INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL
ALUMNOS
CRUZ JIMENEZ LUIS ANGEL
CALZADA CONTRERAS JAZMIN
SECCION: 3
PARCTICA 1 : DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE
METODO DE SANGER

INTRODUCCION : Preparacion del derivado dinitrofenilado de la

Las protenas son molculas formadas
por aminocidos que estn unidos por un tipo de
enlaces conocidos como enlaces peptdicos. Las
protenas suponen aproximadamente la mitad del peso
de los tejidos del organismo, y estn presentes en todas
las clulas del cuerpo, adems de participar en
prcticamente todos los procesos biolgicos que se
producen. Los aminocidos son compuestos cristalinos
que contienen un grupo cido dbil, carboxilo (-COOH)
y un grupo bsico dbil, amina (-NH2), unido al carbono
y todo aminocido tiene un grupo amino terminal y un
grupo carboxilo terminal .
La determinacin de la estructura total de la molecula de
insulina fue realizada en 1984-1953 por el Dr . Frederick
sanger (premio nobel de qumica, 1964) en una serie de
brillantes investigaciones en el curso de las cuales se
introdujeron un buen numero de tcnicas para la
determinacin de secuencias de aminocidos en cadenas
ppticas . circunstancia favorable en esta rea analtica
fue la probabilidad de escindir la molecula de sus enlaces
disulfuro mediante oxidacin por acido performico .
OBJETIVOS :
Indentificar el aminocido alfa-amino terminal
de las cadenas de la molecula de hemoglobina
mediante el mtodo de sanger .
hemoglobina .
En un tubo adicionamos nuestra muestra de
hemoglobina agregando bicarbonato de sodio para
solubilizar la hemoglobina , seguido de eso le agregamos
el reactivo 1-fluor -2,4-dinitrobenceno ( DNFB ) y
agitamos vigorosamente por una hora para que
reaccionara con los aminos libres dando formacin
dinitrofenilos derivados , dando una pigmentacin
amarilla .Adicionaremos HCl para hidrolizar
provocando el rompimiento de enlaces peptdicos
liberando agua , seguido adicionaremos ter saturado
con solucin acuosa de sulfato frrico para estabilizar
la reaccin y eliminar los residuos de aminocidos con
cadena sin presencia de N- terminal . Despues
colocamos nuestro tubo a bao maria para eliminar los
vapores de ter que ayan quedado , aadimos HCL para
hidrolizar y dejarlo en la autoclave 3 horas a 15 libra
por pulgada cuadrada de presin . En la siguiente sesin
volvimos a agragra el ter para eliminar los residuos que
se encuentran en la fase acuosa y extraer nuestra
muestra que solo contiene los aminocidos libres y
dinitrofenilados derivados . Calentamos nuestra muestra
en una parrilla casi a sequedad para eliminar los residuos
de ter sobrante y enfriamos . Agregamos etanol para
disolver nuestra muestra y precedemos a realizar la
cromatografa en papel de los aminocidos
dinitrofenilados de la hemoglobina .
Cromatografia en papel de los aminocidos
dinitrofenilados tipo y la muestra problema .

En nuestro papel whatman colocamos diferentes

muestras de los derivados dinitrofenilados de los
RESULTADOS : aminocidos : Valian , Alanina , Fenilalanina , DNFB ,
y nuestra muestra problema , utilizando acido ctrico
citrato como solvente dejndolo saturar por 4 horas y
dejar secar , por ultimo precedemos a calcular los rf de
las muestras para saber que contiene nuestro problema .
En la siguiente pagina se incorpora la tabla anexa de
los resultados del cromatograma .
Que se hizo Para que lo hize
Agregamos bicarbonato Para solubilizarla y para
de sodio a la hemoblobina darle un pH alcalino a la
reaccin ya que el mtodo
de sanger ocurre en
medio alcalino
Agregamos el reactivo para que reaccionara con
DNFB y agitamos los aminos libres , y
vigorosamente formar dinitrofenilos
derivados , dando una
pigmentacin amarilla ,
para facilitar la
identificacin de
aminocidos y separa los
mismo , dejando
etiquetado el amino
terminal con el color
amarillo
Adicionamos HCl 3N Para que detener la
reaccin y deje de
nitrofenilar con el cambio
brusco de pH , El mtodo de sanger de secuencia de aminocidos
cambindolo a un medio
acido para que la reaccin
de sanger ya no se pueda
realizar y se detenga la
reaccin .
Agregamos ter saturado Para estabilizar la
con solucin acuosa de reaccin y disminuir la presencia de temperatura y presin por lo cual el 2,4-
sulfato frrico . reactividad de la reaccin dinitrofenilado del aminocido se identifica presentando
ya que esta con eter puro
puede ser muy brusca y
asi eliminar los residuos
de aminocidos con
cadena sin presencia de N
Terminal .
Colocamos el tubo a bao Para eliminar los vapores
maria de ter que aya quedado .
Aadimos HCl 6 N Para Hidrolizar
Se dejo en autoclave 3 Para romper los enlaces
horas a 15 libras sobre peptdicos debido a que
pulgada cuadrada estos enlaces son difciles
de romper .
Tubo que quedo Contenia la protena rota
en pedacitos ya que los
enlaces peptdicos se
haban roto y una
contenia el aminocido
dinitrofenilada ,
entonces al final solo
quedaban aminocidos ,
y no todos
dinitrofenilados ya que
paso por un preceso de
hidrolizis de tipo acida y
a una alta presin y
temperatura para romper
los enlaces peptdicos , es
decir fracionamos en
pedazos nuestra protena .
Agregamos de nuevo ter Para eliminar los residuos
saturado y comenzamos que se encontraban en la
con otra extraccin fase acuosa y extraer
nuestra muestra que solo
contiene los aminocidos
libres y dinitrofenilos
derivados .
Calentamos en la parrila Para eliminar los residuos
de ter de la sustancia
Enfriamos y disolvimos Para disolver nuestra
en acetona muestra y realizar el
cromatograma .
DISCUSIN :
emplea el reactivo DNFB para identificar al aminocido
N terminal de protenas , el grupo alfa amino del
aminocido esta libre y dezplaza al fluor del reactivo
produciendo HF y un pptido en el que el aminocido N
terminal queda enlazado al resto 2,4-dinitrobenzeno .
El petido restante se aisla e Hidroliza utilizando HCl , en
coloracin amarilla , lo cual indica la presencia del
aminocido alfa terminal de la hemoglobina a un pH
bsico .
CONCLUSIONES :
Al obtener la relacin de diferentes sustancias logramos
identificar que aminocidos contena nuestra solucin
problema, al comparar nuestra solucin problema, nos
dimos cuenta de que haba DNP- Val, debido a sus
valores de RF cercanos, por lo cual podemos concluir
que la hemoglobina tiene como aminocido N-terminal
a la Valina en sus cuatro cadenas ya que no se
presentaron coincidencia con otro aminocido tipo.
BIBLIOGRAFIA :
Bioqumica 4ta edicin . chistopher K. , K.E Van
Holde , Dean R.A , Spencer J., Ed Pearson ,pp
1357 , 2013.
Fundamentos de bioqumica , jose M. y
Armando G. Ed. Tebar , pp 444, 2006