Facultad de Ciencias Químicas

Químico Farmacéutico Biólogo

Práctica 4.
Utilización de aminoácidos e identificación de enzimas
descarboxilasas en enterobacterias.

Fisiología bacteriana

Integrantes:
● Chávez Gudiño Diana Guadalupe
● Cortés Ramos Paola Enedelia
● Flores Pérez María de Jesús
● Garza Rodríguez Fátima Monserrat
● Magallón Vadillo Dania Marlen
● Olivera Carrizales Katia Valeria

Dr. Mario Alberto Gaitán Hinojosa

5°A
Coquimatlán, Col. 03 de noviembre de 2022
RESUMEN

En esta práctica se utilizaron 3 pruebas, de descarboxilación de aminoácidos, esta

es llevada a cabo por descarboxilasas formandose aminas y CO2, cada
descarboxilasa es específica para una aminoácido y la reacción es completa e
irreversible, en este caso se usó lisina como descarboxilasa; otra de las pruebas fue
de alcalinidad, ciertos organismos tienen la habilidad de producir una reacción
alcalina en un medio conteniendo arginina bajo condiciones relativamente
anaeróbicas que se puede detectar por un vire en el pH y la tercera prueba fue por
ornitina para determinacion de movimiento bacteriano. Se utilizaron 3 tubos para
cada una de las pruebas y en cada uno de los tubos se inoculo de la misma manera,
en el medio LIA se inoculó con picadura y estriado de la orilla del medio hacia la
boquilla del tubo, para el medio MIO se hizo agitación y para el medio arginina fue
por medio de punción, y las bacterias que se usaron para realizar cada una de las
inoculaciones fueron Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris y Escherichia coli. Una vez
teniendo todas las inoculaciones se incubaron por 24 hrs. Cada una de las pruebas
tiene una interpretacion diferente, para lisina descarboxilasa si el medio toma una
coloracion violeta es un indicativo positivo pero si es color amarillo indica que los
resutaros fueron negativos; para la prueba de arginina para indicar que fue positivo
se torna color rojo pero si resulta negativo tendra el mismo color hasta despues de 7
dias se torna de amarillo a rojo, para la ultima prueba de ornitina los resultados
indican positivos si se torna de color púrpura y resultan negativos de color amarillo,
para el medio MIO se omitieron los resultados debido a que el aceite estaba
caducado por lo que los resultados en todo fue el mismo y no hubo ningun cambio.

ABSTRACT

In this practice 3 tests were used, amino acid decarboxylation, this is carried out by
decarboxylases forming amines and CO2, each decarboxylase is specific for an
amino acid and the reaction is complete and irreversible, in this case lysine was
used as decarboxylase; Another test was alkalinity, certain organisms have the
ability to produce an alkaline reaction in a medium containing arginine under
relatively anaerobic conditions that can be detected by a vire in pH and the third test
was by ornithine for determination of bacterial movement. 3 tubes were used for
each of the tests and in each of the tubes it was inoculated in the same way, in the
middle LIA it was inoculated with pitting and striated from the edge of the medium
towards the mouthpiece of the tube, for the medium MIO agitation was done and for
the medium arginine it was by means of puncture, and the bacteria that were used
to perform each of the inoculations were Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris and
Escherichia coli. Once all the inoculations were taken, they were incubated for 24
hours. Each of the tests has a different interpretation, for lysine decarboxylase if the
medium takes a violet coloration is a positive indicator but if it is yellow indicates that
the results were negative; for the arginine test to indicate that it was positive it turns
red but if it is negative it will have the same color until after 7 days it turns from
yellow to red, for the last ornithine test the results indicate positive if it turns purple
and are negative yellow, for the medium Mio the results were omitted because the oil
was expired so the results In everything it was the same and there was no change.

INTRODUCCIÓN.

La descarboxilación es el proceso mediante el cual las bacterias poseen enzimas

con la capacidad de atacar aminoácidos en su carboxilo terminal abriendo paso a la
formación de una amina o diamina y dióxido de carbono. Importante recordar que la
descarboxilación es irreversible, no oxidativa y requiere una coenzima en común.
(MacFaddin, 2003).

