Pruebas bioquímicas para gram negativos.

● Los Gram negativos pueden ser cocos, bacilos rectos y bacilos curvos.
● Los cocos pueden estar agrupados en pares o en agrupaciones irregulares.
● Los bacilos pueden tener agrupación de gaviota o irregular.

1. La primera prueba que se realiza para gram negativos es la oxidasa, la cual determina si la bacteria
contiene o no a la enzima citocromooxidasa que normalmente sólo se encuentra en los organismos
aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo.

✔ La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la

oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de
hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones
en la cadena transportadora de electrones.​
✔ La prueba de oxidasa utiliza una solución al 1% (p/vol) de
N,N,N,N–tetrametil-p-dihidroclorofenilendiamina.
✔ Su interpretación debe ser en menos de un minuto antes de que el reactivo sea oxidado por el medio.
✔ Los enterobacterales son negativo a oxidasa.
✔ Positivo azul.
✔ Negativo sin cambio de color.

2. La segunda prueba es la del citrato y en raras ocasiones acetato como única fuente de carbono. Esta
determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para el
metabolismo y el crecimiento con alcalinidad resultante.

✔ El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través
del ciclo del ácido tricarboxílico. ​El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y
piruvato que en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados
como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. ​
✔ El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa​
✔ La inoculación es por picadura y estriado.
✔ Positiva: Cambio de color a azul y crecimiento bacteriano en el estriado.
✔ Ausencia de crecimiento y viraje.
 ✔ La prueba del acetato de sodio también es empleada a la hora de determinar la fuente de carbono de
la bacteria. Esta consiste en la inoculación de medio de cultivo que contiene una mezcla de sales en
la que el acetato de sodio es la única fuente de carbono, sales de amonio como única fuente de
nitrógeno, no posee azúcares, ni inhibidores del crecimiento bacteriano y la mayoría de las
enterobacterias utilizan el acetato como única fuente de carbono, excepto Shigella spp. La
interpretación de color es idéntica a la del citrato.

3. La tercera prueba debe ser el conjunto de pruebas que determina las descarboxilaciones de las bacterias,
generalmente bacilos gram negativos como enterobacterales, Vibrio spp, Aeromonas spp y
Plesiomonas shigelloies). Este tipo de pruebas determina la capacidad enzimática de un
microorganismo para descarboxilar un aminoácido para formar una amina con la resultante alcalinidad
del medio.​

✔ La fermentación de la glucosa produce una acidificación del medio (pH < 6.0, fondo del tubo
amarillo).​ La próxima acidificación de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el
consiguiente viraje del indicador de color (amarillo al violeta).
✔ Los medios utilizados para estas pruebas son el MIO y LIA.
● El LIA es un medio solido que sirve para diferenciar enterobacterias por su capacidad para
descarboxilar o desaminar la lisina y la producir ácido sulfhídrico.​Su método de inoculación
es mediante picadura y estriado. La prueba será positiva a descarboxilización de lisina por la
enzima lisina descarboxilasa si tanto el estriado como el fondo son violetas y será negativa
si el pico es violeta pero el fondo amarillo.
● En el mismo medio de LIA se puede realizar la determinación de la desaminación de la lisina
por la enzima lisina desaminasa. Esto es útil para cepas de los géneros Proteus, Providencia
y algunas cepas de Morganella, que desaminan la lisina, esto produce un ácido
alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un
color rojizo en la superficie del medio. Esta reacción es observable en el pico del tubo que
será rojo y el fondo amarillo (ácido). Cualquier variación de estos colores se interpreta como
negativo mientras que si se presentan las condiciones antes mencionadas se tomará como
positivo.
● También es posible observar la producción de ácido sulhídrico y la producción de gas. El
H2S se oberva cuando el medio se ve ennegrecido y el gas cuando hay brubujas o elevación
en el medio.
 ● El medio MIO es donde se identifica la producción de indol, la movilidad y la
descarboxilización de ornitina por ornitina descarboxilasa. Este es un medio semisólido
utilizado en la identificación de miembros de la familia Enterobacteriaceae.
● Se siembra por picadura.
● Si el fondo del medio se vuelve color amarillo significa que es negativo a ornitina
descarboxilasa, mientras que si se mantiene de color violeta, u otro color diferente a amarillo,
la prueba se toma como positiva.
● La movilidad en MIO se observa cuando el fondo del medio se vuelve turbio y es negativo si
solamente hay crecimiento en la zona donde se inoculó o alrededor del mismo.
● La prueba del indol se realiza adicionando reactivo de Kovac (4 gotas) a la parte superior del
medio inoculado, si forma un anillo rojo es positivo a la enzima triptofanasa que desamina el
triptófano para producir indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía, si no, es negativo.
● El medio SIM también determina movimiento y producción de Indol con la misma
interpretación que en MIO.
● En el caldo arginina se identifica la deshidrolisación de la arginina por arginina deshidrolasa.
Se le agrega una gota de reactivo de neisser al medio inoculado y si hay cambio de color a
anaranjado/marrón es positivo dado que el reactivbo reacciona con el amoniaco.

