UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS AGRARIAS

FACULTAD DE AGRONOMÍA

PRACTICA N° 7

“ENUMERACION DE BACTERIAS EN PLANTAS (Por Dentro)”

INTEGRANTES:

 HENRIQUEZ MOYA RODRIGO EDUARDO.

 HARO VILLANUEVA, MARIOLINA SOLEDAD.
 FLORES DEL AGUILA JOSE MANUEL.

CURSO:

 MICROBIOLOGIA AGRICOLA

DOCENTE:

 SANCHEZ ROMERO, LUIS ALBERTO

TINGO MARIA – PERÚ

2023

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 1. INTRODUCCIÓN.

En los vegetales, existe una gran diversidad de bacterias que se encuentran adaptadas a
los medios naturales que estas tienen a su alrededor, dichas bacterias pueden ser
beneficiosas o dañinas, de manera que, para identificarlas, se deben tomar muestras del
área afectada de la planta. Por ello, el presente informe está referido al estudio de los
métodos de enumeración de bacterias en las plantas, con el objetivo de distinguir
mediante las pruebas de enumeración, la contabilización de la carga bacteriana que
presenta algunas hojas colectadas.

2. REVISIÓN DE LITERATURA.

Las bacterias son microorganismos unicelulares simples que conforman una gran
diversidad, algunas bacterias son fitopatógenas, siendo causantes de diversas
enfermedades, pero en menor número que los hongos y los virus, donde a partir del daño
ocasionado, se puede generar pérdidas económicas por el bajo rendimiento de los
cultivos. Por otro lado, existen algunas bacterias beneficiosas para las plantas que ayuda
a la contribución del desarrollo de esta. (Fertilab, 2019).

Asimismo, para poder determinar la carga bacteriana que presenta una muestra vegetal,
se debe realizar los muestreos, un muestreo del tejido vegetal conlleva a realizar unas
pruebas bioquímicas descritas por (Caballero, 2005):

Prueba del Indol.

El Indol es un producto que se emplea en la degradación del aminoáciodo triptofano, es

una prueba que tiene su fundamento en la presencia de la enzima triptofanasa en la
bacteria, que descompone por hidrólisis al triptofano en compuestos de Indol, ácido
pirúvico y amoniaco. Si en la prueba la bacteria contiene la enzima triptofanasa y al añadir
gotas del reactivo de Kovacs, en el medio de cultivo con peptona se producirá un color
rojo cereza en la superficie donde la prueba es positiva.

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Prueba del rojo metilo y Voges-Proskauer (VP – RM)

Es una prueba bioquímica que se fundamenta en determinar si el microorganismo

fermenta la glucosa con producción de ácidos. Para el rojo metilo, a uno de los tubos de
ensayo en estudio, se adiciona entre 4 a 5 gotas de solución indicadora de rojo metilo y
después se debe agitar ligeramente, la prueba es positiva si la muestra vira en rojo,
mientras que será negativa si la muestra permanece amarilla. Luego, se adiciona los
reactivos 0,6 ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (α-naftol al 5% en alcohol etílico
absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. 0,2 ml del Reactivo B de Voges-
Proskauer (KOH 40%), este último consiste en la prueba de Voges-Proskauer que será
positiva si en el transcurso de 10 minutos después de agregar los reactivos, la coloración
será rosado violáceo que indica presencia de diacetilo.

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Prueba del citrato.

Es una prueba que permite determinar si un organismo utiliza citrato para su fuente de
carbono y algunos compuestos amoniacales para su fuente de nitrógeno, de manera que
su metabolismo genere alcalinidad en el medio. El microorganismo en estudio se cultiva
en un medio con agar citrato de Simmons, las cuales contiene citrato de sodio y fosfato
de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente, y azul de
bromotimol, como indicador de pH. Las bacterias que utilicen el citrato generarán un
cambio de color del medio a un tono azul intenso, por viraje del indicador de pH, azul de
bromotimol, donde la prueba resulta positiva.

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Prueba de la ureasa.

Consiste en una prueba que determina la capacidad que tiene el microorganismo de

desdoblar la urea sintetizando CO2 y 2NH3 por acción de la enzima ureas. Se cultiva el
microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa
después del autoclave con 50 ml/l de urea. Si el medio resulta un cambio de color a fucsia,
entonces indica la presencia de bacterias con ureasa, con lo cual la prueba es positiva.

Prueba triple azúcar hierro (TSI).

