Identificación de un microorganismo desconocido

Resumen. En este experimento se obtuvo una muestra desconocida aleatoriamente para identificar el posible
organismo. Se realizaron varias pruebas bioquímicas para determinar qué tipo de bacteria, de los ocho
posibles incógnitas, fue dada. Las pruebas bioquímicas realizadas incluyeron: la tinción de Gram, tinción de
cápsula, prueba de la catalasa, prueba de la oxidasa, azufre Indol motilidad, MR-VP caldo, Simmons citrato
agar, rojo fenol caldo con carbohidratos (lactosa, sacarosa y dextrosa), Triple azúcar hierro agar
MacConkey, Agar agar eosina azul de metileno, Agar agar manitol salado, gelatina, Salmonella, Shigella,
Dnasa Agar agar de prueba con bromuro de verde. Después de la tinción de Gram, se reveló el
microorganismo fue una varilla gram positivos. A continuación, el microorganismo fue inoculado en varias
secuencias de medios con el correspondiente test bioquímicos adecuados. Después de permitir el tiempo
correspondiente para cada ensayo bioquímico, se recopilan datos para determinar la bacteria desconocida. El
caldo de la cultura en este experimento se determinó como ​Bacillus cereus​.
​
KEYWORDS.----pruebas bioquímicas, varilla de gram positivos, la tinción de gram

I​NTRODUCCIÓN

Bacillus cereus ​es un bacilo Gram-positivo, formadora de esporas, motil, varilla de

aerobic que también crece bien anaeróbicamente. ​B. cereus ​es una bacteria común del suelo y se
propaga fácilmente a muchos tipos de alimentos, especialmente de origen vegetal, pero también
es frecuentemente aisladas de carne, huevos y productos lácteos. Provoca dos tipos diferentes de
intoxicación alimentaria: el tipo diarreicas y el tipo eméticos. El tipo diarreicas de intoxicación
alimentaria es causada por complejos de enterotoxinas, producidos durante el crecimiento
vegetativo de ​B. cereus​ en el intestino delgado, mientras que la toxina eméticos es producida por
las células en crecimiento en los alimentos(5).
El profesor asignado a cada par un número aleatorio que representan el microorganismo
desconocido, nuestro microorganismo desconocido era el número 6. Se realizaron varias pruebas
en el laboratorio para identificar una bacteria desconocida entre ocho microorganismos. Las
pruebas realizadas fueron: tinción de Gram, prueba de la oxidasa, catalasa, prueba SIM, Medio
MR-VP caldo, Simmons citrato agar, rojo fenol caldo con carbohidratos (lactosa, sacarosa y
dextrosa), Triple azúcar hierro agar MacConkey, Agar agar eosina azul de metileno, Agar agar
manitol salado, gelatina, Salmonella, Shigella, Dnasa Agar agar de prueba con bromuro de verde.