4. La cuarta prueba se basa en la hidrólisis de urea mediante el medio Urea de Christensen, el cual es
recomendado especialmente para la detección de la actividad ureásica en bacterias que hidrolizan
lentamente la urea ya que la fermentación de la glucosa presente activa la enzima ureasa microbiana.
Este es el caso de Klebsiella spp., Enterobacter spp y Citrobacter spp.​

✔ En este medio se estría la superficie del pico.

✔ Si es positivo a hidrólisis de urea el medio tendrá crecimiento y adoptará un color rosado,
mientras que si es negativo permanecerá del mismo color sin crecimiento.

5. Las siguientes pruebas se basan en la capacidad de utilizar carbohidratos, como glucosa, sacarosa o
lactosa, como fuente de energía y esto se determina mediante dos medios: TSI y KIA.

✔ Todos los Enterobacterales, Vibrio spp, Aeromonas spp y Plesiomonas shigelloides son
fermentadores de glucosa.
✔ El medio KIA ​es previsto para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación
de glucosa (dextrosa), lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.
✔ La forma de inoculación es mediante picadura y estriado. La fermentación de glucosa se da
en condicionas anaeróbeas, o sea, en el fondo del tubo, y la lactosa en condiciones aerobeas
(pico). Si fermenta glucosa, el fondo adoptará un color amarillo, si fermenta lactosa, el pico
será amarillo, y si no fermenta nada, el medio se mantendrá de color rojo.
✔ El medio TSI determina la fermentación de sacarosa, glucosa y lactosa. Los últimos dos se
determinan en el pico mientras que en el fondo la glucosa.
✔ Una superficie roja y fondo amarillo significa que fermenta únicamente glucosa. Un pico
amarillo y fondo rojo que fermenta lactosa o sacarosa. Mientras que si es totalmente
amarillo fermenta glucosa y lactosa o sacarosa.
✔ El ennegrecimiento en el medio significa que hay producción de ácido sulfhídrico. La
presencia de elevación y brubujas en el agar da a entender que hay generación de gas. Esto
aplica tanto para KIA y TSI.
✔ La forma de inoculación en ambos es picadura y estriado.
Pruebas bioquímicas para gram positivos.

● Los Gram positivos pueden ser cocos y bacilos rectos.

● Los cocos pueden estar agrupados cadenas, racimos, pares y tétradas.
● Los bacilos pueden tener agrupación empalizada o de gaviotas.

1. La primera prueba a realizar para cocos gram positivos es la catalasa. En esta prueba se busca que la
bacteria tenga actividad enzimática de dicha enzima. Normalmente se presenta en aerobios obligados,
anaerobios facultativos y aéreotolerantes.

