Universidad Regional Amazónica Ikiam

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I
1084-02-04-05
Semestre I - 2019
Horario J: Lunes 13h15 a 15h15 Grupo 1 y 15h15 a 17h15 Grupo 1
Lugar: Laboratorio de Química

Docente: Carolina Proaño B. PhD.

Laboratorio: por definir
Atención a estudiantes: Previa cita carolina.proano@ikiam.edu.ec

Tabla de contenido
1. Políticas del curso .......................................................................................................................... 2
2. Símbolos de riesgo y seguridad ................................................................................................ 2
3. Prácticas: ........................................................................................................................................... 2
4. Informes: ........................................................................................................................................... 2
5. Materiales: ........................................................................................................................................ 3
6. Cuaderno de laboratorio ............................................................................................................. 3
7. Cronograma de prácticas ............................................................................................................ 4
8. Guía para la elaboración del informe ............................................................................................. 5
PRÁCTICA No.1. Manejo de pipetas ................................................................................................... 7
PRÁCTICA No.2 Separación de aminoácidos por cromatografía de capa fina (TLC Thin
Layer Chromatography) ........................................................................................................................... 11
PRÁCTICA No.3. Cuantificación de proteínas .............................................................................. 15
PRÁCTICA No 5. Separación de proteínas por HPLC en fase reversa (RP-HPLC) ........... 21
PRÁCTICA No. 6. Uso de herramientas de bioinformática para el análisis de secuencias
proteicas........................................................................................................................................................ 24
PRÁCTICA No 7. Hidrólisis de carbohidratos ............................................................................... 26
PRÁCTICA No 8. Estimación de valores de saponificación de grasas y aceites ................. 29
PRÁCTICA No. 9. Extracción de ADN bacteriano y reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)............................................................................................................................................................. 31
 1. Políticas del curso:
 Obligatorio uso del mandil y guantes de látex. Los mandiles deben estar rotulados con
su nombre.
 Prohibido el uso de teléfonos celulares.
 No se permite comer ni tomar bebidas dentro del laboratorio.
 Deben traer un cuaderno de laboratorio, de preferencia grapado y será únicamente para
tomar anotaciones de este laboratorio.
 Si durante la práctica debe salir del laboratorio, deberá sacarse el mandil y lavarse las
manos con jabón.
 Notifique inmediatamente al instructor si ocurre algún accidente: quemadura, heridas,
rotura de material, daño del equipo, derrame de sustancias, etc.
 Al finalizar el laboratorio debe lavar toda la cristalería usada y material usado
 Lave sus manos con agua y jabón antes y después de cada laboratorio.
 Usted es responsable del material y equipo con los que trabajará, cuídelos.

2. Símbolos de riesgo y seguridad

Leer cuidadosamente las etiquetas de los reactivos a emplear y familiarizarse con los
símbolos de riesgo o peligrosidad. Revisar las hojas técnicas, los equipos de protección,
disposición de desechos, medidas de primeros auxilios, etc.
TABLA DE SÍMBOLOS DE RIESGO O PELIGROSIDAD
RIESGO BIOLOGICO

3. Prácticas:
Cada estudiante deberá leer previamente y venir preparado para la práctica de laboratorio.
Se tomará una breve lección al inicio de la práctica.
La asistencia a los laboratorios es obligatoria. Las prácticas perdidas por inasistencia
injustificada, no podrán ser recuperadas y la nota correspondiente al informe será cero.

4. Informes:
Una vez concluida la práctica se elaborará un informe de una hoja impresa de ambos
lados, que deberá incluir las siguientes secciones: introducción, metodología, resultados,
discusión (que incluye observaciones, conclusiones y recomendaciones) y literatura citada
(Ver guía de elaboración del informe).
Los informes se calificarán sobre 10pts que equivaldrán al 20% de la nota final y serán
entregados una semana después de la finalización de la práctica o conjunto de prácticas.
Los informes atrasados serán calificados sobre una nota inferior equivalente a DOS
PUNTOS menos por cada día de retraso. Adicionalmente se calificará la calidad de sus
apuntes de laboratorio como un informe adicional.

5. Materiales:
Mandil, marcador de vidrio indeleble (punta fina y mediana), y cuaderno de laboratorio de
pasta dura y hojas cosidas por cada estudiante.
Todas las prácticas de laboratorio se trabajarán con guantes de látex y se solicita
traer un rollo de papel absorbente (de cocina) por cada grupo para la limpieza de los
mesones de trabajo. Es responsabilidad de los estudiantes traer los materiales requeridos.

6. Cuaderno de laboratorio
Para cada práctica anotar:
Día, fecha
Título
Objetivo
Descripción detallada de la metodología, incluir cálculos, figuras, etc.
Resultados descriptivos si es necesario incluir una figura o tabla.
Conclusiones
Siguiente paso (plan para siguiente experimento).
 Dejar las primeras dos hojas para la tabla de contenidos.
 No se deben dejar espacios en blanco, es recomendable escribir solo en un lado del
cuaderno, y dejar el otro por si se requieren hacer correcciones posteriores. En caso de
requerirse corregir algo, debe tacharse con una sola línea y dejarlo legible.
 Las hojas deben estar numeradas.
 7. Cronograma de prácticas:

Práctica FECHA TEMA Informe

.
1 21 octubre 2019 Manejo de pipetas X
2 Separación de aminoácidos por cromatografia X
28 octubre 2019 de capa fina
3 Cuantificación de proteínas (Bradford, X, C
11 noviembre 2019 espectrofotometría)
4 18 noviembre 2019 Separación de proteínas por electroforesis X
SDS-PAGE
5 Separación de proteínas por HPLC en fase X
25 noviembre 2019 reversa (RP-HPLC)
6 Uso de herramientas de bioinformática para el X, C
2 diciembre 2019 análisis de secuencias proteicas
7 16 diciembre 2019 Hidrólisis de carbohidratos X
8 Estimación de los valores de saponificación de X
6 enero 2020 grasas y aceites
9 Extracción de ADN bacteriano, reacción en X, C
13, 20, 27 enero 2020 cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis

X = Indica que debe presentar informe de laboratorio. Los informes son por grupo
asignando.
c = Deben traer los cuadernos de laboratorio que serán revisados.
 8. Guía para la elaboración del informe

Universidad Regional Amazónica Ikiam

Título de la práctica
Nombre:
Fecha
Longitud del informe 1 hoja de lado y lado, tamaño de letra 10 a espacio simple. Las
referencias pueden ocupar una hoja adicional. Los Informes serán calificados sobre 10
puntos tomando en cuenta los siguientes criterios:

1. Introducción (2pts)
Describir en forma breve con sus propias palabras los principios en que se basa el
experimento realizado en la práctica y cuál es su utilidad. Escribir con estilo impersonal y
en tiempo presente. La introducción debe ser breve, clara y concisa. Debe recurrirse a
bibliografía que sea actualizada y relevante para dar soporte a las ideas expresadas.

2. Metodología (2pts)
Debe explicar en forma clara y resumida el desarrollo de la práctica, utilice pasado
impersonal para redactar esta sección. Ej: Se tomaron 3 tubos de ensayo y se marcaron a la
altura de 1 y 3 cm. Esta sección NO debe relatarse como receta.

3. Resultados (2.5pts)
En esta sección debe explicarse claramente los resultados obtenidos sin analizar si salieron
bien o mal los experimentos. Es preferible utilizar tablas y figuras para resumir los
resultados. En ambos casos debe incluirse un título de tabla (en la parte superior a la tabla)
y un título de figura (debajo de la figura). En ocasiones se incluirán fotos de geles,
membranas, etc., las cuales deben ir rotuladas adecuadamente, indicando las muestras que
se colocaron en cada carril y que significado tienen las bandas que se observan. Escribir
con estilo impersonal en tiempo pasado.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 2,5% de productos

de PCR St: Estándar de peso molecular. Carril 1 y 2: controles
negativos. Carril 3, 4,5, 6 y C2: controles positivos.

