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Propiedades cualitativas de aminocidos y protenas

Objetivo
Identificar por medio de pruebas cualitativas generales y especficas los grupos qumicos de las protenas y los aminocidos. Aplicar pruebas a protenas con agentes fsicos y qumicos para desnaturalizarlas.

Introduccin
Las unidades bsicas estructurales de todas las protenas son los -aminocidos, los cuales son sustancias en las que el grupo amino se localiza en el tomo de carbono inmediatamente adyacente al grupo acido carboxlico. Por lo tanto, siempre hay un tomo carbono entre el grupo amino y el grupo acido carboxlico. (Brown, T. 2009) Las protenas son molculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. Las protenas desempean un papel fundamental para la vida y son las biomolculas ms verstiles y diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo y realizan una enorme cantidad de funciones diferentes Muchas son las pruebas para identificar aminocidos y protenas presentes en las estructuras corporales o integradoras de los organismos vivos. Podemos mencionar y especificar las siguientes pruebas para aminocidos: Prueba de ninhidrina: La prueba de ninhidrina es positiva para aminocidos y protenas que tengan un grupo -NH2 libre. (Alices, H. 2009) Acido glioxlico: identifica grupo indoloico, que est presente en el triptfano, destacando un color en la interface. Prueba xantoproteca: reconoce anillos aromticos, dando positiva con tonalidades amarillas o naranja Prueba de cistena: positivo con formacin de precipitado de color negro

Adems se utilizan pruebas para identificar las protenas que son fsicas, y consiste en someter a cambios de temperatura, pH y reacciones sencillas de prueba como el Biuret que es positiva si se torna violeta.

Materiales
Tubos de ensayo Goteros Plancha Bao mara Vasos qumicos de 100, 250, 500 mL Indicador universal Probetas de 5, 10, 50 Gradilla
Imagen 1. laboratorio. Materiales usados en el

Reactivos
Cuadro 1. Reactivos y su descripcin Glicina 1% Tirosina Triptfano (C2H2NO2) (C9H11N1O3) (C11H12N2O2) 75,07 236 1,607 g/L Soluble Solido Blanco No es toxico, es abundante en el organismo 181,21 Soluble Liquido Incoloro No es toxico 204,23 228 291 1,34 g/cm3 Soluble Cristales Blanco o amarillo Aminocido esencial Cistena (C3H7NO2S) 121,16 240 Soluble Solido Incoloro Aminocido esencial

Reactivo Masa molar


(g/mol)

Punto de fusin (C)


Punto de ebullicin (C) Densidad

Solubilidad
Estado Apariencia

Toxicidad

Reactivo Masa molar


(g/mol)

Fenilalanina (C9H11NO2) 165,19 283 Insoluble Liquido Verde Aminocido no esencial

Acido ntrico concentrado (HNO3) 63,012 -42 83 62,012 Soluble Liquido Incoloro Corrosivo e irritante por contacto con tejidos Acetato de plomo 2% [Ph(C2H2O2)2] 63,012325,2 75 100 Soluble Solido Blanco Irritante por contacto

Hidrxido de sodio (NaOH) 40,01 318,4 1388 2,13 Soluble Cristales Blanco o amarillo Irritante y corroe los tejidos

Acido actico glacial (C2H4O2) 60,05 17 118 1,049 Liquido Incoloro Liquido incoloro corrosivo irritante

Punto de fusin (C)


Punto de ebullicin (C) Densidad

Solubilidad
Estado Apariencia

Toxicidad

Reactivo Masa molar


(g/mol)

Acido sulfrico concentrado (H2SO4) 98, 08 10 337 1,8 g/cm3 miscible Liquido Aceitoso mal oliente Toxico por contacto y ingesta

Reactivo de biuret 40,103,0 189 0,45g/cm3 20 g/L Polvo o liquido Blanco o azul Irritante y corroe los tejidos

Acido clorhdrico (HCl) 36,42 -46,2 90 1,19 gr/cc Liquido Incoloro Corrosivo, irritante con enrojecimiento

Punto de fusin (C)


Punto de ebullicin (C) Densidad

Solubilidad
Estado Apariencia

Toxicidad

Adems se utiliza albumina (del huevo) y la casena.