✔ La prueba de catalasa se utiliza para diferenciar a Sreptococcus spp (-) de Staphylococcus spp (+)​,
Aerococcus spp (-) de Micrococcus spp (+)​y Bacullus (+) de Clostridium (-).​
✔ La actividad de peroxidasa, cataliza la reducción(oxidación) del peróxido de hidrogeno para formar
agua y oxigeno molecular , por lo que el reactivo empleado para esta prueba es el H2O2.
✔ Se debe poner una gota de peróxido en la colonia inoculada en un portaobjetos con un palillo
aplicador de madera. Si hay producción de burbujas y efervescencia la prueba es positiva, mientras
que si no lo hay o es débil, se cataloga como negativa.
✔ No emplear colonias de medios con eritrocitos.

2. La siguiente prueba es la coagulasa que puede ser en tubo o libre y en placa sirve para diferencias al
grupo de Staphylococcus. Si da positivo en ambos, probablemente sea un S. aureus. La formación de
coágulo en la de tubo es producido por la enzima estafilocoagulasa ​

3. La siguiente prueba es la DNAsa, la cual sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de

producir la enzima desoxirribonucleasa (Dnasa) capaz de despolimerizar el ácido desoxirribonucleico
(DNA).​Es utilizada para diferenciar a los Staphylococcus catalasa positiva. Si la prueba es + se trata de
un S. aureus y si es – de un S. epidermidis.

✔ Para saber si es + debe haber un aclaramiento alrededor de la zona de inoculación.

4. La prueba de novobiocina es empleada en la diferenciación de cocos gram positivo catalasa positiva y

coagulasa negativa, como lo son el S. saprophyticus y S. epidermidis.
 ✔ Es positiva si el halo de inhibición de la novobiocina es igual de 16 mm a 27 mm. Y negativa si hay
ausencia de halo u halo de inhibición de 6 mm a12 mm.
✔ Negativa (R): Presuntivo S. saprophyticus.
✔ Positiva (S): Presuntivo S. epidermidis.

5. La prueba de PYR sirve para detectar la enzima L-Pirrolidonil arilamidasa (PYR)​. Los organismos que
contienen esta enzima hidrolizan en forma rápida el sustrato y liberan un grupo pirrólico.​

✔ Caracterización de especies de Staphylococcus; S.haemolyticus, S. intermedius, S. lugdunensis, S.

schleifery, por lo común todos PYR positivos.
✔ Prueba presuntiva especifica tanto para Streptoccus b-hemolítico del grupo A (S. pyogenes) como
para la mayor parte de las especies de Enterococcus del grupo D; diferencia los estreptococos el
grupo A de los otras especies de Streptococcus.
✔ Puede ser un placa, papel o en tubo, es positiva si hay viraje a rojo cuando se adiciona o inocula.

6. La prueba LAP (Leucina aminopeptidasa) tiene como objetivo caracterizar microorganismo cocos Gram
positivos, catalasa negativos, del género estreptococos, enterococos y microorganismos similares a los
estreptococos.

✔ Los microorganismos que contienen la enzima leucinoaminopeptidasa, hidrolizan de forma rápida el

sustrato presente en los discos de LAP y liberan β-naftilamina, que reacciona con el reactivo
cinamaldehído formándose un compuesto de color rosadorojo.​
✔ Se hace mediante un disco sobre el agar, donde el disco debe cambiar de color dependiendo de si es
positivo o negativo.
7. La prueba de optoquina determina la sensibilidad de un microorganismo a la sustancia química
optoquina. La sensibilidad a la optoquina prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana.​

✔ El disco de optoquina se utiliza de manera especifica para diferenciar entre Streptococcus

pneumoniae (Sensible, S) y otras especies de Streptococcus α-hemolíticos (viridans, resistente, R). ​
✔ La optoquina inhibe el desarrollo de Streptococcus pneumoniae mientras que otros estreptococos
(grupo viridans) no son inhibidos o presentan una zona pequeña de inhibición alrededor del disco.​
✔ Es sensible si el crecimiento inhibido alrededor del disco de 6 mm: presenta un halo de 14 mm o
mayor. En Disco de 10 mm: el halo debe ser de 16 mm o mayor para considerarse sensible.
✔ Es resistente si el crecimiento no es inhibido alrededor del disco y sirve como identificación
presuntiva de Streptococcus a-hemolítico.

