UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN LABORATORIO DE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOQUIMICA SEMESTRE: 2021-I
SECCIÓN BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANA MICROBIANA PRUEBAS QUÍMICA INDUSTRIAL
BIOQUÍMICAS
PRIMARIAS Y SECUNDARIAS

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Fecha:

1. ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA, CUESTIONARIO PREVIO.

1. MENCIONA LAS PRINCIPALES PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRIMARIAS

Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoria de las
bacterias.

1. Tinción de GRAM.
2. Prueba de catalasa.
3. Prueba de oxidasa.
4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como  OF.
5. Motilidad.

2. ¿QUÉ INFORMACIÓN PROPORCIONAN LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRIMARIAS?

- Tinción de GRAM. Si nuestra bacteria de estudio son Gram Positivas o Negativas. las Gram
positi vas se ti ñen de color violeta y poseen una pared celular interna y una pared de peptidocluno.
y las gram negati vas que se ti ñe de color rosa que poseen una pared celular más completa

- Prueba de catalasa. El peróxido de hidrógeno es el producto fi nal del metabolismo

oxidati vo de carbohidratos, a esta vía metabólica se llama metabolismo aerobio-oxidati vo.
La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias
y anaerobias facultati vas exceptuando a  Streptococcus sp que  producen una
enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno
gas.
- Prueba de oxidasa. se basa en la identi fi cación de una enzima bacteriana  llamada
CitocromoC oxidasa. El reacti vo basado en una disolución acuosa de tetrameti l-p-
fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reacti vo de Kovacs que es
incoloro, pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un color
morado debido a que el tetrameti l-p-fenilendiamina es una amina aromáti ca y la oxidación
de esta produce quinolonas de color morado-azulado. El principal objetivo es separar
Micrococacceae (positiva) de Streptococcus spp. y Enterococcus spp. (negativa). Significa que la bacteria
si posee citocromo c oxidasa. identificación de los géneros Neisseria y Moraxella.

- Prueba de oxidación/fermentación conocida como   OF. El metabolismo oxídati vo de la

glucosa produce ácidos débiles, por lo tanto en la prueba bioquímica se uti liza de
indicador el azul de bromoti mol- Ph de vire del azul de bromoti mol:   6-7  Ácido: Amarillo   
Alcálino: Verde.

En el tubo sin aceite:   La producción de ácidos débiles reduciría el ph del medio esto será
evidenciado gracias al indicador produciéndose una coloración amarilla en todo el tubo

En el tubo con aceite:  La fermentación de la glucosa produce ácidos fuertes respecto a los
que produce la vía oxidati va. El medio se acidifi ca y el vire del indicador da como
resultado una coloración amarilla intensa en la totalidad del tubo.

Ambos tubos verdes se interpreta como: negati vo   o no sacaroliti co debido a que no

consume glucosa.

Interpreatción de tubos amarillo, amarillo: Fermentador facultati vo y se reporta como:F

Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como
reacción oxidati va y se reporta como:O

Control positi vo oxidati vo: Pseudomonas aeruginosa

Control positvo fermentador:  Escherichia coli

Control sin cambios, no consume glucosa:  Moraxella sp

 - Moti lidad. La moti lidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura
realizada en la inoculación de los medios OF o   en un medio SIM,   5-10 bacterias recorrer
todo el campo de visión para declarase una moti lidad positi va. La mayoría de las bacterias
moti les son de morfología bacilar o sea   Bacilos.,  Pero no todos los  bacilos son moti les.

3. ¿QUÉ INFORMACIÓN PROPORCIONAN LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS SECUNDARIAS?