La tinción de Gram es casi siempre la primera prueba que se realiza para la identificación
de bacterias. La principal mancha de la tinción de Gram es un cristal violeta. Los
microorganismos que retienen el cristal violeta-púrpura aparecen complejos de yodo marrón bajo
el examen microscópico. Estos microorganismos que están manchadas por el método de Gram
son comúnmente clasificados como Gram-positivas. Otros que no están manchados por cristal
violeta se denominan Gram negativa y aparecer de color rojo a causa de la denominada
counterstain safranina(4).
La prueba de la oxidasa se usa para identificar las bacterias que producen la citocromo c
oxidasa, una enzima bacteriana de la cadena de transporte de electrones. Todas las bacterias que
son oxidasa-positivo son aeróbicos, y pueden usar el oxígeno como aceptor de electrones
terminal en la respiración. Las bacterias que son oxidasa-pueden ser negativos anaerobios,
aerobios, o facultativos oxidasa; el resultado negativo significa que estos organismos no tienen la
citocromo c oxidasa que oxida el reactivo. Puedan respirar usando otros oxidasas en el transporte
de electrones. (1)
La enzima catalasa, es producida por las Bacterias que respiran oxígeno y protege de los
subproductos tóxicos del metabolismo de oxígeno. La catalasa positivos incluyen bacterias
aerobios estrictos, así como anaerobios facultativos, aunque todas tienen la capacidad de respirar
oxígeno como aceptor de electrones de terminal. La catalasa-negativos anaerobios bacterias
pueden ser, o pueden ser anaerobios facultativos que sólo fermentan y no respiren utilizando
oxígeno como aceptor de electrones de terminal. La presencia de la enzima catalasa está
determinada por su capacidad para descomponer el peróxido en agua y oxígeno, liberando
burbujas de oxígeno. (2)
Sulfato Indol motilidad Medium (Medio) SIM se utiliza para diferenciar los bacilos
entéricos en la base de producción de sulfuro, indol la formación y motilidad. Medio SIM es útil
en el proceso de identificación de patógenos entéricos. El tiosulfato sódico y sulfato de amonio
ferroso son indicadores de producción de sulfuro de hidrógeno. El sulfato de amonio ferroso
reacciona con el H2S para producir gas de sulfuro ferroso, un precipitado negro. La peptona de
caseína es rico en triptófano, que es atacado por ciertos microorganismos que dan lugar a la
producción de indol. El indol es detectado por la adición de reactivos químicos, tras el período de
incubación. Detección de la motilidad es posible debido a la naturaleza semi sólido del medio.
El crecimiento saliendo de la puñalada línea central indica que el organismo de ensayo es motil.
Tras la incubación, observar a la motilidad (crecimiento difuso hacia afuera de la puñalada de
línea o turbidez en todo el medio) y para la producción de H2S (ennegrecimiento apuñalar a lo
largo de la línea). (3)
Simmons citrato agar es utilizado para la diferenciación de bacterias gram-negativas,
sobre la base de citrato de metabolización. Un medio líquido compuesto de sales inorgánicas en
la cual una sal de amonio fue la única fuente de nitrógeno y citrato de carbono era la única.
Organismos capaces de metabolizar el citrato crecen bien en este medio. Una reacción positiva
es indicada por el crecimiento con un intenso color azul en la inclinación. Una reacción negativa
es evidenciado por la ausencia de crecimiento para rastrear el crecimiento con ningún cambio en
el color (medio permanece verde oscuro)(3).
Rojo de metilo caldo Voger-Proskauer (MR-VP caldo) se utiliza para la diferenciación de
bacterias por medio de las reacciones de Voges-Proskauer y rojo de metilo. Rojo de metilo
positivas de los organismos producen altos niveles de ácido durante la fermentación de dextrosa,
superar el buffer fosfato Sistema y producir un color rojo a la adición de rojo de metilo indicador
de pH. En la prueba Voges-Proskauer, el color rojo producido por la adición de Hidróxido de
potasio a los cultivos de ciertas especies microbianas es debido a la capacidad de los
microorganismos para producir un producto final, acetoin neutral (acetylmethylcarbinol), a partir
de la fermentación de dextrosa. La acetoin se oxida en presencia de oxígeno y álcali para