Los medios utilizados para las pruebas de identificación fueron el LIA, MIO y
Arginina, cada uno de ellos busca la descarboxilación de ciertos aminoácidos
específicamente en las enterobacterias. El medio LIA (Lisina-Hierro), fue
seleccionado para esta prueba por contener lisina, un aminoácido capaz de ser
ocupado por la enzima lisina descarboxilasa produciendo cadaverina que aumenta
el pH del medio cambiando el color a púrpura (resultado positivo) o por el contrario a
amarillo (resultado negativo). (MacFaddin, 2003).

Por otra parte, el medio MIO (Movilidad, Indol, Ornitina) resultó ser adecuado por la
descarboxilación de la ornitina, el microorganismo es capaz de degradar la glucosa
en el medio reduciendo el pH a ácido, y si existe presencia de la enzima ornitina
descarboxilasa descarboxila la ornitina produciendo putrescina generando
alcalinizar el medio y que vire a púrpura (resultado positivo), si el medio vira a
amarillo es un resultado negativo. (MacFaddin, 2003).

Por último, el medio Arginina, la L-arginina sufre una descarboxilación lo que genera
agmatina, su posterior degradación la separa en dos compuestos, los cuales son
putrescina y urea; si la enzima ureasa está presente, la urea se cataboliza y genera
dos moléculas de amoniaco y dióxido de carbono. La agmatina es catabolizada por
la agmatina dihidrolasa a putrescina, dióxido de carbono y amoniaco por medio de
un compuesto intermediario N-carbamoilputrescina. En el sistema dihidrolasa la
degradación de la arginina ocurre en dos pasos, una degradación de la L-arginina a
L-citrulina seguida de un fraccionamiento de la citrulina. La reacción global produce
la formación de la L-ornitina, dióxido de carbono y amoniaco a partir del sustrato
L-arginina. (MacFaddin, 2003).

Imagen 1. Sistema arginina descarboxilasa. (MacFaddin, 2003).

MARCO TEÓRICO

La familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos

Gramnegativos, ya sea móviles con flagelos perítricos o no móviles; se multiplican
bien en agar de MacConkey; proliferan en medios aerobios y anaerobios (son
anaerobios facultativos); fermentan en vez de oxidar glucosa, a menudo
produciendo gas; catalasa positiva, oxidasa negativa, reducen nitrato a nitrito, y
tienen un contenido de DNA de G+ C de 39 a 59%. (Brooks, et al. 2011).

La movilidad bacteriana se puede observar por microscopia en suspensiones

líquidas, por extensión del desarrollo bacteriano en forma de película sobre agar o
como una turbidez que se extiende a través de un agar blando (p.ej., 0.5%).
(Velasco, 2014).

Utilización de los aminoácidos

Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo ácido (COOH), un grupo
amino (NH2) y un grupo radical (R), y son utilizados por las células para la síntesis
de proteínas. Son los compuestos orgánicos nitrogenados más utilizados por los
microorganismos, originando la separación del grupo carboxilo, del grupo amino o
del sulfhidrilo.( Olivas y Alarcón, 2004).

Muchas especies de bacterias tienen enzimas capaces de descarboxilar

aminoácidos específicos en el medio de prueba. Las enzimas descarboxilasas
eliminan una molécula de CO2 de un aminoácido para formar aminas de reacción
alcalina. La principal aplicación de estas pruebas es la identificación de
Enterobacterias. Se considera el resultado positivo cuando se observa una
coloración rojo- púrpura turbia. Y una coloración amarilla indica que el resultado es
negativo. Los siguientes son los aminoácidos evaluados más a menudo y sus
productos de degradación de las aminas.( Olivas y Alarcón, 2004).

Lisina--------- Cadaverina

Ornitina------- Putrescina

Arginina------- Cirtulina
El medio SIM contiene polipéptidos ricos en aminoácidos azufrados, principalmente
triptófano y además iones ferrosos. Por lo tanto, en este medio se puede hacer
simultáneamente la prueba de producción de H2S y la de Indol.(Olivas y Alarcón,
2004).