4. Discusión (2.5pts)
Esta es la parte más importante del informe. En esta sección usted debe analizar (comparar
y contrastar) los resultados obtenidos en sus experimentos en relación a los resultados
esperados según la teoría. En esta sección también es importante citar las bases teóricas que
utiliza para la comparación. De igual manera debe hacer referencia a las tablas y figuras
que incluyó en sus resultados. La escritura debe ser en tiempo presente.

5. Literatura citada (1pt.)

Incluir la bibliografía de los documentos adicionales que utilizó en la elaboración de este
informe y que citó apropiadamente durante el mismo. Se recomienda utilizar bibliografía
actualizada y de preferencia de libros, libros electrónicos, artículos científicos. El presente
manual NO deberá ser citado y tampoco se aceptarán como fuente de referencia
bibliográfica páginas web no sujetas a edición especializada, como por ejemplo,
Wikipedia, Answers.com, Encarta, etc.
 PRÁCTICA No.1. Manejo de pipetas

OBJETIVOS:

 Aprender la correcta utilización de las micropipetas.

 Adquirir práctica en la transferencia de pequeños volúmenes de muestras.

INTRODUCCION:

Manejo de las micropipetas

Las micropipetas son instrumentos indispensables en el laboratorio de Biología

Molecular y Bioquímica. Están diseñadas para medir volúmenes pequeños que van desde
0.1 μl (10-4 ml) a 1 ml. Durante el curso se utilizarán micropipetas de volumen variable, es
decir que puede modificase el volumen a medir de acuerdo a necesidades específicas. Una
gran ventaja de estos instrumentos es que utilizan puntas desechables lo cual minimiza el
riesgo de contaminar las muestras con las que se trabaja.

Partes de una micropipeta

A A
A. Botón Pulsador B
C
B. Botón expulsador de puntas

C. Rueda de graduación de volumen

D. Cono de la pipeta

E. Palanca expulsadora de puntas

D
F. Punta descartable C

E
Tabla 1: Volúmenes de las puntas más comunes
C F
Relación entre el color de las Rango de
puntas y el volumen que volumen
miden Color de puntas a de las micropipetas
utilizar (μl)
Blancas 0.5-10
Amarillas 2-20
Amarillas 20-200
Azules 100-1000
 Posición de reposo
1er tope (absorber líquido)
2do. Tope (expulsar líquido)

Figura 2: Esquema de las tres posiciones de

la micropipeta

Figura 3: Procedimiento para medir un volumen

Figura 4. Exactitud vs. presición

Figura 5. El efecto de la posición de pipeteo (usando pipeta de 2-10ml)

Las pipetas se manejan siguiendo las siguientes instrucciones:

1. Presione el botón pulsador hasta el primer tope
2. La punta de la micropipeta es sumergida en el líquido a medir y se sube el botón
pulsador lentamente para absorber el líquido.
3. Dispensar el líquido en el recipiente destinado presionando el pulsador
4. Eliminar todo el líquido hasta el segundo tope. Observe la forma correcta de
dispensar el líquido.
5. Volver el pulsador a la posición inicial y expulsar la punta en un recipiente
adecuado. Observe que hay un botón específico para la expulsión.
 Precauciones que deben tomarse para no dañar el sistema interno de pistones
que posee la micropipeta:
- Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta (ponga atención en los
rangos permitidos descritos en la micropipeta).
- El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta.
- Nunca gire la micropipeta con líquido (de arriba hacia abajo).
- Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido
- Por ningún motivo dejar que la pipeta caiga bruscamente sobre el mesón de trabajo.

PROCEDIMIENTO:

Uso de pipetas
1. Se observará las diferentes micropipetas a utilizar durante las prácticas y se
reconocerá todas sus partes (Figura 1).
2. Empleando la pipeta de 100-1000l, transfiera 1ml de solución azul a un tubo de
1.5ml
3. Luego, empleando la pipeta de 20-200l transfiera 85 l de la solución azul (paso1)
a 4 tubos de 1,5ml.
4. Compare los volúmenes transferidos entre las 4 réplicas. Anote sus observaciones.
5. Ahora transfiera 1ml de solución roja a un tubo de 1.5ml.
6. Luego adicione 55l de solución roja (paso 4) a los 4 tubos con solución azul del
paso 2.
7. Compare los volúmenes y anote sus observaciones.
8. Después tome un tubo del paso 5, y transfiera 140l de solución violeta a un nuevo
tubo de 1.5. Repita el proceso con los otros 3 tubos. Anote sus observaciones.

RESULTADOS:
Registrar todas las observaciones y normas para el manejo de las micropipetas en el
cuaderno de laboratorio.

Referencias:

Trueba, G. Barragán, V., Escobar, J.C., Zapata, S. 2009. Manual de Biología Molecular.
Universidad San Francisco de Quito.
 PRÁCTICA No.2 Separación de aminoácidos por cromatografía de capa fina (TLC Thin
Layer Chromatography)
OBJETIVO:
Separar e identificar los aminoácidos de una mezcla por cromatografía de capa fina

INTRODUCCIÓN:
La cromatografía es un grupo de técnicas empleadas en la separación de compuestos
estrechamente relacionados en una mezcla. Aquí, la separación se efectúa por diferencias
en la distribución de equilibrio de los componentes entre dos fases inmiscibles, es decir, las
fases estacionaria y móvil. Estas diferencias en la distribución de equilibrio son el resultado
de la naturaleza y el grado de interacción de los componentes con estas dos fases. La fase
estacionaria es un medio poroso como sílice o alúmina, a través del cual la muestra se filtra
bajo la influencia de un disolvente en movimiento (la fase móvil). Hay una serie de
interacciones entre la muestra y la fase estacionaria y estas se han explotado bien para
efectuar la separación de los compuestos.

Cromatografía de capa fina [TLC]:

La técnica de cromatografía de capa fina (TLC) proporciona información cualitativa y, con

atención cuidadosa a los detalles, es posible obtener datos cuantitativos. La cromatografía
de capa fina es una técnica utilizada para separar e identificar compuestos de interés. Una
placa de TLC está formada por una capa delgada de sílice adherida al vidrio o al aluminio
como soporte. El gel de sílice actúa como la fase estacionaria y la mezcla de disolventes
actúa como la fase móvil. En el sistema solvente ideal, los compuestos de interés son
solubles en diferentes grados. La separación resulta del equilibrio de partición de los
componentes en la mezcla.

En la forma más sencilla de la técnica, se aplica una zona estrecha o un punto de la mezcla
de muestra que se va a separar cerca de un extremo de la placa de TLC y se deja secar.
Luego, la tira o placa se coloca con este extremo sumergiéndose en la mezcla de solventes,
teniendo cuidado de que la mancha / zona de la muestra no se sumerja en el solvente. A
medida que el solvente se mueve hacia el otro extremo de la tira, la mezcla de prueba se
separa en varios componentes. Esto se conoce como el desarrollo de placas de TLC.
La separación depende de varios factores:
(a) Solubilidad: cuanto más soluble es un compuesto en un solvente, más rápido se moverá
hacia arriba de la placa
(b) Atracciones entre el compuesto y la sílice, cuanto más interacciona el compuesto con la
sílice, menor es el movimiento
(c) Tamaño del compuesto, cuanto más grande es el compuesto, más lento sube la placa

La placa se retira después de un tiempo de desarrollo óptimo y se seca, y las manchas /

zonas se detectan utilizando un reactivo de localización adecuado. Una característica
importante utilizada en la cromatografía de capa fina es el valor de Rf.
 Distancia migrada de a sustancia desde el origen
RF= ------------------------------------------------------------------
Distancia migrada del solvente desde el origen

Separación cromatográfica de aminoácidos:

El presente experimento emplea la técnica de cromatografía en capa fina para separar los
aminoácidos en una mezcla dada.

