Laboratorio de Bacteriología Clínica

Alumno: Ulises Eduardo Allec Velasco

Docente: Dr. Jaime Vargas Arzola

Docente Auxiliar: Q.B. José Ricardo Avendaño
Grupo: 6° A

PRUEBAS BIOQUIMICAS
 MIO
(motilidad, indol y ornitina)

FUNDAMENTO

La movilidad es la capacidad del microorganismo de moverse por la presencia de

flagelos. Para que esta propiedad pueda ser observada la consistencia del medio
debe ser semisólida, por lo que la preparación lleva menos cantidad de agar. Es
importante que la movilidad se lea antes de revelar el indol, ya que el agregado
del reactivo enturbia todo el medio.

La producción de indol evidencia la presencia de la enzima triptofanasa que actúa

sobre el aminoácido triptófano

El indol es incoloro, por tanto su presencia se revela al agregar cinco gotas del
reactivo de Ehrlich o de Kovacs, ambos con p-dimetilaminobenzaldehído. El grupo
aldehído de este compuesto reacciona con el indol, generando un producto de
color rojo fucsia en forma de anillo en la superficie del agar. Cualquier vestigio
de color se debe considerar como una prueba positiva. La prueba debe leerse
inmediatamente, pues pasado el tiempo el color se degrada.

La glucosa es el carbohidrato fermentable que además de aportar energía

acidifica el medio, condición necesaria para que pueda ocurrir la
descarboxilación del aminoácido ornitina. La fermentación de la glucosa debe
ocurrir siempre, partiendo del principio de que todas las bacterias
pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae fermentan la glucosa.

En caso de que la bacteria produzca la enzima ornitina descarboxilasa, esta

podrá actuar una vez que el medio haya sido acidificado por la fermentación de
la glucosa.
La enzima ornitina descarboxilasa actúa sobre el grupo carboxilo del aminoácido
produciendo una amina llamada putresina que alcaliniza nuevamente el medio.

Hay que recordar que la primera reacción que ocurre es la fermentación de la

glucosa, por lo que el medio se torna de color amarillo en una fase inicial
(primeras 10 a 12 horas). Si posteriormente ocurre la descarboxilación de la
ornitina, el medio virará a morado.

El indicador de PH es el púrpura de bromocresol; el encargado de revelar cuando

existe un cambio de pH en el medio. Al acidificarse, el indicador vira a amarillo,
y al alcalinizarse vira a morado.

USO

Este medio es una prueba que complementa una batería de pruebas bioquímicas
para la identificación de las bacterias pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae.

El dato de la descarboxilación de la ornitina sirve para diferenciar a Shigella

sonnei, que da positiva, de Shigella boydii, Shigella flexneri y S. dysenterieae,
que dan negativas.

También diferencia el género Klebsiella, que da negativa, del género

Enterobacter, donde la mayoría de sus especies dan positiva.
INTERPRETACIÓN

Movilidad

 Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea

de siembra.
 Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

Ornitina decarboxilasa

 Prueba negativa: medio de color amarillo o con fondo amarillo.

 Prueba positiva: medio completamente morado.

Prueba del Indol

La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la

prueba de ornitina

 Prueba positiva: formación de un anillo de color rojo fucsia al agregar las gotas
del reactivo de Kovacs.
 Prueba negativa: no hay formación de anillo.
 LIA
Agar Lisina-Hierro

FUNDAMETNO

La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos que la transforman en

cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH que en este
caso es púrpura de bromocresol. Puesto que la descarboxilación solo tiene lugar
en medio ácido (pH inferior a 6,0), es necesario que se produzca previamente la
acidificación del medio de cultivo por fermentación de la glucosa. Por este
motivo, este medio de cultivo solo debe utilizarse para la diferenciación de
bacterias que fermenten la glucosa.

Los microorganismos que no poseen la lisina descarboxilasa, pero son

fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo del medio de cultivo.
La volatilización del CO2 producido ocasiona la alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y, en consecuencia, se produce un viraje al violeta.
La producción de H2S da una coloración negra al medio debida al sulfuro de
hierro que se forma.