Utilización del triptófano y producción de indol

El triptófano es un aminoácido que resulta del rompimiento de la mayoría de las

proteínas. Algunas bacterias producen la enzima triptofanasa que cataliza la
separación de residuos de indol, a partir del triptófano. La degradación es
intracelular mediante un sistema enzimático llamado triptofanasa, dando lugar a
amoníaco, ácido pirúvico y tres metabolitos: indol, ácido acético y escatol. El indol
puede detectarse en el medio de cultivo por adición del reactivo de Kovac, el cual
reacciona con el indol en unos segundos, dando un compuesto rojo insoluble en
agua.(Olivas y Alarcón, 2004).

Producción de sulfuros, a partir de aminoácidos con azufre

La producción de H2S a partir de aminoácidos con azufre, mediante la enzima

desulfurasa, indica la capacidad de los microorganismos para utilizarlos. Si además
de los aminoácidos con azufre, el medio de cultivo también contiene iones ferrosos,
estos reaccionan con el H2S, produciendo sulfuro ferroso (FeS), compuesto
insoluble de color negro. El Proteus vulgaris, inoculado en medio SIM, se emplea
como testigo positivo productor de H2S. (Olivas y Alarcón, 2004).

Los aminoácidos al perder el grupo carboxilo se convierten en aminas lo que

incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura de bromocresol) vira a violeta.
Esta prueba determina la presencia de la enzima lisina descarboxilasa, la cual
capacita al microorganismo de descarboxilar la lisina, por medio de la reacción. La
actividad de la lisina descarboxilasa es inducible por pH, con lo cual se añade
glucosa para que este baje, tomando el medio color amarrillo. Si la bacteria es
capaz de sintetizar lisina descarboxilasa, metaboliza la lisina, provocando un
aumento del pH, tomando el medio color violeta.(Olivas y Alarcón, 2004).
OBJETIVO GENERAL.
Que el alumno analicé y utilicé las pruebas de identificación de enzimas
descarboxilasas en enterobacterias.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
● Que el alumno analicé como es que se lleva a cabo la descarboxilación
de aminoácidos.
● Como las reacciones de las descarboxilasas son útiles en la
diferenciación de enterobacterias.
● Como se realiza la identificación de aminoácidos por medio de las
pruebas de lisina, ornitina y arginina.
● Observar la habilidad que tienen ciertos microorganismos para producir
reacción alcalina en un medio de arginina.

MATERIAL.

● Tubos de ensayo con tapón de baquelita de 13x100 mm (KIMAX).

● Matraz erlenmeyer de 250 ml (KIMAX).
● Matraz erlenmeyer de 500 ml (KIMAX).
● Tubo de 20 x 200 mm (PYREX) con aceite mineral fundido.
● Mechero Fisher
● Gradilla de metal 40 plazas (INDOX).
● Gradilla de unicel 100 plazas (BD Vacutainer).
● Encendedor
● Espátula
● Papel aluminio
● Asa bacteriológica en hilo
● Asa bacteriológica en aro
● Tela de asbesto
● Guante de asbesto
● Tripié
● Ligas
● Papel estraza
 ● Cinta testigo
● Cajas de Petri de 100 x 15 mm

REACTIVOS.

● Cultivo de 24 horas de Klebsiella oxytoca en agar Mueller Hinton.

● Cultivo de 24 horas de Proteus vulgaris en agar Mueller Hinton.
● Cultivo de 24 horas de Escherichia coli en agar MacConkey.
● Medio de cultivo deshidratado agar hierro y lisina (DIBICO)
● Medio de cultivo caldo base descarboxilasa de Moeller (DIBICO)
● L-Arginina Clorhidrato (Jalmek)
● Medio de cultivo agar MIO (DIBICO)
EQUIPOS.
● Autoclave de 24 L de capacidad (All American 2JX-1)
● Cubeta de olla de presión.
● Incubadora (Felisa, Fe-141D)
● Balanza analítica (ACCULAB VIC-5101)