Es una prueba bioquímica que se fundamenta en la determinación de la capacidad de un

microorganismo para fermentar azúcares y producir sulfuro de hidrógeno. Se utiliza un
agar inclinado de un medio especial con azúcares que constituyen un colorante sensible
al pH rojo fenol, 1% de lactosa, 1% de sacarosa, 0,1% de glucosa, así como tiosulfato de
sodio y sulfato ferroso o sulfato de amonio ferroso. Entre los resultados que generalmente
se obtienen se puede describir lo siguiente: Una reacción alcalina/ácida (inclinada
roja/punto amarillo) indica la fermentación de dextrosa, mientras que, una reacción
ácido/ácido (amarillo inclinado/amarillo a tope) indica la fermentación de dextrosa,
lactosa y/o sacarosa. También, una reacción alcalina/alcalina (inclinación roja, extremo
rojo) muestra la ausencia de resultados de fermentación de carbohidratos, lo cual indica
que la prueba es negativa. (Aryal, 2022).

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Prueba del agar lisina hierro (LIA)

Consiste en una prueba bioquímica que permite determinar la capacidad de los

organismos para desaminar o descarboxilar la lisina. El medio se compone de peptonas y
lisina, conteniendo también citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio y una pequeña
cantidad de lisina, además, el medio tiene un tope anaeróbico y una inclinación aeróbica,
debido a que los procesos de desaminación y descarboxilación de lisina son procesos
anaeróbicos y aeróbicos respectivamente (Tankeshwar, 2022). Los resultados que se
pueden obtener de esta prueba se muestran en la tabla 1:

Tabla 1: Descripción de los resultados de la prueba LIA.

Color Resultado Interpretación

Púrpura a tope Alcalino Lisina desaminada negativa: Lisina
inclinado/alcalino a descarboxilasa positiva.
tope (K/K)
Amarillo a tope Inclinación Lisina desaminada negativa; Lisina
alcalina/punta de ácido descarboxilasa negativa; fermentación
(K/A) de glucosa
Inclinación roja con Inclinación roja/punta Lisina desaminada positiva; Lisina
extremo amarillo de ácido (R/A) descarboxilasa negativa; fermentación
de glucosa
Precipitado negro Producción de H2S Reducción de azufre

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Prueba SIM (medio de motilidad de indol sulfuro).

Esta prueba se fundamenta en la utilización de un medio diferencial que evalúa 3

parámetros como la reducción de azufre, producción de indol y motilidad, además de
probar la capacidad de un microbio para producir el gas sulfuro de hidrógeno. El resultado
de esta prueba será positiva si hay presencia de bacterias productoras de sulfuro de
hidrógeno, la cual se evidencia por el oscurecimiento del medio (un precipitado negro) o
el ennegrecimiento de la línea de inoculación. (Aryal, 2022).

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Prueba de Malonato.

Esta prueba tiene su fundamento en determinar si los microorganismos presentes en la

muestra de estudio utilizan el malonato de sodio como fuente de carbono. Para el
procedimiento, se utilizan tampones para estabilizar el pH del medio y se agrega colorante
azul de bromotimol, que es verde en medios no inoculados, para indicar cualquier cambio
en el pH. El resultado de esta prueba es negativo si un organismo no puede utilizar
malonato, pero logra fermentar una pequeña cantidad de glucosa, puede tornar el medio
ligeramente amarillo o no producir ningún cambio de color. En cambio, si el organismo
utiliza malonato, alcalinizará el medio y cambiará el indicador de verde a azul intenso. El
azul profundo es positivo.

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 3. MATERIALES Y MÉTODOS.

Entre los materiales que se requirió se mencionan a continuación:

Muestras

Muestra biológica u órganos vegetales (hojas)

Materiales

 Pipetas de 1 – 5 mL
 Matraces
 Incubadora
 2 placas
 Mechero.
 Azas estériles.
 Tubos de ensayo.

Reactivos

 Caldo peptona
 Agar Plate Count (PCA)

Procedimiento

Primero, cortamos el material vegetal con la ayuda de unas tijeras en un mortero estéril,
seguidamente a esto le agregamos 5 mL de caldo peptona. Luego, trituramos y mezclamos
hasta crear una suspensión homogénea.

Siembra por Vertido en Placa

 Para esto, en dos placas con Agar Plate Count (PCA), agregamos a
cada uno 0. 25 mL de la homogenización obtenida. Luego,
diseminamos cuidadosamente la muestra sobre el medio con anza
estériles.

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Incubar a 37°C por 48 horas (Lectura)

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 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

En la prueba de siembra de bacterias vegetales, se llevaron a cabo diversas evaluaciones

para obtener resultados precisos. En primer lugar, se seleccionó la placa con el mayor
número de colonias de bacterias desarrolladas. Sin embargo, es importante destacar que
solo se eligió una colonia si su desarrollo había sido adecuado. De lo contrario, no sería
eficaz para las pruebas bioquímicas.

En la Placa 1, aunque se dio el desarrollo de colonias adecuadamente, la cantidad obtenida

fue baja, lo que resultó en su descarte.