Los 20 aminoácidos comunes son -aminoácidos. Tienen un grupo carboxilo y un grupo

amino unidos al mismo átomo de carbono (el carbono α). Se diferencian entre sí en sus
cadenas laterales, o grupos R, que varían en estructura, tamaño y carga eléctrica. La
interacción de los aminoácidos con la fase estacionaria como la sílice varía dependiendo de
sus grupos 'R'. El aminoácido que interactúa fuertemente con la sílice será transportado por
el solvente a una pequeña distancia, mientras que el que tenga menos interacción se moverá
más lejos. Al ejecutar controles [compuestos conocidos] al lado, es posible identificar los
componentes de una mezcla.

Como los aminoácidos son compuestos incoloros, la ninhidrina se usa para detectarlos.
Para identificar esto, después del desarrollo, la placa de TLC se pulveriza con reactivo de
ninhidrina y se seca en un horno, a 105 ° C durante aproximadamente 5 minutos. La
ninhidrina reacciona con α- aminoácidos que dan lugar a manchas de color púrpura [debido
a la formación del complejo: la púrpura del Rheumum] Los valores de Rf pueden calcularse
y compararse con los valores de referencia para identificar los aminoácidos.
El valor de Rf para cada compuesto conocido debe permanecer igual siempre que el
desarrollo de la placa se realice con el mismo disolvente, tipo de placas de TLC, método de
manchado y exactamente en las mismas condiciones.

PROCEDIMIENTO:
1. Vierta la mezcla de solvente en un vaso de precipitación de 50ml y tápelo con un
vidrio reloj o una caja Petri.
2. La cámara no debe ser perturbada durante unos 30 minutos para que la atmósfera
del recipiente se sature con el disolvente.
3. Tome una placa de TLC y con un lápiz (nunca use un bolígrafo) dibuje suavemente
una línea recta a través de la placa aproximadamente 0.5 cm desde la parte inferior.
La placa debe ser manipulada con una pinza o por los bordes. Sobre la línea marque
5 puntos equidistantes donde colocará las muestras.
4. Usando un tubo capilar coloque una gota de Glicina en el primer punto. Y séquela
con la ayuda del secador de cabello.
5. Repita el procedimiento del punto 4 al adicionar una gota de Arginina, Triptófano y
Tirosina. Deje secar entre cada aminoácido. Recuerde que debe proporcionar
suficiente espacio entre las muestras.
6. Coloque la muestra desconocida X en el último punto y deje secar.
7. Coloque la placa de sílica en el vaso de precipitación con el solvente lo más
uniformemente posible e inclínela contra el lado (sumerja la placa de manera que la
línea esté por encima del solvente). Permita que la acción capilar arrastre el solvente
hacia la placa hasta que esté aproximadamente a 1 cm del final.
8. Retire la placa e inmediatamente dibuje una línea de lápiz en la parte superior del
solvente.
9. Debajo de una campana, seque la placa con la ayuda de un secador de pelo.
10. Rocíe la placa seca con reactivo ninhidrina.
11. Secar las placas en horno de aire caliente a 105 ° C o sobre el bloque térmico a
105°C durante 5 min. La ninhidrina reaccionará con las manchas difuminadas de los
aminoácidos y las hará visibles como manchas de color púrpura.
12. Después de un tiempo, marque el centro de los puntos, luego mida la distancia del
centro de los puntos desde el origen y calcule los valores de Rf.
Reactivos:
Ninhidrina 0.2% en acetona
Triptófano y tirosina al 2% disolver en base (KOH / NaOH)
Glicina y Arginina al 2% disolver en agua
REFERENCIAS
AmritaVirtual Lab Collaborative Platform. 2018. Separation of Amino Acids by Thin
Layer Chromatograhy. [en línea]. AMRITA. Disponible en:
http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=63&sim=154&cnt=1 Consultado: 24 octubre 2018.
 PRÁCTICA No.3. Cuantificación de proteínas

OBJETIVOS:
 Elaborar una curva de calibración empleando reactivo de Biuret, reactivo de
Bradford y Absorbancia
 Determinar la concentración proteica de una muestra desconocida empleando los 3
métodos
INTRODUCCION:
La determinación de la concentración de proteínas es esencial en todos los aspectos de los
estudios de proteínas y proteómica. Existen una amplia variedad de ensayos disponibles para
este fin, entre ellos el ensayo de Biuret, Bradford y la lectura de la absorbancia a 280nm.
El principio del ensayo de Biuret es que en condiciones alcalinas, los iones cúpricos (Cu2+)
del reactivo se quelaban con los enlaces peptídicos de las proteínas, es decir formando un
complejo entre proteínas y el cobre, reduciendo los iones cúpricos (Cu2+) a iones cuprosos
(Cu1+). El complejo formado adquiere un color púrpura cuya absorbancia puede medirse a
540nm y es proporcional a la concentración de la proteína. El ensayo de Biuret permite medir
concentraciones entre 5-160mg/ml.
El ensayo de Bradford es más rápido y más sensible. Permite medir concentraciones de 25-
2000g/ml y se usa para medir la concentración de proteína total en una muestra. El principio
de este ensayo es que la unión de las moléculas de proteína al colorante de Coomassie en
condiciones ácidas produce un cambio de color de marrón a azul. Este método realmente
mide la presencia de los residuos de aminoácidos básicos, arginina, lisina e histidina, que
contribuyen a la formación del complejo proteína-colorante. La lectura se realiza a 595nm y
es proporcional a la concentración de proteínas.
Un método más directo para determinar la concentración de una proteína es la lectura de la
absorbancia de la muestra a 280nm. Las proteínas en solución absorben la luz ultravioleta
con máximos de absorbancia a 280 y 210nm. Los aminoácidos con anillos aromáticos
(tirosina y triptófano) son la razón principal del pico de absorbancia a 280 nm mientras que
los enlaces peptídicos son los principales responsables del pico a 210 nm. Es un método muy
sencillo sin embargo la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína pueden
afectar la absorbancia, por lo tanto, factores como el pH, la fuerza iónica, etc. pueden alterar
el espectro de absorbancia.
PROCEDIMIENTO:

Preparación de diluciones para la curva de calibración.

1. Coloque 5 tubos pequeños en una gradilla.

 2. Empleando la solución stock de 8mg/ml de Albúmina de Suero Bovino prepare 2 ml
de la proteína diluida en solución salina hasta obtener las siguientes concentraciones:
8 mg/ml, 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml

Ensayo de Biuret

1. Coloque 6 tubos grandes en la gradilla y rotúlelos con las distintas concentraciones de

proteína que preparó anteriormente. El tubo adicional es para la muestra desconocida.
2. Coloque 1ml de cada dilución proteica en su respectivo tubo.
3. En el tubo 6 coloque 1ml de la muestra desconocida
4. Añada 2ml de reactivo de biuret en cada tubo y homogenice la solución.
5. Deje reaccionar por 10 min a temperatura ambiente.
6. Lee la absorbancia a 550nm empleando una cubeta de plástico, primero lea un encere
el equipo empleando solución de 2ml de biuret y 1 ml de solución salina en lugar de
dilución proteíca. Luego lea sus muestras.