METODOLOGÍA
1. Lavar todo el material con escobillón y detergente; enjuagar con agua
corriente.
2. Enjuagar el material con una pizeta llena de agua destilada, dejar
secar en una toalla de papel.
3. Envolver los materiales con papel estraza.
4. Preparar los medios de acuerdo a las indicaciones del bote.
5. Ajustar el pH de acuerdo a las indicaciones.
6. Calentar la solución para eliminar el agua de las paredes del matraz,
agitar frecuentemente.
7. Colocar la solución a los tubos, tapar con papel estraza y sellar con
ligas.
8. Esterilizar en autoclave.
9. Limpiar el área de trabajo.
10. Rotular los tubos de ensayo de acuerdo con las bacterias a utilizar.
11. Prender el mechero Fisher.
 12. Tomar el asa y esterilizarla en el mechero (recordar ponerla en
vertical). Una vez estéril esperar que enfríe un poco.
13. Comenzar a inocular (recordar que son 3 tubos por bacteria), para el
medio LIA inocular con la técnica pico de flauta (picadura y estriado
desde el fondo del tubo hasta la boquilla del mismo), flamear antes y
después de inocular.
14. Para el medio MIO inocular por agitación, flamear antes y después de
inocular.
15. Para el medio de Arginina inocular por punción, flamear antes y
después de inocular.
16. Repetir los últimos 3 pasos para las bacterias faltantes.
17. Trasladar los tubos a una gradilla metálica y llevar a la incubadora por
al menos 24-48 horas.
18. Sacar los tubos de la incubadora, observar y hacer anotaciones
pertinentes.

RESULTADOS

Tabla 1. Resultados experimentales prueba lisina descarboxilasa.

Bacteria Resultados Imagen

Prueba positiva, cambio
Klebsiella oxytoca de coloración del medio a
violeta.
 Prueba negativa.
Proteus vulgaris

Prueba positiva, cambio

Escherichia coli. de coloración del medio.

Tabla 2. Resultados experimentales prueba arginina dihidrolasa.

Bacteria Resultados Imagen

 Medio caducado, no se
Klebsiella oxytoca puedo identificar la
arginina dihidrolasa.

Medio caducado, no se
Proteus vulgaris puedo identificar la
arginina dihidrolasa.

Medio caducado, no se
Escherichia coli. puedo identificar la
arginina dihidrolasa.

Tabla 3. Resultados experimentales prueba ornitina

Bacteria Resultados Imagen

 Prueba negativa.
Klebsiella oxytoca

Prueba negativa.
Proteus vulgaris

Prueba positiva.
Escherichia coli.
DISCUSIÓN.
Mediante los resultados obtenidos, se pudieron comparar el comportamiento de las
tres bacterias inoculadas: Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris y Escherichia coli. En
distintas pruebas bioquímicas.

En la prueba lisina descarboxilasa, los tubos contenían a Klebsiella oxytoca y

Escherichia coli dieron positivo, pues se pudo observar que en el medio de cada
tubo, presentó un cambio de coloración a violeta. Esto se debe a que, ambas
bacterias cuentan con la enzima lisina descarboxilasa, por ende, cuando se
descarboxila la lisina se genera una amina la cual neutraliza el ácido producido
generando que el medio torne a color violeta. Por otro lado, el tubo que contenía la
bacteria Proteus vulgaris dio negativo, ya que dicha bacteria carece de la enzima.

En la prueba de arginina dihidrolasa se utilizó un reactivo caducado, por esta razón,

no se puede confiar en los resultados obtenidos; la coloración obtenida con este
medio fue una coloración un poco morada para E. coli y de igual manera para P.
vulgaris hubo una coloración morada con presencia de turbidez, mientras que para
K. oxytoca se tornó transparente, con un aro rojizo en la parte superior y luego otro
pequeño aro transparente encima. Sin embargo, teóricamente se esperaba que
aquellos tubos donde el medio tornara a un color amarrillo anaranjado serían
positivo, ya que estos producen una reacción alcalina que es debida a la producción
de ornitina, CO2 y NH3 a partir de arginina.