Simple
- CITRATO. Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato como única
fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol Si el microorganismo utiliza citrato, se produce
alcalinización del medio de cultivo pasando éste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para
el citrato.
- Malonato. El malonato de sodio, es una sal orgánica que es utilizada por las bacterias como única fuente
de carbono con formaron de productos alcalinos que se evidencia por un viraje de verde a azul del
indicador del medio, azul de Bromotimol. El cambio de color de verde a azul indica una prueba positiva .
Organismo manolato positivó
- MR-VP. El Medio MR-VP se utiliza en la diferenciación de bacilos Gram-negativos entéricos
sobre la base de las reacciones de rojo de metilo y acetilmetilcarbinol (Voges-Proskauer) del
grupo Escherichia-Enterobacter. Este ensayo ahora se conoce como el test de rojo de metilo y
sirve para distinguir entre los microorganismos que producen y mantienen una alta
concentración de ácido de aquellos que inicialmente producen una pequeña cantidad y más
adelante son capaces de atacar esos mismos ácidos, convirtiendo el medio neutral o alcalino,
como especies de Enterobacter.
- Nitratos. En esta prueba se detecta una respiración anaerobia: la que utiliza nitrato como aceptor final
de electrones. Los nitratos se reducen a nitritos y algunas bacterias reducen los nitritos a productos
gaseosos ( N2 y N2O). Nitrato reductasa- coloración roja tras la adición de reactivos. Nitrito reductasa-
incolora tras la adición de reactivos
- Leche tornasol. Se basa en la capacidad de ciertos microorganismos de producir determinadas
reacciones metabólicas en medios con leche. Estas reacciones se ponen de manifiesto mediante
un indicador redox y de pH, como el tornasol.
- Color rosado en el medio de cultivo: Fermentación de la lactosa. La reacción es ácida.
- No hay cambio de color en el medio de cultivo: No se ha producido fermentación de la lactosa ni
utilización de sustancias nitrogenadas del medio.
- Color azul en el medio de cultivo: No hay fermentación de la lactosa, pero el microorganismo ha
utilizado las sustancias nitrogenadas del medio, produciendo reacción alcalina.
- Color blanco en el medio de cultivo: El color blanco indica que se ha producido una
peptonización de la proteína de la leche (digestión). El tornasol se reduce a una leucobase.
- Producción de coágulo: Su presencia indica coagulación de la leche.
- Producción de gas: La aparición de burbujas en el medio indica la producción de gas (C02 y H2).
Múltiples
- SIM (SULFHÍDRICO – INDOL – MOVILIDAD). Es un medio semi-sólido transparente que pone en
evidencia la movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Triptófano (+): observar la interfase, la
aparición de un color rojo fucsia brillante por la formación de un complejo entre el indol y el p-
dimetilaminobenzaldehido.
- TSI. El Agar-hierro-triple azúcar es un medio de cultivo. de los medios de cultivo más empleados
para la diferenciación de enterobacterias según:
 1. Fermenten o no glucosa.
2. Fermenten o no lactosa o sacarosa.
3. Produzcan o no ácido sulfhídrico.
4. Produzcan o no gas.

- (LIA) Lisina Hierro Agar. La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivasque la
transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de
bromocresol, puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a6.0).
► LD positivas - Esto produce un viraje al violeta
► LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo
►La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.

Especiales
- Coagulasa. La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus de
los Staphylococcus coagulasa negativos. S.aureus produce 2 formas de coagulasa (por ejemplo,
coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de
Clumping " se puede detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa
libre con una prueba de coagulasa de tubo.
- MIO: La reacción positiva a la ornitina está dada por la fermentación de la glucosa se reduce el pH
produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al
amarillo. Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de
ornitina decarboxilasa y producción de indol.

- (KIA) Agar Hierro de Kligler. En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas

liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las
enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. No fermentadoras: Las bacterias incapaces de
fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan todo el medio. A ROJO
No fermentadoras de lactosa: Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan
aeróbicamente la glucosa. Debido a la baja concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas
alcalinizando la superficie del medio. A AMARILLO
Fermentadoras de Lactosa: Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1%
y al término de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa del medio a amarillo

- FENIL-ALANINA-DESAMINASA. : Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la

enzima FENIL-ALANINA-DESAMINASA. El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de
la enzima, al agregar sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de manifiesto, dando a la superficie un
color verde intenso.

4. ¿QUÉ INFORMACIÓN PROPORCIONAN LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS IMViC?

Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de
cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato
- Indol. Consiste en cultivar al microorganismo de estudio en un caldo rico en triptófano; después de 24-48
horas de crecimiento se adiciona al tubo sobre el caldo xilol, para conseguir separar el indol producido, y
tras agitar se incorpora el reactivo de Kovacs (p-dimetil amino benzaldehido) un resultado positivo
mostrará la formación de un anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual pondrá de manifiesto la
presencia de Indol debido a la utilización del triptófano por el microorganismo (la molécula de tritófano
 se rompe y uno de esos productos es el Indol), un resultado negativo solo mostrara un anillo de color
amarillo propio del reactivo de Kovacs.
- Rojo de Metilo. El rojo de metilo es un indicador ctúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a
amarillo (pH 6,3)  Una reacción positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el
microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna
hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del
medio (color amarillo)
- Voges-Proskauer. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, e indicará que la
glucosa es fermentada por la vía butanodiólica.
- Citrato. Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente
de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introducción del citrato
al interior de la célula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los ácidos tricarboxilicos o
ciclo de Krebs. Se hace crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un resultado positivo es
cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es
cuando no se observa crecimiento. si el microorganismo es capaz de crecer con citrato como única
fuente de carbono, también será capaz de utilizar las sales de amonio como única fuente de nitrógeno;
con la liberación del amoniaco en utilización de las sales de amonio el pH aumentara y el indicador dará
un vire a azul, dando un resultado positivo. El medio sin inocular es de color verde, de esta manera un
resultado negativo no habrá crecimiento y el color seguirá siendo verde.
5. ¿QUÉ ENZIMA SE IDENTIFICA EN LA PRUEBA DONDE SE OCUPA PERÓXIDO AL 30%?

Catalasa
6. ¿CÓMO SE LLAMA EL REACTIVO PARA LA LECTURA DE LA PRUEBA DE OXIDASA?
La prueba hace uso de discos impregnados con el reactivo N,n,n,n-tetrametil-p-fenilendiamina (o TMFD) o N,N-Dimetil-p-
fenilendiamina (o DMFD), el cual también es un indicador redox. El reactivo pasa de azul oscuro a granate al ser oxidado,
y se vuelve transparente al ser reducido.

DMFD TMFD

7. ¿QUÉ LE DA LA CAPACIDAD A LAS BACTERIA DE MOVERSE?

Los flagelos y cilios son estructuras microtubulares, que se extienden hacia afuera en algunas células y funcionan para
darles movimiento.
 8.

9. ¿CUÁNTOS TIPOS DE UREA EXISTEN Y COMO SE LLAMAN?

De acuerdo al tamaño de sus granos, la urea se divide en tres tipos: Urea Prilada, Urea Granular y Urea Microprilada. Sus
características químicas se conservan dentro de los mismos parámetros para estos tres tipos de urea.
10. ¿CUÁL ES EL AMINOÁCIDO QUE SE UTILIZA PARA LA PRUEBA DE INDOL?
Determinadas bacterias pueden oxidar el aminoácido triptófano usando enzimas intracelulares denominadas
colectivamente ‘triptofanasa", lo que conduce a la producción de indol. El indol se detecta mediante el p-
dimetilaminocinnamaldehído
11. ¿QUÉ REACTIVOS SE UTILIZA PARA LA PRUEBA DE NITRITOS Y A QUÉ
CONCENTRACIÓN?
Con esta prueba se investiga la capacidad de las bacterias para reducir los nitratos convirtiéndolos en nitritos o en
nitrógeno, es decir se estudia la presencia de nitrato reductasa y nitrito reductasa. Se utiliza el medio de cultivo caldo
nitratos. Para revelar la presencia de nitritos en el medio se emplearán dos reactivos: reactivo A (ácido sulfamínico al
0.8% en ácido acético glacial 5N) y reactivo B (α-naftilamina al 0.5% en ácido acético glacial 5N) que se añadirán tras la
incubación.

12. ¿CUÁL ES EL INDICADOR DE PH UTILIZADO EN LA PRUEBA DE CITRATOS

Y MALONATOS?
Rojo de Metilo
13. ¿QUÉ CARACTERISTÍCAS MORFOFISIOLÓGICAS DEBEN TENER LAS CEPAS A
IDENTIFICARSE?
Qué características morfofisiológicas deben tener las cepas a identificarse