Ensayo de Bradford
1. Coloque 6 tubos grandes en la gradilla y rotúlelos con las distintas concentraciones de
proteína que preparó anteriormente. El tubo adicional es para la muestra desconocida.
2. Coloque 100ul de cada dilución proteica en su respectivo tubo.
3. En el tubo 6 coloque 100ul de la muestra desconocida
4. Añada 2ml de reactivo de Bradford en cada tubo y homogenice la solución.
5. Deje reaccionar por 5min en oscuridad.
6. Lee la absorbancia a 595nm empleando una cubeta de plástico. Primero encere el
equipo empleando una solución de 2 ml de Bradford y 0.1ml de solución salina. Luego
lea sus muestras.

Absorbancia 280nm
1. Coloque 1ml de solución salina (diluyente) en el espectrofotómetro y encere el equipo.
2. Coloque el remanente de cada dilución del péptido en una cubeta de cuarzo y lea la
absorbancia a 280nm. Repita el procedimiento con cada dilución empezando de la más
diluida a la más concentrada. Recuerde encerar el equipo primero empleando solución
salina.

RESULTADOS:

Lea las absorbancias de los tres ensayos.

Con cada ensayo realice una curva de calibración ABS vs. Concentración. Obtenga una
línea de tendencia y luego la ecuación de la recta con su R2, el cual debería ser cercano a
1. Calcule la concentración de la muestra desconocida empleando los tres métodos y
compare los resultados.
REFERENCIAS:

Carprette, David 1995. Biuret Protein Assay. Experimental Biosciences. [en línea] V. 12
junio 2015. Rice University. Disponible en:
https://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/biuret.html Fecha. 14-11-2018.

He, F. (2011). Bradford Protein Assay. Bio-protocol Bio101: e45. DOI:

10.21769/BioProtoc.45.

Carprette, David 1995. Quantifying protein using absorbance at 280nm. Experimental

Biosciences. [en línea] V. 12 junio 2015. Rice University. Disponible en:
https://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/biuret.html Fecha. 14-11-2018.
 Práctica 5. Separación de proteínas con SDS-PAGE
Objetivos

 Conocer los fundamentos de la separación de proteínas mediante SDS-

PAGE
 Familiarizarse con el manejo y preparación de geles de poliacrilamida
 Separar proteínas localizadas en el plasma sanguíneo
Introducción

Una de las técnicas aplicadas en la separación de proteínas es la electroforesis en gel de

poliacrilamida (PAGE) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico
(SDS). Las técnicas electroforéticas se fundamentan en la migración de partículas
cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico dónde las moléculas tienden a migrar
hacia un cátodo o un ánodo dependiendo de la carga que posean. En la preparación del
gel, se da una polimerización de los monómeros de acrilamida produciendo cadenas
lineales. Al incluir bisacrilamida, ésta da lugar a puntos de ramificación en el polímero,
lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El
tamaño de los huecos o poros que forma la retícula del polímero depende de la
concentración de acrilamida y de la proporción de bisacrilamida con respecto al total.

Por otro lado, el SDS es un detergente de acción desnaturalizante que se une a las
cadenas polipeptídicas desnaturalizadas en una proporción masa-masa de 1.4 g SDS/g de
proteína. La unión de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de
proteína y otorga al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo
que todas las proteínas acomplejadas con SDS viajen hacia el ánodo. El gel SDS PAGE
se puede dividir en gel de apilamiento y gel de separación, conteniendo el primero,
acrilamida al 5%, se vierte sobre el gel de separación (después de la solidificación) y se
inserta un peine de gel en el gel de apilamiento. El porcentaje de acrilamida en el gel
SDS PAGE depende del tamaño de la proteína objetivo en la muestra (Tabla 1).

Tabla 1. Rango de separación de proteínas según porcentaje de acrilamida

Porcentaje de acrilamida Rango de separación (tamaño)
15% 15-45 kDa
12.5% 15-60kDa
10% 18-75kDa
7.5% 30-120 kDa
5% 60-212kDa

Procedimiento:

Preparación de las muestras

Plasma sanguíneo
1) Extraer 5ml de sangre y centrifugarla a 2500g por 5min
2) Con una pipeta retirar el suero y transferirlo a un tubo de 1.5ml

18
 3) En un tubo de 1.5ml colocar: 640ul de agua, 350ul de buffer de carga (Tris
1.124M, azul de bromofenol 0.003M, glicerol 20%, SDS 10%, b-mercaptoetanol
10%) y 10ul de suero sanguíneo.
4) Homogenizar la muestra en el vórtex 10 segundos.
5) Calentar a 100°C por 5 min en el termobloque.

Preparación de los geles:

Gel separador (resolución) 10% 8ml
1) Empleando vidrios y separadores prepare el “sánduche” para el SDS-PAGE.
Verifique no haya fugas. Ensamble el sánduche en la cámara de electroforesis.
2) Medir 3.2 mL de agua destilada, 2.67mL de acrilamida 30%, 2ml de Tris-HCl 1.5M
pH8.8, 80ul SDS, 80ul de persulfato de amonio recién preparado y 8ul de TEMED
en un vaso de precipitación. Agite suavemente sin generar burbujas.
3) Degase la solución.
4) Coloque rápidamente el gel en el interior del sánduche de vidrios dejando un espacio
en la parte superior (aprox 1.5ml) para colocar después el peine.
5) Adicione muy despacio 2ml de agua en la superficie para que polimerice el gel. La
polimerización require aproximadamente 20-30min.

Gel de apilamiento 4% 5ml

1) Retire el agua que colocó en el paso 5. Solo debe girar el gel para que el agua escurra.
2) En un vaso de precipitación coloque 3ml de agua, 0,67ml de acrilamida 30%, 1.25ml
de Tris-HCl 0.5M pH6.8. Adiciones 50ul de SDS 10%, 50ul de persulfato de amonio
10% y 5u de TEMED.
3) Rápidamente coloque la solución sobre el gel resolutivo y coloque el peine.
4) Deje polimerizar 20min.

Preparación de las muestras y corrida del gel

1) Armar la cámara incluyendo el gel de poliacrilamida formado.
2) Adicionear buffer de corrida (Tris 0.025M, Glicina 0.192M, SDS 0.1%, pH8.3) en
la parte inferior de la cámara hasta la marca.
3) Adicionar buffer de corrida en la cámara interna del equipo
4) Colocar 5µl de marcador de peso molecular de amplio rango en el primer pocillo.
5) Colocar 10ul de marcador de peso molecular preteñido en el pocillo siete (7)
6) Coloque 20ul de las muestras preparadas anteriormente: Saliva, sangre, extracto de
hoja, veneno A y veneno B.
7) Tapar la cámara (rojo con rojo, negro con negro)
8) Conecte los electrodos a la fuente de poder y corra el gel a 150V, 250mAmps
durante 30min o hasta que azul del tampón de muestra llegue a 1cm antes de
terminar el gel.

Tinción /destinción
1) Sacar el gel de las placas de vidrio y colocarlo en una tarrina.
2) Cubrir el gel con solución de tinción (comassie blue 0.25g , ácido acético 10ml,
etanol 45ml, y agua 45ml)
9) Coloque en el microondas 5min a máxima potencia. El gel se teñirá azul
10) Coloque el gel en la incubadora con agitación por 15min.
11) Retire la solución de tinción y colóquela en un recipiente para reusar la solución.

19
 12) Adicione abundante agua destilada y colóquelo en el microondas por 15min a
máxima potencia.
13) Cambie el agua, y repita el paso 12 por 5 min.
14) Luego de esto deberían visualizarse algunas bandas y deje agitándose 15minutos
más.
15) Deje agitándose por varias horas más hasta que el gel este totalmente transparente y
las bandas bien teñidas.
16) Tome una fotografía del gel.