8. La prueba de solubilidad en sales biliares es la prueba confirmatoria para S. pneumoniae​ ya que se

encarga de observar la capacidad de las sales de lisar S. pneumonie.

9. La prueba de CAMP se divide en:

✔ Estandarizada:
● Determina la capacidad de un microorganismo para producir y elaborar el factor CAMP, que
actúa de manera sinérgica con la β-hemolisina estafilocócica (β-lisina) sobre eritrocitos ovinos a
bovinos para producir un fenómeno lítico en la unión de los dos microorganismos.​
● Suele usarse a S. aureus como testeador por producir nivel alto de β lisina (que exhibe por lo
menos una banda de 4 mm o más de actividad de β lisina y una banda de menos de 2 mm de
hemólisis completa)​
● Es + si hay producción de zona con punta de flecha de hemólisis completa localizada en el punto
de la estría estafilocícica donde convergen factor CAMP y β lisina​
● S. agalactiae del grupo B presuntivo​
● Es negativa si hay ausencia del fenómeno de punta de flecha al incubar en jarra con vela o en
condiciones aerobias.​

✔ Inversa:

● Determina el mismo fenómeno de hemólisis sinérgica con el factor CAMP y la α-hemolisina de

Clostridium perfringens.​
 ● Distingue de manera presuntiva C. perfringens (+) de otras especies de Clostridium formadoras
de esporas y reductoras de sulfitos (-); es altamente específica para C. perfringens.​
● Se inocula un estreptococo del grupo b (S. agalactie) en medio y controles positivos (Clostridium
perfringens) y negativos (Clostridium bifermentans).
● Se toma como positiva si hay un patrón en corbata de lazo o flecha inversa de la hemólisis en la
unión de los dos cultivos. Y negativa si la zona de beta hemólisis se halla en forma de bala.

✔ Reversa:
● Es positivo para Arcanobacterium haemolyticum, es decir la hemólisis se observa fuera de la
punta de flecha. El fundamento es que la fosfolipasa D secretada por A. haemolyticum inhibe la
hemólisis producida por la β lisina de Staphylococcus aureus.​

✔ Factor equi:
● Factor equi positivo: aumento de la hemólisis de S. aureus (estría horizontal) en relación a la
estría R. equi (vertical).

10. La hidrólisis de hipurato sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo para
hidrolizar el hipurato de sodio (ácido hipúrico) a ácido benzoico y glicina por la acción de la enzima
hipurato hidrolasa (hipuricasa).​

✔ Ayuda en la diferenciación de Streptococcus β-hemolítico del grupo B bovino (S. agalacteae) (+) de
especies humanas de Streptococcus β-hemolíticos (normalmente -) y en la identificación presuntiva
de Streptococcus del grupo B.​
✔ Diferencia Campylobacter jejuni subesp. jejuni (+) y subesp. doley (+) de C. coli (-) C. lari (-) y
otras especies Campylobacter spp (-)​
✔ En prueba de glicina la aparición de un color púrpura profundo después del agregado del reactivo de
nihidrina indica la presencia de glicina en la mezcla y un resultado positivo para la hidrólisis del
hipurato. ​
 Aislamiento e identificación de bacterias de interés clínico

Pruebas bioquímicas GRAM –

Citrato MOV Indol ODC LDC LDA H2S Ureasa Cu/s KIA TSI
5. Pseudomonas + + + + - - - - - K/N K/N
aureginosa
6. Escherichia - + + + + - - - + A/A A/A
coli
7. Salmonella + + - + + - +++ - + K/A K/A
SPP
8. Proteus + + - + - + + ++ K/A K/A
mirabilis
Shigella SPP - - - - - - - - - K/A K/A
Escherichia coli - - + - - - - - - K/A K/A
inactiva

Pruebas bioquímicas para CGP

Cepa Catalasa Coagulasa (tubo) Coagulasa (lámina) DNAsa Hipurato

1 N/A N/A N/A N/A N/A
Streptococcus N/A N/A N/A N/A +
agalacteae
Staphylococcus + + + + N/A
aureus
4 N/A N/A N/A N/A N/A