ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO

FACULTAD DE CIENCIAS APLICADAS

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

INFORME DE LABORATORIO

Nombre: Gómez Nayara, Vera Daniela, Guerrero Alexis Materia:

Fitoquímica
Practica N°: 5 Fecha: 22/10/2013
Curso/Paralelo: 5to. “B”

1. TEMA: “EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE

ANTOCIANINAS DE UVAS (Vitis vinifera) MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) Y REACCIONES ESPECÍFICAS
DE COLORACIÓN”

2. OBJETIVOS:

Objetivo General:
 Extraer, separar e identificar antocianinas de uvas (Vitis
vinifera) mediante cromatografía en capa fina (CCF) y
reacciones específicas de coloració n.

Objetivos Específicos:
 Preparar la muestra mediante maceració n de uvas frescas.
 Extraer y separar las antocianinas de la muestra (Vitis vinifera)
con metanol.
 Indicar las antocianinas presentes en Vitis vinifera que se
identificaron por CCF, mediante la comparació n del Rf
determinado experimentalmente y el Rf bibliográ fico.
 Reconocer los grupos funcionales presentes en la muestra (Vitis
vinifera) mediante reacciones de coloració n.

3. RESULTADOS
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN
Los resultados de las reacciones de identificació n de flavonoides aplicadas al
extracto de uva se detallan en la siguiente tabla:
REACCIO RESULTADO OBSERVACIONE FOTOS
N S S

Control
Extracto con
Blanco coloración vino
oscuro

Prueba Control

Toma una
Prueba de coloración rojiza
Shinoda ++
que indica la
presencia de
flavonoides.

Prueba Control

Prueba de ++ Formación de dos

Rosenheim fases , presencia de
antocianidinas,
coloración rojiza en
la fase amílica

Fase Amílica

Presencia de Prueba Control

flavonoides, el
Prueba con extracto toma una
Cloruro ++ coloración violeta
Férrico obscuro.
 Prueba Control
El extracto toma
Prueba de una coloración
Dimirot + rojiza suave, por lo
que existe presencia
de 5-
hidroxiflavonas

Prueba de Prueba Control

Tollens + El extracto
oscureció pero no
dió espejo de plata,
lo que indica
presencia de
flavonoides en
cantidades menores

Ácido Control Alcalinoo

Con solución ácida

Prueba Ácido: + el extracto paso de
Ácido Alcalino:+ vino oscuro a un
Sulfúrico rojizo claro y en
solución alcalina el
extracto se tornó de
color verde.

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (CCF)

 b=6.8

a2=5.6

a1 =4.5

Imagen 1. Cromatografía en capa fina

En la Tabla 1 se observa los valores que se obtuvieron de la corrida

cromatográ fica de capa fina de la cascara de uva (Vitis vinifera) con su
respectivo eluente y la Tabla 2 indica los factores de retardo como
resultado de la CCF .

Solvente Orgá nico n-butanol: Á cido Acético: Agua (40:10:20)

Muestra Distancia Recorrida Distancia Recorrida
muestra “a” (cm) eluente “b” (cm)
Cá scara de Uva (Vitis a1: 4.5 a2:5.6 6.8
vinifera)
Tabla 1. Valores recorridos por la muestra en el eluente n-butanol:Ac. Acético:
Agua (40:10:20)

n-butanol: Á cido Acético: Agua (40:10:20)

Rf1 Rf2
Cáscara de Uva (Vitis 66.17% 82.35%
vinifera)
Tabla 2. Constante Rf en el n-butanol: Á cido Acético: Agua (40:10:20) con la
distancia b= 6.8 cm.

4. DISCUSIÓN:
Segú n Peñ a, A. la antocianina má s importante en la especie Vitis vinifera L. es
la malvidina-3-glucó sido, lo cual se comprueba al comparar el Rf teó rico
60% con el Rf experimental 66.17%, también se observó presencia de
cianidina con un Rf experimental de 82.35%. Las estructuras de las
molé culas (malvidina-3-glucó sido y cianidina) son las siguientes:

En
la

prueba de Shinoda, la reacció n dió una coloració n rojiza, segú n Lock

(1997) la reacció n de Shinoda, genera un color, el que es indicativo de
la presencia de: flavonas y flavonoles (amarillo, rojo), flavanonoles
(rojo a magenta), isoflavonas (amarillo), flavanonas (rojo, magenta,
violeta); isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloració n, por lo
que la reacció n es positiva para la presencia de flavonas, flavonoles,
flavanonoles y flavanonas. Esta reacció n se basa en que el magnesio es
oxidado por el ácido clorhídrico concentrado, formando cloruro de
magnesio, el cual forma complejos con los flavonoides dando
coloraciones.