producir un color rojo. Esta es una positiva reacción Voges-Proskauer. En la prueba de rojo de
metilo, una reacción positiva sería el color rojo en la superficie del medio; y un negativo sería el
color amarillo en la superficie del medio(3).
Caldo rojo fenol con carbohidratos se utiliza para la determinación de las reacciones de
fermentación en la diferenciación de los microorganismos. Caldo Base de fenol rojo y rojo fenol
caldo con carbohidratos son referenciados en el Bacteriological Analytical Manual para la
diferenciación de Bacillus y Salmonella. Caldos de rojo de fenol, preparados con una
concentración final de 1% de carbohidratos, son convenientes para la determinación de las
reacciones de fermentación. La mayoría de los productos finales de la fermentación de
carbohidratos son ácidos orgánicos que, en presencia de rojo de fenol, producir un cambio de
color en el medio de rojo a amarillo. Si el gas se produce durante la reacción de fermentación, se
recoge en el tubo Durham invertida(3).
Triple azúcar Agar agar de hierro (TSI) se utiliza para la diferenciación de bacilos
entéricos gram-negativos basados en la fermentación de carbohidratos y la producción de sulfuro
de hidrógeno. Agar TSI contiene tres azúcares (dextrosa, lactosa y sacarosa), rojo fenol para
detectar la fermentación de carbohidratos y sulfato de amonio ferroso para detección de sulfuro
de hidrógeno producción (indicado por el ennegrecimiento en la culata del tubo). La
fermentación de carbohidratos es indicado por la producción de gas y un cambio en el color del
indicador de pH de rojo a amarillo. Si el medio en el culo del tubo se convierte en amarillo
(ácido), sino el medio en el sesgo se torna de color rojo (alcalino), el organismo que se prueban
sólo fermenta dextrosa (glucosa). Un color amarillo (ácido) en la inclinación y butt indica que el
organismo está probando los fermentos de dextrosa, lactosa y/o sacarosa. Un rojo (alcalina) color
en la inclinación y butt indica que el organismo está probando no es un fermentador. Los
resultados de producción de sulfuro de hidrógeno en un precipitado negro en el culo del tubo. La
producción de gas está indicado dividiendo y agrietamiento del medio(3).
Agar MacConkey agares son ligeramente selectivo y diferencial de medios chapado
utilizado principalmente para la detección y aislamiento de microorganismos gram-negativos.
Agar MacConkey Agar es utilizado para el Aislamiento y diferenciación de lactosa fermentación
de la lactosa-nonfermenting bacilos entéricos gram-negativos. Agar MacConkey Agar cristal
violeta y contiene sales biliares que inhiben a los microorganismos gram-positivos y permiten a
los microorganismos gram-negativos para crecer. Las colonias de bacterias coliformes son de
ladrillo de color rojo y pueden estar rodeadas por una zona de precipitado de bilis. Este
precipitado de bilis es debido a un descenso del pH local alrededor de la colonia, debido a la
fermentación de la lactosa. Las colonias que no fermenta la lactosa permanecen incoloros. Agar
agar MacConkey es catalogado como uno de los medios recomendados para el aislamiento de E.
coli. La fermentación de lactosa microorganismos crecen como rosa a rojo-ladrillo colonias con
o sin zona de precipitado de bilis. No fermentadores de lactosa microorganismos crecen como
incoloro o colonias transparentes. (3)
Agar eosina azul de metileno es un poco selectivo y diferencial medio chapado para el
aislamiento de bacterias entéricas gram-negativos. La eosina y azul de metileno y tintes en Agar
EMB render ligeramente el medio selectivo en que inhiben a bacterias gram-positivas en un
grado limitado. Estos colorantes también desempeñan un papel en la diferenciación entre los
fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa, debido a la presencia o ausencia de tinte
de absorción en las colonias bacterianas. Coliformes, como microorganismos fermentadores de
lactosa, se visualizan como colonias de color azul-negro, mientras que las colonias de
Salmonella y Shigella, como la lactosa no fermentadores, aparecen incoloro, transparente o de
color ámbar. Algunas de las bacterias gram-positivas crecerá en este medio y suelen formar