En la prueba del medio MIO las bacterias klebsiella oxytoca y Proteus vulgaris
fueron negativas en esta reacción, ya que no son denominadas como
enterobacterias y estas no producen indol, lo que hace que no fermente y se genere
esa coloración café rojiza y en la bacteria de Escherichia coli si hubo porque causó
fermentación, lo que hizo que si se genere el indol y se cambió a lila o violeta lo que
indica que es positiva.
Todos los resultados para la prueba de ornitina y lisina fueron los esperados
teóricamente, a excepción de la prueba de arginina dihidrolasa, ya que el medio
caduco fue un limitante que no teníamos contemplado, sin embargo, los resultados
fueron reportados y se aclaró la causa de que no fueran confiables y resultaran
irrelevantes en este reporte.

CONCLUSIÓN.
El conjunto de estas pruebas junto a otros ensayos bioquímicos permiten identificar
Enterobacterias, Aeromonas, Plesiomonas y especies de Vibrios. Como se observó
también los aminoácidos pierden el grupo carboxilo lo que hacen que se convierta
en aminas esto haciendo que se incremente el pH en el medio y el indicador cambie
o se mantenga dependiendo si es una bacteria que puede crecer sobre estos
medios, cuando se presentan fermentadores de glucosa estos vuelven a los medios
amarillos dando así a una respuesta negativa, mientras si el ambiente ácido
favorece a la actividad enzimática decarboxilasa y dehidrolasa, se metaboliza el
aminoácido presente a su correspondiente amina, elevando el pH del medio de
cultivo y tornándolo al color púrpura o violeta, como fue que sucedio con el medio de
LIA tornandose de coloración violeta.

RPBI
De acuerdo con la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 sobre el manejo de RPBI, para que
un residuo sea considerado RPBI debe de contener Agentes Peligrosos Biológicos
Infecciosos. Además establece una serie de criterios para su manejo. Teniendo en
cuenta lo anterior en este caso se llevó a cabo la inactivación de los tubos de
ensayo que contenían los medios de cultivo, mediante la exposición al calor, dentro
de un recipiente con agua hirviendo durante mínimo 5 minutos y después fueron
vertidos en la tarja para posteriormente lavarlos eliminando cualquier resto que pudo
quedar en los tubos del medio.

CUESTIONARIO

1. Escriba las reacciones correspondientes para cada aminoácido

a) Descarboxilasas
 Imagen 2. Descarboxilasas.

b) Desaminasas

Imagen 3. Desaminasas.

c) Arginina dihidrolasa

Imagen 4. Arginina dihidrolasa.

2. Este tipo de reacciones:

a) ¿Tienen importancia taxonómica? ¿por qué?

Si, ya que las descarboxilasas y la arginina dihidrolasa son útiles en la

diferenciación de Enterobacteriaceae y la desaminasa es característica de
todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia.
b) ¿Tienen importancia industrial? ¿por qué?

Si, ya que muchas veces depende de estas para aumentar el valor

alimenticio en algunos productos alimenticios o simplemente como
potenciadores de sabor. También tienen importancia en la industria química
como en pesticidas y herbicidas.

BIBLIOGRAFÍA.

● Ewing. 1986. Edwards and Ewing’s identification of Enterobacteriaceae, 4th

ed. Elsevier Science Publishing Co., New York, N.Y.
● Holt, Krieg, Sneath, Staley and Williams (ed.). 1994. Bergey’s Manual of
determinative bacteriology, 9th ed. Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
● Murray P.R., Baron, Pfaller, Tenover and Yolken. 1999. Manual of clinical
microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
● MacFaddin. 2003. Biochemical tests for identification of medical bacteria, 3rd
ed. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md. Editorial Médica
Panamericana. Págs. 113-127.
● Brooks, G.F. Butel, J.S. Carroll, K.C. Mietzner, T.A. Morse, S.A. (2011).
Microbiología Médica. Editorial Mc Graw Hill Education. México, D.F. Página:
213.
● Velasco,R.(2014).Curso Práctico de Microbiología. Universidad Autónoma
Metropolitana. Unidad Iztapalapa.Páginas: 90-92.
● Olivas, E., Alarcón, L.R.(2004). Manual de Prácticas de Microbiología básica
y Microbiología de alimentos. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
Departamento de Ciencias Básicas del ICB. Ciudad Juárez Chihuahua.
Páginas: 38-40.