Procedimientos:
I. Aminocidos: A. Reaccin con la Ninhidrina: 1. Colocamos en un tubo de ensayo 20 gotas de Fenilalanina + 5 gotas de ninhidrina. 2. Calentamos el tubo de ensayo en bao mara y observamos que cambios presento la muestra. 3. Repetimos los pasos anteriores con Tirosina y Glicina. Un color azul purpura indica prueba positiva. B. Reaccin del cido Glioxlico: 1. Colocamos 1mL de Triptfano + 1mL de cido actico glacial. 2. Agregamos 1mL de H2SO4 concentrado por las paredes y sin agitar. 3. Observamos si hay cambio de coloracin en la interfase. 4. Repetimos los pasos anteriores con Glicina. La formacin de un anillo violeta en la interfase, se considera una reaccin positiva. C. Reaccin de Xantoproteica: 1. En un tubo de ensayo colocamos 10 gotas de Fenilalanina + 10 gotas de HNO3 2. Mezclamos y calentamos en bao mara, luego aadimos 10 gotas de NaOH 10M y observamos los cambios en la muestra. 3. Repetimos los pasos anteriores con Cistena y Triptfano. Un color amarillo/naranja nos indica un resultado positivo. D. Reaccin con Cistena: 1. Colocamos en un tubo de ensayo 1mL de Cistena +5 gotas de NaOH +10 gotas de acetato de plomo y calentamos la muestra en bao mara. II. Protenas: A. Prueba de Biureth: 1. Colocamos en un tubo de ensayo 10 gotas de biureth + 10 gotas de leche, mezclamos y observamos cambios que presento la muestra. 2. Repetimos el proceso con clara de huevo. B. Desnaturalizacin por calor y pH extremos: 1. Colocamos 5mL de leche + 10 gotas de HCl 1M en un tubo de ensayo. 2. Colocamos en un tubo de ensayo 5mL de _____ + 10 gotas de NaOH 1M. 3. Calentamos ambos tubos de ensayo y dejamos enfriar para observar cambios en las muestras.

C. Desnaturalizacin por metales pesados: 1. En un tubo de ensayo colocamos 2mL de leche+ acetato de plomo. 2. Agitamos y observamos cambios en la muestra. 3. Repetimos los pasos anteriores con albumina

Resultados y discusin:
I. Aminocidos A. Reaccin con la Ninhidrina:

Esta es una reaccin de 2 etapas: En la primera etapa la ninhidrina oxidante reacciona con el aminocido por una descarboxilacin oxidativa y desaminacin del aminocido produciendo dixido de carbono, amonaco y un aldehdo que contiene un tomo de carbono menos que el aminocido original, adems de la formacin de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. En la segunda etapa el derivado de la Ninhidrina, la hidrindrantina, reacciona con una molcula de Ninhidrina para condensarse en presencia de amoniaco y formar el producto coloreado llamado violeta o purpura de Ruhemann. Cuadro N 1 Reactivo Fenilalania Tirosina Glicina

Color inicial Lquido transparente Lquido transparente Lquido transparente

Color final Violeta Violeta Violeta

Figura1: de izquierda a derecha: Muestras de Fenilalanina, Tirosina y Glicina

La reaccin de Ninhidrina (Figura 1) tiene como objetivo detectar aminocidos, los resultados obtenidos presentados en el Cuadro N1, muestran el cambio de la coloracin, aprecindose un color violeta o morado, coloracin que indican una prueba positiva o la presencia de aminocidos. Los productos finales violeta obtenidos de la prueba de la Ninhidrina son conocidos como bases de Schiff.