Análisis
1) Mida la distancia desde el pocillo hasta el punto de migración de cada banda.
2) Realice una curva de calibración entre Log (peso molecular) vs. Distancia migrada.
3) Genere una línea de tendencia y el R2 que debe ser cercano a 1.
4) Calcule el peso de algunas proteínas evidenciadas en la electroforesis e
identifíquelas basándose en el tipo de muestra y su peso molecular.

Referencias:
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2009). Principios de bioquímica de Lehninger. Omega.

Bastos, A. C., Orozco, E. C., & Loría, L. C. Electroforesis en gel de poliacrilamida para
la determinación del peso molecular de proteínas plasmáticas y su importancia.
Disponible en:
https://www.academia.edu/33729199/Electroforesis_en_gel_de_poliacrilamida_para_la
_determinaci%C3%B3n_del_peso_molecular_de_prote%C3%ADnas_plasm%C3%A1ti
cas_y_su_importancia Consultado Noviembre de 2018 de.

Sino Biological Inc. 2004-2013. SDS-PAGE preparation. [on línea] Assay protocol
Disponible en: http://www.assay-protocol.com/molecular-
biology/electrophoresis/denaturing-page. Consultado Noviembre 2018

20
 PRÁCTICA No 5. Separación de proteínas por HPLC en fase reversa (RP-HPLC)

OBJETIVOS
 Conocer los fundamentos de la separación de proteínas mediante HPLC
en fase reversa (RP-HPLC)
 Familiarizarse con los componentes del equipo de R-PHPLC
 Separa una mezcla completa mediante HPLC

INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método analítico utilizado en la separación e identificación
de los componentes químicos de una determinada muestra cuyo fundamento se basa en
las diferencias de las velocidades a las cuales las moléculas son desplazadas por una fase
móvil (gaseosa o líquida) a través de una fase fija, conocida como fase estacionaria.
(Skoog, West, Holler, & Crouch, 2015) La cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) es un tipo de cromatografía en columna que bombea una mezcla de muestra o
analito en un disolvente (conocido como la fase móvil) a alta presión a través de una
columna (fase estacionaria) (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2015). Los componentes de
un equipo HPLC se visualizan en la figura 1. Inicialmente este tipo de cromatografía se
utilizaba para separar compuestos polares, siendo la fase estacionaria apolar e hidrofóbica
mientras que la fase móvil poco polar. Así los analitos polares, debido a que no interactúan
con la fase estacionaria, efluyen más rápido. Una variante de esta técnica se dio al revertir
la polaridad de las fases dando lugar a la cromatografía de fase reversa; aquella en la que
la fase estacionaria no es polar y la fase móvil es polar. Así, a la primera modalidad de
cromatografía se le empezó a conocer como cromatografía de fase normal y segunda, de
fase reversa. (Ezquivel, &Leal, 2004).
Siendo más rigurosos en cuanto a la teoría de fase reversa, la fase estacionaria
consiste en una matriz porosa e insoluble a la que se le han unido químicamente
compuestos hidrofóbicos. La mayoría de los soportes utilizados son de sílica rígida
porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 micras. Por otro lado, equipos de HPLC
modernos están equipados con uno o más reservorios de disolvente de un mínimo de 500
mL. (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2015) Si la elución de una mezcla se realiza solo
con 1 disolvente o una mezcla de disolventes de composición constante, se denomina
elución isocrática. Si se utilizan 2 o más disolventes que difieren en la polaridad y su
composición varía en la separación se denomina elución por gradiente el cual mejora la
eficiencia de la separación. (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2015) El isopropanol es un
disolvente con alto poder de elución, sin embargo, tiende a incrementar su viscosidad
dando como resultado una baja transferencia de masa del soluto entre las fases. Por otro
lado, el acetonitrilo y el metanol son los solventes más comunes puesto que ambos tienen
baja viscosidad además de que no absorben luz UV (Ezquivel, &Leal, 2004).

21
Figura 1: Esquema general de los componentes de un equipo HPLC. Tomado de ©Intek
Group SAS

PROCEDIMIENTO
Solventes:
1. Preparar una solución de Agua y ácido trifluoroacético (99.95/0.05 V/V) la
llamaremos solución A
2. Preparar una solución de Acetonitrilo y Ácido trifluoroacético (99.95/0.05 V/V)
la llamaremos solución B
3. Preparar una solución de metanol y agua (20/80 V/V)
4. Cada una de las soluciones debe ser filtrada empleado un filtro de 0,45um.
5. Colocar los solventes en el HPLC y encender el sistema de bombas para pasar
fluido por el sistema: Solución A 50%/solución B 50%, a un flujo de 1ml/min por
10 min. Luego cambiar a 100% de agua por otros 10min hasta que se estabilice la
señal.

Muestra
6. En un tubo de 1.5ml pesar 1mg de secreción de la piel de la rana Agalychnis
spurrelli y disolverla en 1ml de agua tipo 1.
7. Meclar en el vórtex por 5 minutos.
8. Centrifugar a 13300rpm por 5minutos.
9. Retirar el sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo
10. Repetir el centrifugado del paso 7
11. Retirar el sobrenadante y transferirlo a un tubo para HPLC
12. Alternativamente se puede disolver la muestra y filtrar con un filtro de jeringa de
0,22um.
13. Colocar la muestra en el automuestreador.
14. Programar en el HPLC los parámetros de volumen de inyección: 20ul, velocidad
de flujo 1ml/min, modo de detección y gradiente.
15. Programar el gradiente que se desea emplear:
Tiempo min Solución A (H2O/TFA) Solución B (Acetonitrilo/TFA)
0 100% 0
3 70% 30%
75 20% 80%

22
 85 20% 80%

16. Modo de detección dual: 214nm y 280nm

17. Una vez programados el gradiente, volumen de inyección, modo de detección y
velocidad de flujo, analizar la primera muestra o analito.
18. Observar el desarrollo de los primeros picos.

REFERENCIAS

Ezquivel, E. &Leal, L. (2004). Métodos fisicoquímicos en Biotecnología

CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA. Universidad nacional autónoma de
México.
Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., & Crouch, R.S.(2015). Fundamentos de Química
Analítica. México. Cengage Learning.
Verde Calvo, J. R. (1999). Manual de prácticas de química analítica II. Universidad
Autónoma Metroplitana..

23
 PRÁCTICA No. 6. Uso de herramientas de bioinformática para el análisis de
secuencias proteicas

OBJETIVOS
 Adquirir destreza en el análisis de secuencias proteicas
 Familiarizarse con las herramientas y bases de datos alojadas en NCBI y Expasy
INTRODUCCIÓN
Bioinformática hace referencia al uso de las tecnologías computacionales y la
estadística para el análisis de datos biológicos con la finalidad de organizar dichos datos
en bases de datos, desarrollar herramientas que posibiliten el análisis y la interpretación
de estos. Uno de los intereses en materia de análisis de datos biológicos es comparar una
secuencia nueva de una proteína con secuencias previamente caracterizadas. (Salinas &
Lisbona, 2016) Para esto, se ha desarrollado programas como BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) que posibilita alineamiento de secuencias (ADN, ARN o
proteínas) ADN o de proteínas, que puede comparar una secuencia problema con otra
secuencia o con todas las secuencias que se encuentren en una base de datos (como por
ejemplo la base de datosbde Refseq) BLAST fue creado y es mantenido por el NIH
(National Institutes of Health) a través del NCBI (National Center for Biotechnology
Information) (Salinas & Lisbona, 2016)
Por otro lado, ExPASy (Expert Protein Analysis System), es un servidor de
proteómica del Instituto Suizo de Bioinformática (Swiss Institute of Bioinformatics, SIB)
que analiza secuencias y estructuras de proteínas y 2D-PAGE, aunque también ofrece
análisis de transcriptómica, genómica, entre otros. Este sitio web direcciona a varias bases
de datos como UniProtKB (Información funcional de las proteínas), UniProtKB/Swiss-
Prot (base de datos de secuencias proteicas), World-2DPAGE Repository (datos de
proteómica en gel relacionados con la identificación de proteínas publicados en la
literatura). También proporciona herramientas, siendo algunas: BLAST, ClustalW
(alineamiento múltiple se secuencias), CFSSP (predicción de la estructura secundaria),
YASARA (modelamiento molecular) y Compute PI/MW (determinación del PI y el peso
molecular) (Artimo et al., 2012)

