UAEM

DIPLOMADO “MICROBIOLOGÍA”
Alumno: Gaona Uribe José Emmanuel

Investigar el fundamento de las pruebas bioquímicas de identificación de enterobacterias

Pruebas bioquímicas de identificación de bacterias

• Prueba de la Catalasa

La catalasa es una enzima clasificada como una hidroperoxidasa, esto quiere decir
que utilizan como sustrato al peróxido de hidrógeno (H2O2).

También se le considera una oxidorreductasa, ya que en la reacción donde participa

hay un elemento que sirve como donante de electrones (sustancia reductora) y otro
como receptor de electrones (sustancia oxidante).

La catalasa es una proteína que contiene un grupo prostérico con cuatro átomos de
hierro trivalentes (Fe+++), por tanto es una homoproteína. El ión férrico se mantiene
oxidado durante la reacción.

Se puede decir que la catalasa es una enzima desintoxicante, pues su función es

eliminar sustancias que se producen durante el metabolismo bacteriano que son
tóxicas para las bacterias. Entre estas sustancias se encuentra el peróxido de
hidrógeno.
• Prueba de la Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la

oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa. Los citocromos son enzimas
que forman parte de la cadena de transporte de electrones en la respiración aeróbica,
transfiriendo electrones al oxígeno, con la formación de agua. Por lo general, el sistema
citocromo oxidasa sólo se encuentra en los
organismos aerobios, algunos anaerobios
facultativos y, excepcionalmente, en algún
microaerófilo (Vibrio fetus), pero los
anaerobios estrictos carecen de actividad
oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va
ligada a la producción de catalasa, ya que ésta
degrada el peróxido de hidrógeno que se
produce como consecuencia de la reducción
del oxígeno y cuya acumulación es tóxica

• La prueba TSI
Esta prueba se recomienda para la identificación de patógenos entéricos
gram negativos. Se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y
glucosa, con formación de ácido y gas, y también para detectar producción de ácido
sulfhídrico.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato
de sodio es el sustrato necesario para la
producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio es la
fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol
es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico. El agar es el agente solidificante.
 Por fermentación de azúcares, se
producen ácidos, que se detectan
por medio del indicador rojo de
fenol, el cual vira al color amarillo
en medio ácido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de
hidrógeno que reacciona luego
con una sal de hierro
proporcionando el
típico sulfuro de hierro de color
negro.

• Prueba de lía
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El
citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son los indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH (su color es amarillo a
pH igual o menor a 5.2 y violeta a pH igual o mayor a 6.8) y el agar es el agente solidificante.
Los microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio y provocan el viraje del
color púrpura al amarillo. El ambiente ácido favorece la actividad enzimática decarboxilasa
y se metaboliza la lisina a cadaverina elevando el pH del medio de cultivo y tornándolo al
color púrpura o violeta. Los microorganismos fermentadores de glucosa que no tienen
actividad lisina decarboxilasa, producen un viraje de
la totalidad del medio de cultivo al color amarillo. A
las 24 horas de incubación se observa el fondo del
tubo color amarillo y la superficie de color violeta
debido al consumo de las peptonas que producen
alcalinidad. La generación de sulfuro de hidrógeno, se
visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a
la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los
géneros Proteus, Providencia y algunas de
Morganella, desaminan la lisina. Esto produce un
ácido alfa-ceto-carbónico, el cual con la sal de hierro
y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo
en la superficie del medio.

• Prueba del Citrato

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única
fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su
metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas
características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
 Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella
typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el
microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato
de amonio como fuentes de carbono y de
nitrógeno respectivamente, y azul de
bromotimol, como indicador de pH. Sólo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato
podrán multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto con la
eliminación del citrato (ácido), generará una
fuerte alcalinización del medio que será
aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.

• Prueba indol
El indol es uno de los productos de degradación del aminoácido triptófano. La presencia de
la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrólisis del aminoácido y su desaminación,
produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco.
La prueba del indol es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para
determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano.
Esta división molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares
diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa.
Se genera el indol por una desaminación
reductiva del triptófano via la molécula
intermediaria ácido indolpirúvico. Las
triptofanasas catalizan la reacción de
desaminación, durante el cual se
remueve el grupo amino (NH2) de la
molécula de triptófano. Los productos
finales de la reacción son el indol, ácido
pirúvico, amoníaco (NH3) y energía.
Como coenzima de la reacción se requiere
al fosfato de piridoxal.

• Voges-Proskauer
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de
fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con
producción de un producto final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica.
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa
puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías
metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido
 láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil
carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por
la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de
productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para
evidenciar la presencia de productos
finales neutros. Voges y Proskauer,
describieron una coloración rojiza que
aparecía después de adicionar hidróxido
de potasio a los cultivos de ciertos
microorganismos en medio con glucosa.
Esta coloración se debe a la oxidación
del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual
reacciona con la peptona del medio para
dar un color rojo.

• Prueba de la Ureasa
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para
hidrolizar la urea, formando dos moléculas de amoníaco por la acción de la enzima
ureasa.
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando una
molécula de dióxido de carbono y dos moléculas de amoniaco por acción de la
enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de
Proteus y se usa sobre todo para
diferenciar este género de otras
enterobacterias que dan negativo o
positivo retardado. Se cultiva el
microorganismo en slant en agar urea de
Christensen. Este medio se complementa
después del autoclavado con 50 ml/l de
urea. Ésta será degradada por aquellos
microorganismos capaces de producir la
enzima ureasa. Esta degradación produce
amoniaco que hará variar el color del
indicador de amarillo a rojo, poniéndose
así de manifiesto la actividad ureasa.
• Prueba movilidad ornitina
Se usa para determinar la movilidad bacteriana. Además, permite determinar la
capacidad microbiana de descarboxilar al aminoácido ornitina.
Medio de cultivo altamente nutritivo por la presencia de extracto de levadura,
peptona y tripteína.
La tripteína aporta gran cantidad de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa a
partir del cual se forma indol que puede ser revelado con el reactivo de Ehrlich (Indol
Reactivo REF B1550361) o de Kovac´s por la formación de un compuesto de color
rojo. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para
la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el
indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es
amarillo. El agar es el agente solicitante y a esta concentración le otorga al medio la
propiedad de ser la propiedad de ser semisólido, condición necesaria para detectar
movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del medio o por crecimiento que
difunde mas allá de la línea de inoculación del microorganismo en estudio. Los
microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio de cultivo y
producen viraje del color púrpura al amarillo. Las condiciones de acidez son
favorables para la actividad enzimática ornitina decarboxilasa, que actua sobre la
ornitina generando putrescina, con la consecuente alcalinización del medio de
cultivo y viraje al color púrpura.