Cuando ocurre desaminación de la lisina por la presencia de la enzima lisina

desaminasa, se forma un color rojizo en la superficie, típico en los géneros
Proteus, Providencia y algunas especies de Morganella. Esto se debe a que
durante el proceso de desaminación se forma el ácido alfa-ceto-carbónico, que
reacciona con el citrato de amonio en presencia de oxígeno, lo que origina el color
mencionado.

USO

Esta prueba, junto a otras pruebas bioquímicas, se utiliza para la identificación

de bacilos de la familia Enterobacteriaceae.

El medio se siembra con un ansa recta o aguja, se realizan una o dos punciones
hasta el fondo del tubo, y luego se estría la superficie del medio en zigzag.
Se incuba por 24 horas a 35-37°C en aerobiosis. Si es necesario se deja
incubando por 24 horas más.

Es principalmente útil para diferenciar especies de Citrobacter lactosa

negativos de Salmonellas sp.
INTERPRETACIÓN

 Presencia de color violeta en todo el medio: Descarboxilación de la lisina.

 Presencia de color violeta en superficie y amarillo en profundidad: Negativo.
 Presencia de color pardo rojizo en la superficie: Desaminación de la lisina.

Al interpretar la prueba los resultados se registran de la siguiente manera:

Primero se lee el bisel, luego el fondo o taco, después la producción de H2S, y

finalmente la producción de gas.

Ejemplo: K/A + (-)

 K: Bisel alcalino (color morado)

 A: Fondo ácido (amarillo), es decir, reacción de descarboxilación negativa y
desaminación negativa.
 +: Producción de sulfuro de hidrógeno
 (-): Sin gas.
 UREA

FUNDAMENTO

El caldo urea es un medio de cultivo líquido utilizado para determinar la

capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de
amoniaco por acción del enzima ureasa.

La enzima ureasa hidroliza la urea para formar anhídrido carbónico, agua y dos
moléculas de amoníaco. Estos compuestos reaccionan para formar el producto
final llamado carbonato de amonio.

El caldo o agar urea de Christensen es menos tamponado, siendo capaz de

detectar pequeñas cantidades de amonio. Además, este medio está enriquecido
con peptonas y glucosa. Estos compuestos hacen que se desarrollen otros
microorganismos productores de ureasa que no crecen en el caldo Stuart.

USO

La prueba de la urea es extremadamente efectiva para distinguir el género

Proteus de otros géneros de la Familia Enterobacteriaceae, dada la rápida
reacción que brinda Proteus.
Si se usa la composición de Christensen, la prueba ayuda a diferenciar entre
especies de un mismo género. Por ejemplo, S. haemolyticus y S. warneri son
Staphylococcus coagulasa negativos y betahemolíticos, pero se diferencian en
que S. haemolyticus es urea negativo y S. warneri es urea positivo.
INTERPRETACIÓN

El medio originalmente es de color amarillo-anaranjado y una reacción positiva

hará virar el color del medio a rosado-fucsia. La intensidad del color es
directamente proporcional a la cantidad de amonio producido.

Una reacción negativa dejará el medio del color original a excepción de las
levaduras, que pueden dar un rosado pálido con el medio agar urea de
Christensen.
 AGAR CITRATO

FUNDAMENTO

Microorganismos capaces de utilizar fosfato de amonio y citrato de sodio como

única fuente de nitrógeno y carbono respectivamente crecen en este medio
produciendo una reacción alcalina y evidenciando un cambio de color por la
presencia de un indicador azul de bromotimol cambiando el medio de verde a
azul.