colonias puntiformes. Un número de no patógenas, no fermentadores de lactosa bacterias
gram-negativas crecerá en este medio y deben distinguirse de las cepas patógenas por pruebas
bioquímicas adicionales. No se espera un crecimiento de bacterias gram-positivas(3).
Agar manitol salado es un medio nutritivo debido a su contenido de peptonas y extracto
de carne, que suministro de factores de crecimiento esenciales, como el nitrógeno, carbono,
azufre y oligoelementos. El 7,5% de la concentración de cloruro de sodio resulta en la inhibición
parcial o total de otros organismos bacterianos de estafilococos. Fermentación de manitol, por un
cambio en el indicador de rojo de fenol, el sida en la diferenciación de especies de estafilococos.
Después del período de incubación recomendada, las placas deben mostrar colonias aisladas y
crecimiento confluente. Los estafilococos coagulasa positivos producen crecimiento de colonias
de color amarillo con zonas amarillas. Los estafilococos coagulasa negativos se producen
pequeñas colonias de color rojo con ningún cambio en el medio. La mayoría de otras bacterias
serán inhibidas(3).
La gelatina se utiliza en la preparación de medios de cultivo microbiológicos. La gelatina
es una proteína de constitución molecular uniforme derivado principalmente de la hidrólisis del
colágeno. La gelatina se emplea en medios de cultivo para determinar gelatinolysis (elaboración
de gelatinases) por bacterias. El punto de fusión de la gelatina es entre 28 y 30°C, para que pueda
ser utilizada como agentes solidificantes. Ciertos microorganismos elaborar enzimas (gelatinases
gelatinolytic) que hidrolizan la gelatina, causando la licuefacción de un medio solidificada o
impidiendo la gelatina de un medio que contiene la gelatina. La gelatina se utiliza también como
una fuente de nitrógeno y aminoácidos(3).
Salmonella Shigella Agar (agar SS) es moderadamente selectivo y medios diferenciales
para el aislamiento de bacilos entéricos patógenos, especialmente los pertenecientes al género
Salmonella. Esta formulación no es recomendado para el aislamiento primario de Shigella. Agar
SS es designado como moderadamente medios selectivos basados en el grado de inhibición de
microorganismos gram-positivos que inhiben debido a su contenido de sales biliares, verde
brillante y los citratos. Diferenciación de microorganismos entéricos se logra mediante la
incorporación de lactosa en el medio. Microorganismos que fermentan la lactosa produce un
ácido que, en la presencia del indicador rojo neutro, resulta en la formación de colonias de color
rojo. Lactosa nonfermenters forman colonias incoloras. El segundo grupo contiene la mayoría de
los patógenos intestinales, como, por ejemplo, la Salmonella y Shigella. El tiosulfato sódico y
citrato férrico permiten la detección de sulfuro de hidrógeno producción como evidenciado por
colonias con centros de color negro. No se espera un crecimiento de bacterias gram-positivas(3).
Dnasa Agar Prueba con bromuro verde es un diferencial en los medios utilizados para la
detección de actividad deoxyribonuclease para ayudar en la identificación de las bacterias
aisladas a partir de muestras clínicas. La dnasa prueba se utiliza para detectar la degradación del
ácido desoxirribonucleico (ADN). Peptonas proporcionan aminoácidos y otras sustancias
nitrogenadas complejas para apoyar el crecimiento bacteriano. El ADN es el substrato para la
dnasa actividad. Dnasa es una enzima extracelular que rompe el ADN abajo en subunidades
compuestas de nucleótidos. Verde metilo forma un complejo con intacto (ADN polimerizado
para formar el color verde del medio. Actividad de adnasa depolymerizes el ADN, rompiendo el
bromuro verde-complejo de ADN, lo que resulta en la formación de zonas de alrededor de las
colonias incoloras del organismo de ensayo. Un examen negativo es indicado por la ausencia de
una zona alrededor de las colonias incoloras. Una reacción positiva a la prueba de dnasa Agar
con bromuro verde es una clara zona clara que rodea el crecimiento en un caso contrario de color
verde del medio. El color del medio permanece inalterada si la prueba es negativa(3).

