario. Al igual que en el anticuerpo
primario se va a lavar la membrana y dejarla limpia de anticuerpos secundarios que
no se hayan unido.

Cabe indicar que pueden emplearse también proteínas y no anticuerpos, como las
proteínas A y G.
Hay varios métodos para detectar este anticuerpo secundario. Los métodos más
comúnmente utilizados son:

1. Quimioluminiscencia

2. Fluorescencia

3. Colorimetría

4. Análisis radiactivo

A continuación se expone una breve explicación de dichos m

1. Quimioluminiscencia: Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan

comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). La
reacción entre el enzima y el substrato produce luz, que puede ser detectada
mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de
forma digital. Los inconvenientes son que requiere una habitación oscura (película
rayos X) o sistemas de imagen caros.

2. Fluorescencia: El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo, que cuando es

excitado emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un dispositivo capaz de medir
la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de
onda apropiada. La imagen se digitaliza para su análisis. Inconvenientes: los
reactivos y el equipamiento pueden ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia.

3. Colorimetría: Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido

conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzima
convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. La
cantidad de colorante convertido es proporcional a la cantidad en la muestra. La
intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un
densitómetro. Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos, el
color se desvanece con el tiempo.

4. Análisis radiactivo: En desuso. Se coloca una película fotográfica contra el

Western blot y la actividad radiactiva del marcador que lleva unido el anticuerpo
secundario, provoca la aparición en ella de regiones oscuras, que corresponden con
las bandas de las proteínas de interés. Inconvenientes: alto precio y peligroso para
la salud.
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