USOS

Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar

citrato como ˙nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como ˙nica
fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.
Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes
géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de
Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como ˙nica
fuente de carbono.

procedimiento

Tomar una colonia bien aislada de un cultivo primario y sembrar en forma de

estría única en el pico de flauta del tubo de agar citrato. Incubar a 35ºC durante
24 a 48 horas (con tapa floja)

INTERPRETACIÓN

a) La prueba positiva se representa por la producción de color azul oscuro

en el término de 24 a 48 horas, que indica la utilización de citrato con
formación de productos alcalinos.
b) La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si
hay desarrollo visible en la estría de siembra.
c) Una interpretación positiva basada en la lectura del trazo se puede
confirmar incubando por 24 horas más, momento en que habitualmente se
produce color azul.
 SIM
(Sulfide Indole Motility)
FUNDAMENTO

El medio contiene sulfato de amonio ferroso y tiosulfato de sodio, que juntos

sirven como indicadores para la producción de sulfuro de hidrógeno. La
producción de sulfuro de hidrógeno se detecta cuando el sulfuro ferroso, un
precipitado negro, se produce como resultado de sulfato de amonio ferroso
reaccionar con H2S gas.

La peptona de caseína, otro componente de SIM Medium, es rica en

triptófano. Los organismos que poseen la enzima triptofanasa degradan el
triptófano a indol. El indol se detecta tras la adición de reactivo de Kovacs (nº
de cat. Z67) tras la incubación del medio inoculado. El indol se combina con p-
dimetilaminobenzaldehído y produce una banda roja en la parte superior del
medio. Una prueba de indol negativa no produce ningún cambio de color al agregar
el reactivo Kovacs.

La pequeña cantidad de agar añadida al medio proporciona una estructura

semisólida que permite la detección de la motilidad bacteriana. Los organismos
móviles se extienden desde la línea de apuñalamiento y producen turbidez o
nubosidad en todo el medio. Los organismos no móviles crecen solo a lo largo de
la línea de ataque y dejan claro el medio circundante.
SIM Medium también contiene tejido animal que proporciona aminoácidos y
nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.

USOS

SIM (Sulfide Indole Motility) Medium (medio de sulfuro indol para movilidad)
se utiliza para determinar la producción de sulfuro, formación de indol y
movilidad de los microorganismos entéricos.

La formulación de SIM Medium está diseñada para permitir la detección de la

producción de sulfuro, la formación de indol y la motilidad.

INTERPRETACIÓN

 Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más allá de
la línea de siembra (3).
 Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de
siembra (4).
 Cepas H2S positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o
en todo el medio (5).
 Cepas H2S negativas: el medio permanece sin cambio de color (1, 2, 3,
4).
 Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el
reactivo de Kovac´s o de Erlich (2).
 Cepas indol negativas: sin cambio de color (1)
 Producción de
Microorganismo Movilidad Indol
ácido sulfúrico
E. coli ATCC
+ + -
25922
K. pneumoniae
- - -
ATCC 700603
P. mirabilis ATCC
+ - +
43071
S. typhimurium
+ - +
ATCC 14028
S. enteritidis
+ - +
ATCC 13076
S. flexneri ATCC
- - -
12022

AGAR HIERRO TRIPLE AZÚCAR (TSI)

FUNDAMENTO

El agar TSI contiene tres azúcares: dextrosa, lactosa y sacarosa; rojo de fenol
para detectar la fermentación de estos carbohidratos, y sulfato ferroso para
detectar la producción de ácido sulfhídrico. La degradación o fermentación del
azúcar con formación de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador
Rojo de fenol que vira de anaranjado-rojizo a amarillo, o por un viraje a rojo
intenso en caso de alcalinización. El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes
a ácido sulfhídrico, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de
hierro de color negro.