M​ETHODOLOGY

En este experimento utilizamos una serie de pruebas con el propósito de identificar a un

microorganismo desconocido. La primera prueba se llevó a cabo la tinción de Gram. Este
proceso se inicia con la preparación de un frotis con el microorganismo desconocido. Primero
nos mancha con cristal violeta durante un minuto y enjuaga con agua. En segundo lugar, añadir
yodo durante otro minuto y enjuagarlo con agua. Utilizamos un tercero decolorizer, una mezcla
de acetona y etanol, durante 10 - 15 segundos y enjuaga con agua. Por último, nos mancha con
safranina durante aproximadamente un minuto y enjuagarlo con agua, esperar a que se sequen y
luego observarlo en el microscopio(4).
La segunda prueba fue la tinción de la cápsula. Al final de una diapositiva limpia colocar
una gota de agua, una muestra del microorganismo desconocido y una gota de tinta India todos
juntos. Por otra limpia de diapositivas propagación el frotis a través de todas las diapositivas y
espere a que se seque, no caliente. Observarlo en el microscopio.
La tercera prueba fue la prueba de catalasa. Coloque un denso bucle, del microorganismo,
desconocido en una diapositiva limpia y añadir una gota de peróxido de hidrógeno en la parte
superior de la muestra. Observar si hace burbujas o no.
 La cuarta prueba fue la prueba de la oxidasa. En esta prueba se impregnan de un hisopo
con el microorganismo desconocido y, a continuación, añadir una gota de la solución de
peróxido. Espere alrededor de un minuto para ver si ha habido un cambio en el color.
La quinta prueba fue la prueba de motilidad Indol sulfuro (SIM). Esta prueba consta de
apuñalar a la SIM con el microorganismo medio desconocido. Incubar durante 24 horas a 37​°​C.
Después de esto añadimos dos o tres gotas del reactivo Kovacs y esperar cambios en el color.
La sexta prueba fue el rojo de metilo (MRVP Voger-Proskauer caldo). Dos tubos de
inocular el caldo MRVP con el microorganismo desconocido durante 24 a 48 horas a 37 ​°​C.
Añadimos después de una incubación de 4 a 5 gotas de rojo de metilo en uno de los tubos y
esperar cambios en el color. Si la prueba es negativa a este paso, el color cambia a amarillo,
vamos a proceder con el siguiente paso. Este paso consiste en añadir 4 a 5 gotas de la VPA y
VPB reactivos al segundo tubo y esperar cambios en el color.
La séptima prueba fue el agar citrato de Simmons. Streak el agar citrato de Simmons con
el microorganismo desconocido e incubar durante 24 horas a 37 ° C. Después de esto observar si
las colonias crecían o no.
La octava prueba fue el caldo rojo fenol. Obtenemos tres tubos de caldo uno con
dextrosa, otra con sacarosa y el tercero con la lactosa. Nos inocular todos los tubos y incuban
durante 24 horas a 37 ° C.
La novena prueba fue el triple de azúcar Agar hierro test. Nos inocular el agar TSI por
apuñalamiento con una muestra del microorganismo y desconocido en el mismo paso raye la
superficie. Incubar durante 24 horas a 37C. °
La décima prueba fue la prueba de gelatina. Este consiste en la inoculación de la gelatina
líquida y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. Los próximos cinco ensayos fueron agar
MacConkey, agar eosina azul de metileno, Agar agar manitol, Salmonella y Shigella Agar Agar
dnasa y prueba. En estos últimos cinco pruebas se raya la superficie con el microorganismo
desconocido e incubar durante 24 horas a 37 ° C.

R​ESULTADOS

El microorganismo Gram positivos, es una forma de varilla y tiene una cápsula (Figuras 1
y 2). Fue positivo a la prueba de la oxidasa, el color cambia a azul en menos de un minuto
(Figura 4), y también fue positivo a la prueba de la catalasa, hizo burbujas (figura3). Con la
prueba SIM pudimos observar que el microorganismo tiene la motilidad, no metabolizan el indol
y no produce H2S (Figura 5). Con el Sr. VP prueba concluimos que el desconocido es un ácido
mixto fermentador (Figura 6). No crecen en el agar citrato de Simmons, lo que significa que el
microorganismo no metabolizan el citrato (Figura 7). En el caldo rojo fenol acaba de cambiar el
color a amarillo en el tubo, sacarosa y lactosa dextrosa en el tubo que alojamos en rojo. Esto
significa que metaboliza la sacarosa. En ninguno de ellos se produjo de gas (Figura 8). En la
triple prueba Agar azúcar cambió completamente a la amarilla significa que fermenta la mayoría
de los carbohidratos (Figura 9). Para agar MacConkey (Figura 11) y EMB (Figura 12) las
colonias no crecen lo que significa que no fermenta la lactosa. Las colonias en agar manitol
también no crecer implicando que la bacteria no es halofilic y no metabolizan el manitol (Figura
13). En Salmonella y Shigella Agar no crecen el significado no es del género ​Salmonella o
Shigella ​(Figura 14). En la dnasa agar la bacteria no crece, lo que significa que la bacteria no
tiene la enzima dnasa (Figura 15). En la prueba de gelatina alojamos líquido que significa que
produce la gelatinasa (Figura 10). Estos resultados son típicos de las bacterias gram positivas.