En cambio, en la Placa 2, se observó un gran aumento en la cantidad de colonias con un

desarrollo normalizado. Además, se detectaron diferentes tipos de colonias, lo cual las
hace aptas para la segunda prueba. Para ello, se tomó una muestra de cada colonia y se
introdujo en cada prueba bioquímica correspondiente.

En las pruebas bioquímicas realizadas, se obtuvieron los siguientes resultados:

Para la muestra a la cual se le aplicó la prueba de LIA, se puede apreciar un precipitado

violeta oscuro, esto significa que la prueba resultó positiva para la descarboxilación de
lisina, y negativa para la desaminación de lisina, la misma que se puede apreciar en la
figura:

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Para la muestra que fue conducida por la prueba de citrato de Simmons, se obtuvo un
cambio de coloración a un tono verde oscuro, y no resultó a un cambio de tono a azul,
esto indica que la prueba de citrato de Simmons resultó negativa ya que en la muestra no
hay presencia de bacterias que utilicen el citrato como su fuente de carbono, por lo que,
en la muestra solamente hay presencia de otras especies bacterianas que no utilizan el
citrato.

En la muestra que fue conducida con la prueba de VP – RM, la prueba resultó negativa
debido a que no hay presencia de microorganismos que puedan fermentar la glucosa, la
misma que se puede evidenciar en la coloración de la muestra que no cambió a un tono
rojizo o rosado.

Para la muestra que fue conducida por la prueba TSI, la prueba resultó negativa debida a
que no hay presencia de microorganismos que puedan fermentar diversos tipos de

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azúcares, la misma que se puede apreciar en la muestra debida a que en la muestra se
formó una reacción alcalina/alcalina de inclinación roja y extremo rojo, que muestra la
ausencia de resultados de fermentación de carbohidratos.

La muestra fue sometida a la prueba del Indol, en la cual se agregó una

solución de reactivo de Kovacs al cultivo bacteriano. El resultado de la prueba
fue negativo, lo que significa que no se observó la característica coloración
rojiza que indica la presencia de indol. Este resultado sugiere que la bacteria
en cuestión no tiene la capacidad de producir indol.

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 La muestra también fue sometida a la prueba bioquímica del malonato, donde
el resultado ser negativo, lo que indica que la bacteria en cuestión no puede
utilizar el malonato como fuente de carbono. Lo que se confirmó con la
permanencia del color verde.

Para la muestra que fue sometida a la prueba del SIM, se observó un cambio de coloración
del medio de cultivo a un tono negro y la presencia de motilidad en la zona de inoculación.
Este resultado indica que la bacteria en cuestión es capaz de producir sulfuro de hidrógeno
y es móvil. Además, no se observó un cambio de coloración a un tono rojo, lo que sugiere
que la bacteria no fermenta la glucosa.

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Para la muestra que fue sometida a la prueba de la ureasa, se obtuvo un resultado positivo.
Se pudo observar un cambio de coloración del medio de cultivo a un tono rosado intenso,
lo que sugiere que la bacteria en cuestión es capaz de producir ureasa. La ureasa convierte
la urea presente en el medio de cultivo en amoniaco y dióxido de carbono, lo que explica
el cambio de coloración observado.

5. CONCLUSION

En síntesis, las pruebas bioquímicas son eficientes para identificar bacterias de diferentes
grupos, donde estos se diferencian en el mecanismo metabólico en la que se especializan,
por lo cual, en estas pruebas se utilizan medios enriquecidos de nutrientes. Para las
pruebas conducidas en las muestras, solamente resultaron positivas las pruebas LIA, SIM
y la prueba de la UREA. Esto indica la presencia de bacterias que se adaptan a las
condiciones sujetas para cada muestra.

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 6. Referencias bibliográficas

Aryal, S. (10 de Agosto de 2022). Obtenido de Microbiology Info.com:

https://microbiologyinfo.com/triple-sugar-iron-tsi-test/.

Aryal, S. (2022). Prueba de reducción de azufre: principio, procedimiento, usos e

interpretación. Obtenido de https://microbiologyinfo.com/sulphur-reduction-
test/.

Caballero, P. (2005). Pruebas bioquímicas de identificación de bacterias. Obtenido de

https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/pruebas_bioquimicas_
de_identificacion_de_bacterias.pdf.

Fertilab. (2019). Toma de muestras para el análisis de bacterias fitopatógenas. Obtenido

de https://www.fertilab.com.mx/new/files/fito/MUESTREO-PARA-ANALISIS-
DE-BACTERIAS.pdf.

Tankeshwar, A. (2022). Agar lisina hierro (LIA): principio, composición, resultados y

usos. Obtenido de https://microbeonline.com/lysine-iron-agar-lia-principle-
composition-results-and-uses/.

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