PROCEDIMIENTO
Uso de herramientas y bases de datos de NCBI
1) Ingresar al portal http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2) Familiarizarse con el alineamiento local (BLAST)y las bases de datos de
proteínas
3) Organizar sus resultados de manera que puedan ser presentados en su informe

Uso de herramientas y bases de datos de Expasy

1) Ingresar a https://www.expasy.org/ y seleccionar la categoría de proteómica
2) Conocer el uso y funcionamiento de las bases de datos alojadas en este sitio
web.
3) Familiarizarse con las herramientas de Expasy
4) Organizar sus resultados de manera que puedan ser presentados en su informe

24
REFERENCIAS
Artimo P, Jonnalagedda M, Arnold K, Baratin D, Csardi G, de Castro E…Stockinger H.
(2012) ExPASy: SIB bioinformatics resource portal, Nucleic Acids Res, 40(W1): W597-
W603
Salinas, J. C., & Lisbona, F. J. Y. (2016). Manual de prácticas de Bioinformática (Vol.
5). Universidad Almería.

SECUENCIAS PARA ANALIZAR

>CCKP-1
AVSAECARYGLACNKMLAPVCGTDGTTSNQCMLCYYNRKNKKNIEIRSRGRC

>CZS-18
GFLDLVKHVGKATGKAALNAVTEMVNQGEYPKLRKCKI

>DRS-CC1
GLWSIIKTVGKLAAKEAAKAAGKAALNTVAEKVNE-amina

>CC-long peptide-CC1
NLWNVIKTVGKQAAKTAAKAAAKAAAKAAAKAAAKIALNKIVEKISGADQES

PROGRAMAS:
Peptide mass calculator v3.2 http://www.bachem.com/service-support/peptide-
calculator/
Calculo de propiedades fisicoquímicas ( http://www.bachem.com/service-
support/peptide-calculator/
SOPMA (predición de estructura secundaria) https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html
Heliquest (predicción de hidrofobicidad) http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-
bin/ComputParams.py
Swiss-model (predicción de estructura terciaria) https://swissmodel.expasy.org/

25
 PRÁCTICA No 7. Hidrólisis de carbohidratos

OBJETIVOS
 Conocer los fundamentos de la hidrólisis de carbohidratos
 Evidenciar azúcares reductores mediante el uso del reactivo de Fehling
 Identificar las reacciones que ocurren durante y después de la hidrólisis del
almidón

INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos, glúcidos o hidratos de carbono, son biomoléculas que
desempeñan un papel fundamental en la dieta humana aportando un 40-75% de la ingesta
energética (FAO, 2019). Un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos más
simples se denominan monosacáridos. Si la hidrólisis de estos compuestos
(descomposición a su forma más simple) da dos moléculas de monosacárido se llama
disacárido, si se obtiene más de 2 moléculas como resultado de la hidrólisis se le atribuye
el nombre de polisacárido. Hay diversas formas de hidrolizar carbohidratos. Una de ellas
es la hidrólisis ácida en la cual, un ácido prótico se utiliza para catalizar la escisión de un
enlace químico a través de una reacción de sustitución nucleofílica, con la adición de
agua. Otro método es por conversión enzimática en la que está involucrada la acción
catalítica de hidrolasas, las cuales rompen uniones covalentes y saturan las valencias
libres aprovechando los componentes de la molécula de agua (Montes, Vázquez & Rosas,
2018)
El almidón es un glúcido compuesto por cadenas de glucosa, las cuales se unen
formando 2 moléculas: amilosa y amilopectina. El lugol es un compuesto de yodo y
yoduro de potasio utilizado para la identificación del almidón en una muestra ya que las
unidades de amilosa forman un complejo en el que rodean una cadena de seis moléculas
de yodo. Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes
oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta característica radica en la presencia de
un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Hay varios
reactivos utilizados para reconocer la presencia de un azúcar reductor en una muestra
(almidón en este caso). Uno de estos es el reactivo de Benedict, el cual se compone de
sulfato de cobre ll, citrato de sodio y carbonato de sodio. Al encontrarse en un medio con
agente reductor, como la glucosa, éste se reduce y cambia su coloración azul característica
en estado acuoso, a un precipitado como cobre l de color rojo. Otro reactivo utilizado es
el reactivo de Fehling, mismo que se basa en el poder reductor del grupo carbonilo de un
aldehído que pasa a ácido reduciendo la sal cúprica de cobre (II), en medio alcalino, a
óxido de cobre (I). Éste forma un precipitado de color rojo (Herrera, Bolaños, Lutz &
Giselle, 2009)
Otras pruebas como la prueba de Tollens que permite distinguir un aldehído de una
cetona: se mezcla un agente oxidante suave con un aldehído o una cetona desconocida; si
el compuesto se oxida, es un aldehído, si no ocurre reacción, es una cetona. Por otro lado,
la prueba de Barfoed sirve para el reconocimiento de monosacáridos. En medio ácido, tan
sólo los monosacáridos son capaces de reducir el Cu2+ a Cu+. El Cu+ así producido reduce
al ácido fosfomolíbdico a un complejo de intenso color azul oscuro (Guarnizo Franco, &
Martínez Yepes, 2009)
.

26
PROCEDIMIENTO

1. Prueba de yodo para almidón

Reactivos:
• Solución de almidón al 1%, usado en las pruebas anteriores.
• Solución de yodo: 1 g de yodo, solución de KI al 2%.
Procedimiento:
1. Rotule 3 tubos de ensayo A, B y C. Coloque los reactivos según se indican en la
tabla 1.
Tabla 1. Preparación de mezclas para la prueba de yodo.
Tubo No. Agua (mL) Almidón al Solución de Observación Observación
1% (mL) yodo (gotas) 70°C

A 5 5 1
B 5 1 1
C 5 0 1

2. Agitar muy bien los tubos y notar la diferencia de color.

3. Colocar los tres tubos en un baño de agua caliente (70 °C), por 10 minutos y
observar cualquier cambio de color. Anotar el resultado.
4. Enfriar los tubos y observar nuevamente. Anotar el resultado.

2. Hidrólisis del almidón

Reactivos:
• Ácido clorhídrico (HCl) 1M
• Solución de yodo, usado en la prueba anterior.
• Reactivo de Fehling A
• Reactivo de Fehling B
Procedimiento:
1. Rotule 4 tubos: 0, 15, 30, 45. Y un tubo adicional como tubo D.
2. Colocar 10 mL de una solución de almidón al 1% en un tubo de ensayo marcado
D. Añada 3 ml de HCl y agitar bien
3. En el tubo marcado 0 coloque 2 ml de solución del tubo D y añada una gota lugol.
Anote las observaciones.
4. Coloque el tubo D a baño maría 100°C para que se hidrolice por 15min.
5. Retirar 2ml de solución del tubo D y colóquelo en el tubo marcado 15, luego
realice la prueba de lugol añadiendo una gota de lugol. Anote las observaciones.
6. Repita el procedimiento del paso 4 y 5 cada 15 minutos. Continúe la hidrólisis
hasta obtener una prueba de yodo negativa.
7. Posteriormente y para confirmar la presencia de glucosa, efectúe la prueba de
Fehling. Para ello añadir 2 ml de Fehling A (CuSO4) y 2 ml de Fehling B
(Tartrato/NaOH) a cada tubo: 0, 15, 30, 45 Agitar y calentar a ebullición
(aproximadamente 10 min). Si se reduce el cobre se forma un precipitado de Cu2O
de color rojizo.