B. Reaccin del cido Glioxilico: Es denominada comnmente en la literatura como Prueba de Hopkins-Cole (Cuadro N2) empleada para identificar el triptfano, debido a que el nico aminocido con grupo indol. El anillo de indol reacciona con el acido glioxilico en presencia de un acido fuerte. El Indol es un compuesto orgnico heterocclico, con estructura bicclica que consiste en un anillo de seis miembros (benceno) unido a otro de cinco miembros (pirrol). Cuadro N 2 Reactivo Triptfano Glicina

Color inicial Lquido transparente Lquido transparente

Cambio Color caf rojizo en la interfase Incoloro

Figura 2: de izquierda a derecha: Muestras de Triptfano y Glicina.

Observamos que la muestra de glicina conserva la apariencia incolora inicial (figura 2), lo que indica una prueba negativa y apreciamos un cambio de color en la interfase en el tubo de ensayo que contiene el Triptfano dando as positivo para la prueba de Hopkins-Cole.

C. Reaccin con Xantoproteica: Cuadro N 3 Reactivo Color inicial Fenilalania Cristales blancos Cistena Cristales blancos Triptfano Cristales blancos

Color final incoloro Amarillo Naranja con precipitado

Los muestras que presentaron coloracin amarilla y naranja indicados en el Cuadro N3 son los que dan positivo a esta prueba, caracterizada por la presencia de anillos aromticos. Observamos la coloracin inicial amarilla de las soluciones al adicionar HNO3 concentrado obligando a la formacin de un nitrocompuesto. La nitracin del anillo aromtico por la introduccin de un grupo nitro. Mediante el tratamiento alcalino con NaOH se neutralizaron las soluciones, se formaron sales de los nitrocompuestos y se observ el cambio de color amarillo a distintas tonalidades naranja de las soluciones que como ya se mencion dieron un resultado positivo para esta prueba.

Figura 3: de izquierda a derecha: Reacciones con Fenilalanina, Cistena Triptfano.

La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realizo este laboratorio (figura 3), ya que es ms difcil de nitrar para lo que se necesitara emplear acido sulfrico como catalizador. D. Reaccin con Cistena: Los aminocidos azufrados como la metionina y la cistena se reconocen por la formacin de precipitados de sulfuro de plomo de color gris oscuro o negro que se forma cuando reacciona con acetato de plomo alcalino. Como se aprecia en el cuadro N4 La aparicin de un precipitado negro nos da un resultado positivo para la prueba de cistena con metales pesados.

Cuadro N 4 Reactivo Cistena +acetato de plomo Color inicial Lquido transparente Color final Precipitado negro

Figura 4: Muestra de Cistena

El grupo tiol presente en la cistena tiene gran afinidad con los metales pesados, por lo que protenas que contengan cistena se unirn a metales como el mercurio, plomo y cadmio fuerte. En esta prueba se utilizo el acetato de plomo con el que la cistena reacciono produciendo el precipitado negro (figura 4). II. Protenas: A. Prueba de Biureth:

La prueba de Biureth se utilizo que detectar la presencia de protenas como se aprecia un los resultados en el Cuadro N5. Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. El hidrxido de potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

Figura 5: obtencin de la albmina.

Cuadro N 5 Reactivo Leche Albumina (huevo) Color inicial blanco transparente Color final Violeta claro Violeta intenso

Figura 6: de izquierda a derecha: Leche y albumina.

La prueba positiva es la formacin de un complejo de color violeta (figura 6). Luego de realizada la reaccin de Biureth la muestra de leche se torno violeta claro, por lo que podemos decir que existen enlaces pepiticos y por lo tanto la muestra de leche contiene enlaces peptdicos debido a protenas como la casena, y la muestra de albumina se torno de violeta intenso, esta intensidad nos indica un mayor nmero de enlaces peptdicos.

B. Desnaturalizacin por calor y pH extremos: Al someter al calor y cambiar el pH de la leche las protenas sufren lo que se denomina desnaturalizacin, y diferentes cambios como se presenta en el Cuadro N6, microscpicamente se desorganizan y se despliegan, macroscpicamente se observa como la leche se corta o forma precipitados. Cuadro N6 Reactivo Leche +HCl Leche +NaoH Color inicial blanco blanco Color final Blanco Amarillo

Figura 7: de izquierda a derecha: leche+NaoH y leche+ HCl

En el tubo de ensayo que se le adiciono HCl (figura 7) se observa el precipitado de casena que se obtiene al cortar la leche, por accin del cido con la lactosa y se forma acido lctico. La casena es un slido blanco-amarillento, sin sabor ni olor, insoluble en agua. Se dispersa bien en un medio alcalino, como una solucin acuosa de hidrxido de sodio: NaOH, formando caseinato de sodio.