Discusión

Nuestro desconocido es una bacteria gram positiva de varilla con cápsula, como pudimos
ver en la tinción de Gram (Figura 1) y tinción de la cápsula (Figura 2) . tiene la motilidad, no
reduzca el indol y no producir H2S como podríamos concluir con la SIM de prueba (Figura 5).
Con la prueba de la catalasa, podemos saber que el microorganismo desconocido contiene
la enzima catalasa (Figura 4) y con la prueba de la oxidasa podemos saber tiene la enzima
citocromo oxidasa (Figura 3). El Simmons citrato agar test nos dice que el microorganismo
desconocido no puede metabolizar citrato (Figura 7). La prueba de caldo rojo fenol nos ayudó a
saber que no metabolizan la lactosa y dextrosa pero metabolizar la sacarosa (Figura 8). Esto fue
confirmado con el agar MacConkey (Figura 11) y EMB agar (Figura 12), en el que las colonias
no crecen, lo que significa que no fermentar o metabolizar la lactosa. El agar manitol sal hizo
posible conocer que el microorganismo no es halofilic desconocido y no puede metabolizar el
manitol (Figura 13). La Salmonella y Shigella Agar hizo posible para nosotros para excluir el
género ​Shigella y​ ​Salmonella ​porque nuestro microorganismo desconocido no crecen en el
agar ​(Figura 14). A través de la dnasa Agar prueba pudimos conocer no tienen la enzima dnasa
(Figura 15). Después de poner todas estas pruebas juntos podemos concluir que nuestra bacteria
microorganismo, número 6, es el ​Bacillus cereus.

R​eferences

(1) Cindy Grove Arvidson. (2010). ​Laboratorio de Bacteriología Virtual Interactivo.​ Recupera de la
Universidad Estatal de Michigan: ​http://learn.chm.msu.edu/vibl/index.html

(2) Drobniewski, F. A. (1993). Bacillus cereus y especies relacionadas. ​Microbiología clínica Comentarios,​
324-338.

(3) Mary Jo Zimbro, D. A. (2009). D​ ifco & BBL Manual de medios de cultivo microbiológicos.​ Maryland:
Becton, Dickinson and Company.

(4) Xu, George. (1997, Octubre 31). ​Tinción de Gram.​ Recupera de educación y
capacitación: ​http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm
 (5) Ivanova, N., Sorokin, A. Anderson, I., Galleron, N., Candelon, B. Kapatral, V., ... & Kyrpides, N. (2003).
La secuencia del genoma de Bacillus cereus y análisis comparativo con el Bacillus
anthracis. ​Naturaleza​, ​423​(6935), 87-91.

Apéndice A
Figura 1: Tinción de Gram

Figura 2: tinción de cápsula

Figura 3: Prueba de la catalasa

Figura 4: Prueba de Oxidasa

Figura 5: prueba de motilidad Indol sulfuro (SIM)

Figura 6: ​El rojo de metilo caldo Voger-Proskauer
Figura 7: Simmons citrato​ agar

Figura 8: ​ caldo rojo fenol

Figura 9: ​Prueba de Agar hierro azúcar triple

Figura 10:​ prueba de gelatina

Figura 11: ​ Agar agar MacConkey

Figura 12: ​ agar eosina azul de metileno

Figura 13: ​agar manitol
Figura 14: Salmonella y Shigella​ Agar
Figura 15: ​Dnasa Agar de prueba