En la prueba de Rosenheim, la reacció n se produjo rápidamente con

la formació n de dos fases, segú n Martinez, A. et al. (2008) la prueba es
positiva de acuerdo a las observaciones realizadas y segú n Ruíz, S. et al.
(2010) concluyeron que la reacció n se lleva a cabo, debido a que el
ácido clorhídrico produce una deshidratació n del grupo hidroxilo de la
posició n 3 de la leucoantocianidina que es favorecida por la
temperatura (100ºC) y que la deslocalizació n de electrones por todo
el metabolito, produce la coloració n rojiza de la leucoantocianidina y el
alcohol amílico, es el solvente que extrae la antocianidina
deshidratada, observándose la coloració n rojiza en la fase amílica.
Aunque se realizaron pruebas para identificació n de antocianinas,
también están presentes leucoantocianidinas en menor cantidad.

La prueba con cloruro férrico, produjo una coloració n violeta oscuro

y segú n Lock, O. (1997), al reaccionar el extracto hidroalcohó lico con
solució n de FeCl3, se produce un cambio de coloració n debido a la
presencia de un compuesto fenó lico y que la aparició n de un color
azulado sugiere la presencia de un derivado de pirogalol.

En la prueba de Dimirot el extracto hidroalcohó lico dio un color

rojizo y segú n Lock, O. (1997), las 5-hidroxiflavonas en presencia del
reactivo de Dimirot: solució n de H3BO3 en Ac2O, dan soluciones
anaranjadas o rojas, por lo tanto se puede concluir que hay presencia
de 5-hidroxiflavonas en el extracto alcohó lico.

La prueba con el reactivo de tollens dió positiva ya que segú n Lock, O.

(1997) los flavonoides con dos grupos hidroxilo en posició n orto
forman un espejo de plata. Segú n las observaciones no se dió la
formació n del espejo de plata al añ adir el reactivo de Tollens pero si se
oscureció el extracto hidroalcohó lico lo cual indica presencia de
flavonoides pero en menor cantidad.
 Es conocido que las antocianidinas son más estables en un medio ácido
y segú n Montilla, E. et al. (2008) en medio á cido la forma
predominante es la del ió n flavilio, el cual da el color rojo que se
pudo comprobar en la prueba con ácido sulfúrico en las
observaciones.

Se sometió al extracto hidroalcohó lico a medio alcalino con hidróxido

de potasio y segú n Martinez, G. (2004) las antocianinas a pH alcalino
dan coloració n azul-verdoso, lo cual se comprobó en las observaciones.
Segú n Montilla, E. et al. (2008) cuando las antocianinas son
sometidas a pH bá sico o alcalino, el ió n flavilio es susceptible al
ataque nucleofílico por parte del agua, produciéndose la pseudobase
carbinol.

5. CONCLUSIONES

 Se preparó la muestra mediante la maceració n de cá scara de uva

(Vitis vinifera).
 Se obtuvo un extracto hidroalcohó lico que es polar para extraer
compuestos polares.
 En la separació n por cromatografía en capa fina se obtiene buena
separació n, identificando manchas bien definidas, con valores de Rf :
66.17, 82.35 que indican la presencia de malvidinas y cianidinas.
 La prueba de cloruro férrico es positiva, por lo tanto, indica la
presencia de fenoles.
 La coloració n de las antocianidinas depende del pH, en presencia de
HCl (pH á cido) se observó una coloració n rojiza-rosada, mientras que
cuando se añ adió una solució n alcalina la coloració n fue verde oscura.

6. BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA

 Sing de Ugaz O.; 1997; Colorantes Naturales, [Consultado:

19/10/2013] Disponible en: http://books.google.com.ec/books?
id=LjmH_3qjaEIC&dq=prueba+de+shinoda+chalconas+y+auronas&hl
=es&source=gbs_navlinks_s
 Ruiz, Venegas, Chavez, Eustaquio, 2010, Identificació n preliminar de
los metabolitos secundarios de los extractos acuosos y etanó licos del
fruto y hojas de Morinda citrifolia L.[ Consultado e: 19/10/2013].
Disponible en:
http://revistas.concytec.gob.pe/pdf/scientia/v2n2/a02v2n2.pdf
 Martinez A. et al. 2008. MANUAL DE PRÁ CTICAS DE LABORATORIO
DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 2008. UNIVERSIDAD DE
ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉ UTICA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA. Medellin. [Consultado:
19/10/2013]. Disponible en :
http://farmacia.udea.edu.co/~ff/manual2008.pdf
 Taiz L.; Leiger E.; 2006; Fisiología Vegetal, [Consultado: 19/10/2013]
Disponible en:http://books.google.com.ec/books?id=7QIbYg-
OC5AC&pg=PA551&lpg=PA551&dq=metabolitos+secundarios+antoci
aninas&source=bl&ots=nhrM2Z0zxj&sig=uoXgUmCQvJd7LvaE6Kpe5
FcGdL8&hl=es&sa=X&ei=mEmyUJOMIoqk8gTv7YGoDA&ved=0CGcQ6
AEwCQ#v=onepage&q=metabolitos%20secundarios
%20antocianinas&f=false
 Aguilera M.; Reza M.; Chew R.; 2011; Propiedades Funcionales De Las
Antocianinas, [Consultado: 19/10/2013] Disponible en:
http://www.biotecnia.uson.mx/revistas/articulos/16-BIO-11-DPA-
06.pdf
 Wrolstad, R E. 2004. Anthocyanin Pigments-bioactivity and Coloring
Properties. J Food Sci. 69(5):C419-C425.

7. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el rol biológico de estos metabolitos secundarios?

 Dan los colores a ciertas partes de las plantas por lo que ayudan
interacció n planta-animal para la polinizació n y dispersió n de
semillas.
 Las antocianinas pueden encontrarse en las hojas, haciendo que las
mismas muestren un color rojizo. Esta coloració n puede deberse a un
mecanismo de defensa, para proteger a las plantas, sus flores y sus
frutas contra la luz ultravioleta (UV) y, por su propiedad antioxidante,
evitar la producció n de radicales libres.
 Atraen a los polinizadores a sus flores mediante los brillantes colores
provistos por estos compuestos.
 Son reguladores del crecimiento vegetal.
 2. ¿Qué funciones cumplen en el hombre?

Las antocianinas ejercen efectos terapéuticos, incluyen la reducció n de

enfermedades coronaria,
efectos antitumorales, antinflamatorios y antidiabéticos, ademá s del
mejoramiento de la agudeza visual y del comportamiento cognitivo. Los
efectos terapéuticos de las antocianinas está n relacionados con su actividad
antioxidante. Estudios con fracciones de antocianinas provenientes
del vino han demostrado que estas son efectivas en atrapar especies
reactivas del oxígeno, ademá s de inhibir la oxidació n de lipoproteínas y la
agregació n de plaquetas.  (Ruiz et al , 2010)

3. ¿Qué aplicaciones puede darles a estos metabolitos?

Dentro de la industria de alimentos como colorantes naturales pueden

utilizarse las antocianinas para colorear alimentos como refrescos, yogurt,
cerezas, caramelos, helados, entre otros. Para remplazar aquellos colorantes
sintéticos y artificiales (Ló pez et al, 2008)

4. Realice un cuadro sinoptico y decriba las características de los

diferentes esqueletos Flavonoides.

Los Flavonoides se clasifican de acuerdo a la posició n del anillo B:

Clasificación de
los flavonoides

Flavonoides Isoflavonoides Neoflavonoides

La unión del La unión del La unión del

anillo B se da en anillo B se da en anillo B se da en
el carbono 2 el carbono 3 el carbono 4
 Los Flavonoides se clasifican en:
Flavanonole
Chalconas Flavonas Flavonoles Flavanonas Auronas Antocianidina
s

Anillo central
Derivados de
Anillo central heterocíclico
Poseen la 2-fenil-γ-
heterocíclico, saturado Se forma un
una cromona Anillo Provienen del
doble y grupo anillo
estructura Anillo central central carion flavilio,
enlace entre carbonilo en pentagonal y
C6C3C6: heterocíclico, heterocíclico no tiene grupo
carbonos 2 y posición 4. el anillo B
2 anillos doble saturado ceto, puede
3 y un grupo Grupo suele estar
aromáticos enlace entre y grupo glucosidarse
hidroxilo en Hidroxilo en unido
unidos por carbonos 2 y carbonilo en en el carbono
posición 3. posición 3. mediante un
una cadena 3 y un grupo posición 4. C3 o C5.
Un carbono Dos doble enlace.
de 3C carbonilo en
quiral. carbonos
posición 4.
quirales.

5. ¿Cuál es el mecanismo que utilizan estas moléculas para actuar como

antioxidantes?

Se da mediante una reacció n química de transferencia de electrones de una

sustancia a un agente oxidante. Las reacciones de oxidació n pueden
producir radicales libres que comienzan reacciones en cadena que dañ an las
células. Los antioxidantes terminan estas reacciones quitando intermedios
del radical libre e inhiben otras reacciones de oxidació n oxidá ndose ellos
mismos. El estudio de la capacidad antioxidante de las antocianinas se
relaciona con el nú mero de grupos –OH que presentan y el lugar de la
sustitució n en la que se ubique (Taiz; 2006).
6. ¿Por qué es importante el consumir una cierta cantidad de estos
compuestos en la alimentación?

Las antocianinas son pigmentos que ejercen efectos terapéuticos conocidos

que incluyen la reducció n de la enfermedad coronaria, efectos
antitumorales, antiinflamatorios y antidiabéticos, ademá s del mejoramiento
de la agudeza visual y del comportamiento cognitivo. Los efectos
terapéuticos de las antocianinas está n relacionados en prevenir el dañ o
celular mediante el efecto antioxidante y la capacidad antitumoral (Aguilera,
2011)