27
REFERENCIAS
Guarnizo Franco, A., & Martínez Yepes, P. (2009). Experimentos de química
orgánica con enfoque en ciencias de la vida. Armenia: Ed. Elizcom. p, 220
Herrera, C.; Bolaños, N.; Lutz, Giselle. (2003). Química de Alimentos, manual de
laboratorio. (1ra edición) (págs. 10,12). Editorial de la Universidad de Costa Rica.
Recuperado de:
https://books.google.com.co/books?id=8VpJ8foyDiIC&pg=PA12&dq=reactivo+de+ben
edict&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwiDsaHr2f3KAhVEJh4KHQGWDHwQ6AEIGzAA
#v=onepage&q&f=false
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), 2019. Los
Carbohidratos En La Nutricion Humana (Estudios Fao Alimentacion y Nutricion).FAO.
Recuperado de
https://books.google.com.ec/books?id=FZ_ed5pkNdoC&dq=hidr%C3%B3lisis+de+car
bohidratos&source=gbs_navlinks_s
Montes, F. M., Vázquez, J. P. P., & Rosas, H. R. (2018). Bioquímica de Laguna
y Piña. Capítulo 7. Manual Moderno

28
 PRÁCTICA No 8. Estimación de valores de saponificación de grasas y aceites
OBJETIVOS
 Estimar el valor de saponificación de una muestra de aceite

INTRODUCCIÓN

Las grasas y los aceites son las principales formas de almacenamiento de energía de
muchos organismos. Son compuestos muy reducidos y son derivados de los ácidos grasos.
Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos con cadenas de hidrocarburos de 4 a 36
carbonos, pueden ser saturados o insaturados. Los triacilgliceroles están compuestos de
tres ácidos grasos cada uno en la unión de ésteres con un solo glicerol. Dado que los
hidróxilos polares de glicerol y los carboxilatos polares de los ácidos grasos están unidos
en enlaces de ésteres, los triacilgliceroles son moléculas hidrofóbicas no polares, que son
insolubles en agua (Berg, Tymoczko, & Stryer 2007).
Al calentar las grasas (o aceites) con ácidos o bases, se produce la hidrólisis, es decir, la
separación de glicerol y ácidos grasos, introduciendo moléculas de agua en cada uno de
los enlaces de éster que se hidrolizan. Cuando se utiliza NaOH o KOH como bases, el
glicerol y las sales de Na+ o K+ de ácidos grasos, conocidas como jabón, se producen en
un proceso llamado saponificación (Berg, Tymoczko, & Stryer 2007; Nelson, Cox, 2009)

La caracterización general de las grasas y aceites comestibles presentan especial atención

debido a la funcionalidad y el valor agregado que estas presentan. Para este análisis se
han usado dos parámetros analíticos siendo el primero el índice de saponificación y el
índice de yodo (Chira et al., 2009). El índice de saponificación (IS) es expresado como el
número de miligramos de KOH requeridos para saponificar los ácidos grasos libres y
combinados, presentes en un gramo de grasa y ofrece una medida del peso molecular
promedio de los triglicéridos que constituye la grasa. Las grasas que contienen ácidos
grasos de cadena corta consumen más KOH en su saponificación mostrando IS más
grandes y las que poseen ácidos grasos de cadena larga consumen menos exhibiendo
valores pequeños de IS (Chatterjea & Shinde, 2012)

PROCEDIMIENTO

Materiales Reactivos
 Grasas y aceites (aceite de coco, aceite  KOH etanólico (95% de
de girasol) etanol, v / v)
 Matraz Erlenmeyer  Hidróxido de potasio
 Vaso de precipitación (100 mL) [0.5N]
 Balanza  Disolvente graso
 Pipeta Pasteur  Ácido clorhídrico [0.5N]
 Condensador de reflujo  Indicador de fenolftaleína
 Pipeta de vidrio (25 ml)
 Bureta

29
 1) Pesar 1 g de aceite en un vaso de precipitación y disolver en aproximadamente 3
ml de disolvente graso [mezcla de etanol / éter]. Transferir a un balón
2) Adicionar otros 7 ml de disolvente al vaso de precipitación y trasvasarlos al
matráz.
3) Agregue 25 ml de KOH alcohólico 0,5N al matraz y mezcle bien. Conéctelo a
un condensador de reflujo.
4) Para elaborar un blanco, realizar el mismo procedimiento descrito hasta aquí,
pero, sin agregar la grasa (10 mL de disolvente y 25 ml de KOH alcohólico).
Conectar al condensador de reflujo.
5) Colocar ambos matraces en un baño María durante 30 minutos o en la malla
calentadora a 100°C.
6) Enfriar los matraces a temperatura ambiente.
7) Agregar 3 gotas de fenolftaleína a ambos matraces y titule con HCl 0,5N. En
este punto tener cuidado de no pasarse del punto final.
8) Anotar el punto final del blanco y del aceite.
* La diferencia entre el blanco y la lectura del aceite da el número de mililitros
de KOH 0.5N requerido para saponificar 1 g de grasa.
9) Calcule el valor de saponificación usando la fórmula:

Valor de saponificación o número de grasa = mg de KOH consumido por 1 g de grasa.

Peso de KOH = Normalidad de KOH * Peso equivalente * volumen de KOH en litros

Volumen de KOH consumido por 1 g de grasa = [Prueba en blanco] ml

REFERENCES
Chaterjea MN, Shinde R. 2012. Textbook of Medical Biochemistry (8th ed). Jaypee
Brothers Medical Publishers.
Chira, N., Todaşcă, C., Nicolescu, A., Păunescu, G., & Roşca, S. (2009). Determination
of the technical quality indices of vegetable oils by modern physical techniques. UPB
Scientific Bulletin, Series B, 71(4), 3-12.
Berg, J., Tymoczko, J., & Stryer, L. (2007). Bioquímica (6ta ed.). Barcelona: Reverté.

Nelson, D. L., Cox, M. M., (2009). Lehninger principios de bioquímica. Barcelona:

Omega.

30
 PRÁCTICA No. 9. Extracción de ADN bacteriano y reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)

OBJETIVOS
 Comprender los fundamentos de la extracción de ADN bacteriano por el método
de hervido y extracción de ADN empleando un kit
 Desarrollar destreza en la preparación de una PCR
 Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el amplificado