C. Desnaturalizacin por metales pesados: Cuadro N 7 Reactivo Leche +acetato de plomo Albumina (huevo) +acetato de plomo Color inicial Blanco Blanco Color final Blanco con precipitado Gris con precipitado

Figura 8: de izquierda a derecha: muestras de leche y albumina

La presencia de un precipitado indica una prueba positiva para la desnaturalizacin de protenas (Cuadro 7) por medio de la accin del acetato de plomo (figura 8), en la muestra de leche precipita la casena y en la muestra de clara de huevo se observa la albmina; el huevo y la leche poseen albumina: el huevo ovoalbmina y la leche posee lactoalbmina.

Conclusin

Reconocimos los diversos grupos qumicos de los aminocidos y protenas puesto que existen pruebas generales y especficas como la del cido glioxilico que nos indica la presencia de triptfano, entre otras pruebas similares. Desnaturalizamos protenas con mtodos fsicos como los metales pesados y qumicos como con el HCl y NaOH, lo que nos muestra una propiedad importante de las protenas tienen condiciones necesarias para su funcin y cualquier cambio de estas condiciones puede daar la estructura de la misma y desnaturalizarla.

Bibliografa

Referencias Alices, H (enero-mayo de 2009) BIOQUMICA PROTEINAS Y AMINOCIDOS- Recuperado de: http://agu.inter.edu/halices/caseina.pdf Brown, T. LeMay, H. Bursten, B. Murphy, C, (2009); Qumica, la Ciencia Central; Mxico: decimotercera edicin; Pearson Educacin

Consultas: Foster, C; Mistry, N; Peddi, P; Sharmas, S. (2010); Manual Washington de terapia medica; Barcelona, Espaa: treinta y tres ava edicin; WoltersKluwer. Pginas 60 a 75. Smith, C; Marks, A; Lieberman, M. Bioqumica Bsica de Marks. Madrid, Espaa: McGrawhill-interamericana de Espaa. Paginas 47-48

Cuestionario

1. Describa la reaccin de la Ninhidrina con cido asprtico, lisina y glutamina. La reaccin de Ninhidrina es sensible a los pH de 4 a 8 y a los grupos aminas. Estudiando la composicin de los siguientes aminocidos puede decir que la reaccin es: cido asprtico: positiva por la presencia del grupo amina. Lisina: tambin positiva por la presencia de dos grupos aminos. Glutamina: posible reaccin por las aminas de su estructura.

2. Se tienen cuatro frascos sin rotular, que se sabe contienen soluciones de los siguientes aminocidos: glicina, arginina y tirosina y otro con el tripptido Gli- Arg- Gli. Como los identificara. El primer paso es aplicar calor para reconocer la presencia de anillos aromticos que dara positiva solo para tirosina, luego se le aplica la Ninhidrina para detectar el grupo nitrgeno dando positivo para arginina y glicina y para el tripptido Gli-Ar-Gli. 3. Enumere cuatro agentes fsicos y agentes qumicos que pueden desnaturalizar las protenas. Agentes qumicos: Detergentes Disolventes orgnicos pH fuerza inica. Agentes fsicos: Calor Radiacin ultravioleta Altas presiones Fro

4. Como afecta la fuerza inica del medio la solubilidad de las protenas. En general las protenas requieren algo de sal para entrar en solucin (Fenmeno de saltingin). El salting-in es el fenmeno por el cual la concentracin de sal aumenta la solubilidad de la protena. A altas fuerzas inicas, la solubilidad de la protena disminuye, este fenmeno es conocido como salting-out, y se da bsicamente por la competencia de las molculas de agua que forman parte de la capa de solvatacin.