Lactosa, sacarosa y glucosa en la concentración de 10: 10: 1 (es decir, 10 partes

de lactosa (1%), 10 partes de sacarosa (1%) y 1 parte de glucosa (0,1%)). TSI es
similar al agar hierro de Kligler (KIA) , excepto que el agar hierro de Kligler
contiene solo dos carbohidratos: glucosa (0,1%) y lactosa (1%).
  Glucosa al 0,1% : si solo se fermenta glucosa, solo se produce el
ácido suficiente para que el trasero se vuelva amarillo. La inclinación
permanecerá roja
 1.0% de lactosa / 1.0% de sacarosa: Si se fermentan lactosa o
sacarosa o ambos azúcares, se producirá una gran cantidad de ácido
que se vuelve amarillo tanto a tope como oblicuo. Por lo tanto, la
aparición de color amarillo tanto en la inclinación como en el trasero
indica que el aislado tiene la capacidad de fermentar lactosa o
sacarosa o ambas.
 Hierro (sulfato ferroso): indicador de formación de H 2 S
 Rojo fenol: Indicador de acidificación (es amarillo en condiciones
ácidas y rojo en condiciones alcalinas).
 También contiene peptona que actúa como fuente de
nitrógeno. (Recuerde que siempre que se utiliza peptona en
condiciones aeróbicas se produce amoníaco)

La adición de sacarosa en agar TSI permite la detección más temprana de

bacterias coliformes que fermentan la sacarosa más rápidamente que la
lactosa. La adición de sacarosa también ayuda a identificar ciertas bacterias
gramnegativas que podrían fermentar sacarosa pero no lactosa. Otro
conocimiento básico es que el tubo TSI contiene un tope (área poco oxigenada
en la parte inferior) inclinado (área en ángulo bien oxigenada en la parte
superior).

USOS

Este agar es usado para la diferenciación de bacilos gram negativos entéricos

basado en la fermentación de carbohidratos (sacarosa, lactosa y dextrosa) y la
producción de ácido sulfhídrico. En microorganismos como el Proteus y
Citrobacter que son fermentadores de la sacarosa, se puede enmascarar el
indicador de sulfhídrico en el medio.
INTERPRETACIÓN

A. Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es

no fermentador de azúcares.
B. Anaranjado/anaranjado (control, sin inocular).
C. Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.
D. Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
E. El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido
sulfhídrico (H2S).
F. D) La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.

Producción de Producción de
Microorganismo Pico/Fondo
gas ácido sulfhídrico
E. coli ATCC
A/A + -
25922
K. pneumoniae
A/A + -
ATCC 700603
P. mirabilis ATCC
K/A + +
43071
S. typhimurium
K/A - +
ATCC 14028
S. enteritidis K/A
+ +
ATCC 13076
S. flexneri ATCC K/A
- -
12022
P. aeruginosa K/K
- -
ATCC 27853

A: ácido= amarillo

K: alcalino= rojo

Formación de burbujas: Producción de gas

Ennegrecimiento de la superficie del medio: Producción de H2S

A) Rojo/rojo

B) Control (sin inocular)

C) Rojo/amarillo

D) Amarillo/amarillo

E) Rojo/amarillo con H2S

 REFERENCIAS

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004).

Diagnóstico Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A.
Argentina.
2. Gil, Marielsa. (4 de February de 2019). Medio MIO: fundamento,
preparación y usos. Lifeder. Recuperado de
https://www.lifeder.com/medio-mio/.
3. Gil, Marielsa. (11 de February de 2019). Agar LIA (Lisina Hierro):
fundamento, preparación y usos. Lifeder. Recuperado de
https://www.lifeder.com/agar-lia/.
4. Gil, Marielsa. (14 de February de 2019). Caldo Urea: fundamento,
preparación y usos. Lifeder. Recuperado de
https://www.lifeder.com/caldo-urea/.
5. Acharya Tankeshwar. (2013). Agar hierro triple azúcar (TSI): principio,
procedimiento e interpretación. 2021, de GUÍA DE MICROBIOLOGÍA
MÉDICA Sitio web: https://microbeonline.com/triple-sugar-iron-agar-
tsi-principle-procedure-and-interpretation/
6. HARDY DIAGNOSTICS. (2020). SIM (SULFURO, INDOLE,
MOTILIDAD) MEDIO. 2021, de HARDY DIAGNOSTICS Sitio web:
https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/SIMMedi
um.htm
7. MDM Científica . (2020). SERIES DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
(UREA, CITRATO, LISINA, SIM Y TSI). Colombia: Medio de Diagnóstico
Médico.