INTRODUCCIÓN

El conocimiento de la estructura molecular del ADN y como la información que lleva se

traduce ha dado lugar al desarrollo de técnicas de laboratorio para aislarlo, analizarlo,
modificarlo e incluso trasferir un fragmento de ADN de un organismo a otro. El ARN
ribosómico 16S es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos,
codificado por el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir
de cuya secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica de los
procariotas (Bou, et al, 2011).
La amplificación de este gen es posible gracias a la PCR ya que nos permite obtener
varias copias (amplificados de una región en particular). La reacción se lleva a cabo
gracias a varios elementos como: Taq polimerasa, dNTPs, primers, MgCl2, buffer de la
enzima y ADN templado. La Taq es la ADN polimerasa de la bacteria termófila Thermus
aquaticus; esta enzima es capaz de replicar el ADN a altas temperaturas. Los primers,
iniciadores o cebadores, son secuencias cortas de ADN, que se unen a regiones
complementarias de la cadena molde y señalan el sitio donde empieza a realizarse la
amplificación. Desoxinucleótidos trifosfato o dNTPs, son una mezcla de los 4
nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) que van a ser utilizados como
sustratos por la polimerasa para sintetizar la nueva cadena de ADN. Solución
amortiguadora o buffer, que brinda las condiciones de pH necesarias para que se lleve a
cabo la reacción de PCR. ADN molde o templado es uno de los elementos más
importantes de la reacción ya que es el ADN que va a ser amplificado o copiado durante
la reacción.
Los pasos principales de la PCR son: desnaturalización del ADN molde (templado). Aquí
se abren las dos hebras de ADN molde para permitir la hibridación de los iniciadores con
sus regiones complementarias. En la etapa de annealing, los primers se unen las regiones
de las cadenas de ADN molde donde encuentren una secuencia complementaria.
Finalmente, la extensión es la fase dónde la polimerasa empieza a añadir nucleótidos a
partir del extremo 3’-OH libre del iniciador de acuerdo con la complementariedad con la
cadena templado (Green & Sambrook, 2012)
La electroforesis el cual consiste en la separación de las biomoléculas en disolución
cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Si es que al sistema se adiciona una
matriz porosa, se pude caracterizar a las moléculas por su tamaño (Berg, Tymoczko,
& Stryer, 2007)

31
PROCEDIMIENTO
Extracción de ADN x hervido
1. Añadir 20 µL de agua estéril en un microtubo de 1.5ml.
2. Colectar una colonia de Klebsiella pneumoniae o de Escherichia coli con un
palillo de dientes previamente esterilizado y suspender las bacterias en el tubo
con agua estéril.
3. Mezclar empleando un vórtex por 30 segundos seguido de un spin (debe ser
breve)
4. Calentar los tubos a 100°C por 5 minutos en el baño maría (para lisar a las
bacterias)
5. Colocar los tubos en hielo por 5 minutos
6. Centrifugar los tubos a 14 000 rpm por 5 minutos
7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1.5 ml y conservar a -20 °C.
Extracción ADN con kit (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) para bacterias
Gram negativas
1. Transferir 1.5ml de cultivo de bacteria (Klebsiella pneumoniae o de Escherichia
coli) a un tubo estéril de 1.5ml
2. Centrifugar a 13.300 rpm durante 2 minutos para sedimentar las células. Con una
pipeta retire el sobrenadante y descártelo.
3. Añadir 600μL de Nuclei Lysis Solution al pellet anterior y pipetear suavemente
hasta resuspender las células.
4. Incubar a 100°C durante 10 min y luego dejar enfriar a temperatura ambiente
5. Añadir 3μL de solución de ARNasa al lisado celular. Invierta el tubo de 2 a 5 veces
para mezclar.
6. Incubar a 37°C durante 15 minutos. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
7. Agregue 200 μL de Protein Precipitation Solution al lisado celular tratado con
RNasa. Realice un vortex vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos para
mezclar la Protein Precipitation Solution con el lisado celular.
8. Incubar la muestra en hielo durante 5 minutos.
9. Centrifugar a 13.300 rpm durante 3 minutos.
10. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo tubo de 1.5 mL y
adicionar 600 μL de isopropanol a 4°C y mezclar por inversión suavemente.
11. Centrifugar a 13.300 rpm durante 2 minutos y descartar por inversión el
sobrenadante.
12. Agregue 600 μL de etanol al 70% a temperatura ambiente e invierta suavemente el
tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN.
13. Centrifugar a 13.300 rpm durante 2 minutos y descartar el sobrenadante y deje boca
abajo sobre un papel absorbente hasta que el etanol se seque completamente.
14. Una vez que esté totalmente seco agregar 50 μL de DNA Rehydration Solution al
tubo y homogenizar durante 1 min con ayuda del vórtex.
15. Almacenar el ADN a 2–8°C.

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 Amplificación del gen 16S de Klebsiella pneumoniae o Escherichia coli
1) Limpiar la mesa con alcohol y preparar los materiales necesarios para preparar la
reacción (pipetas puntas de los 3 tipos, frasco de desechos y tubos 1,5 y 0,2 y
gradillas)
2) Es importante emplear guantes nuevos, usar mandil y estar recogido el cabello.
3) Calcule los reactivos que requiera según el número de muestras a emplear según
la siguiente tabla (1Rx  para una reacción). Recuerde incluir un control
positivo, un control negativo y una muestra adicional para prevenir errores de
pipeteo.

Reactivos 1Rx X Rx
H2O PCR 13.25 ul
Buffer 5X 5 ul
MgCl2 2 ul
dNTPs (10 uM) 0.5 ul
Primer 16SF* 10uM 1 ul
Primer 16SR** 10uM 1ul
Taq polimerasa 0.25 ul
DNA templado 2 ul
TOTAL 25 ul
*Primers 16 SF: 5´GGA GGC AGC AGT AGG GAA TA 3´
**Primer 16SR: 5´TGA CGG GCG GTG AGT ACA AG 3´

4) Trabaje sobre hielo o empleando una gradilla fría. En tu tubo de 1.5 ml prepare
un mastex mix incluyendo: Agua, Buffer 5x, MgCl, dNTPs, Primers, y Taq
polimerasa.
5) Distribuya 23 ul de master mix en tubos de 0,2 ml de acuerdo al número de
muestras requeridas
6) Adicione 2 ul de DNA templado en cada tubo
7) Para el control negativo adicione 2ul de agua en lugar de ADN
8) Para el control positivo adicione 2ul de ADN control.
9) Coloque los tubos en el termociclador y programe el equipo empleando las
siguientes condiciones:

Condiciones de PCR:
Desnaturación 94°C x 30 seg

30 x ciclos:
Denaturación 94°C x 30seg
Annealing 60°C x 30 seg
Extensión 72°C x 30seg

Extensión final 72°C x 10min

8°C x ∞

10) Deje correr el programa por aproximadamente 3h, luego retire los tubos y
mantenga a 4°C en la refrigeradora.

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Electroforesis en gel de agarosa
11) Armar la cámara de electroforesis
12) Pesar 0.3 g de agarosa y transferir a un matraz.
13) Añadir 30 ml de buffer Tris-Borato-EDTA (2% P/V)
14) Calentar en el microondas hasta que se disuelva completamente.
15) Esperar que se enfríe
16) Transferir la solución de agarosa en el molde de la cámara de electroforesis que
se va a emplear y esperar que se solidifique.
17) Llenar la cámara de electroforesis con buffer Tris-borato y sumergir el gel en el
buffer.
18) Sobre un parafilm, distribuir 2 μl de buffer de carga 6X y añadir 4 μl de DNA
extraido. Mezclar por pipeteo.
19) Colocar 6 μl de cada muestra en las ranuras del gel empleando una micropipeta
de 2-20ul.
20) Colocar 2.5μl de marcador de peso molecular (escalera de ADN de 100pb) en la
primera ranura del gel.

21) Programar el equipo para trabajar a 80 v correrá aproximadamente a 1h10min

22) Obtenido el gel colocarlo en un recipiente 5 agregar 50 mL de TBE junto con 5

µL de Diamond.

23) Agitar por 30 minutos y visualizar el gel en el fotodocumentador

REFERENCIAS
Berg, J., Tymoczko, J., & Stryer, L. (2007). Bioquímica (6ta ed.). Barcelona: Reverté.

Bou, G., Fernández-Olmos, A., García, C., Sáez-Nieto, J. A., & Valdezate, S. (2011).
Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. Enfermedades
infecciosas y microbiología clínica, 29(8), 601-608.

Green, M., Sambrook, J. 2012. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 4ta. Edición.
Cold Sprinng Harbor Laboratory Press. (Tomos 1 y 3).

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