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PRUEBAS

FITOQUMICAS

Preparacin de extractos
Extraccin con agua mediante el proceso de
extraccin continua, utiliza un percolador de acero
inoxidable que contiene una muestra del material seco
y molido. Se recircula hasta agotamiento total y se
deja en reposo por algunas horas. Finalmente, se filtra
y se concentra por liofilizacin.
Solventes orgnicos, ej etanol y n-hexano; se realiza
la extraccin continua por soxhlet en muestras
diferentes. Los extractos obtenidos se evaporan hasta
sequedad a presin reducida en un rotaevaporador.

Pruebas Fisicoqumicas
Preliminares
Flavonoides:
Prueba de vapores de amoniaco y/o una
reaccin del extracto diluido con gotas de
hidrxido de sodio. (Barba, 1997)
Alcaloides:
Una porcin del extracto (acuoso, etanlico y nhexano) se disolver en HCl diluido, se agitar
y posteriormente se filtrar hasta obtener un
filtrado incoloro al cual se le realizar ensayos
de alcaloides con los reactivos de Dragendorff y
Wagner y Hager. (Barba, 1997)

Pruebas Fisicoqumicas
Preliminares

Saponinas:
Ensayo con agua caliente con agitacin vigorosa.
(Barba, 1997)
Taninos:
Se disolver una porcin del extracto en agua y se
realizar la prueba con cloruro frrico y el reactivo de
gelatina.
Esteroles y terpenoides
Se realizar sobre una porcin del extracto la prueba
de Liebermann-Buchard.
Quinonas:
Reaccin de Borntrager .

Pruebas Fisicoqumicas
Preliminares
Cumarinas
Calentamiento del extracto lquido en un
tubo de ensayo tapado con papel filtro
impregnado de una solucin alcalina, el
cual se llevar a observacin con una
lmpara de luz UV.
Glucsidos
Se realizar la prueba de Baljet

Confirmacin por CCD


Las pruebas anteriores sern confirmadas mediante la
tcnica de cromatografa de capa delgada CCD (Wagner.
et al, 2009), utilizando como fase estacionaria silica gel y
acetato de etilo. Hexano como eluente en diferentes
proporciones y el revelado con un modo de deteccin con
spray reactivo que vara dependiendo del grupo de las
sustancias qumicas a identificar.

Confirmacin por CCD

Taninos
Prueba con acetato de plomo Adicin de 1 mL de una
solucin de acetato de plomo al 10% a 1 mL del extracto
obtenido por ESC. La formacin de un precipitado blanco
indica la presencia de taninos.
Prueba con cloruro frrico. A 0.5 mL del extracto se adiciona
2 gotas de cloruro frrico al 1%. Se utiliza una solucin de
cido tnico al 5%, como referencia del color. Debe virar la
mezcla si hay taninos. Se interpreta de la siguiente manera:
No hay cambio significativo de color no hay evidencia de la
presencia de taninos.
Color azul, negro azuladopresencia de taninos piroglicos
(hidrosolubles).
Color verde, azul verdoso, precipitado negro
verdosopresencia de taninos de tipo catecol (condensados).

Flavonoides
Prueba de Shinoda. Se adiciona 0.5 g de limaduras de magnesio y algunas
gotas de HCl a 1 mL del extracto hasta que cesa el desprendimiento de
hidrgeno. La prueba se considera positiva si hay cambio a un color rosado,
naranja o violeta, para flavonoides con ncleo -benzopirona, como:
flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles y xantonas
Prueba de Rosenhein. A 1 mL de extracto se adiciona 0.5 mL de HCL
concentrado, la mezcla se calienta durante 10 minutos a 90C en un bao
de agua. Se dej enfriar a temperatura ambiente para mezclar
posteriormente con 0.4 mL de alcohol amlico. La prueba es positiva si se
observa una coloracin que va desde rojo carmes hasta rosado en la fase
amlica, indicando la presencia de flavonoides con esqueleto de tipo flavilo.
Prueba para leucoantocianidinas. El extracto se somete a calentamiento,
despus de la adicin de 0.5 mL de HCl al 10%. Se mantiene la temperatura
de 90C aproximadamente, durante15 minutos. El resultado tiene la
siguiente interpretacin:
color rojo intenso, indica la formacin de una antocianidina.
Color caf-amarillo indica la presencia de catequinas las cuales producen un
polmero bajo estas condiciones.

Quinonas y saponinas
QUINONAS
Prueba con H+/Zn
Se adiciona a 0.2 mL de extracto, zinc en polvo y algunas gotas de HCl
concentrado. El color amarillo que se forma revela la presencia de
antraquinonas.
SAPONINAS
Prueba de la espuma
A un mL de extracto se adiciona 9 mL de agua, posteriormente se llev 1 mL de
la solucin anterior a diferentes tubos de ensayo pequeos, los cuales fueron
agitados vigorosamente durante 30 segundos y luego se dejaron en reposo por
15 minutos. La formacin de espuma indica la presencia de saponinas en las
muestras, y con la altura de la espuma en el tubo se puede dar una idea de la
cantidad de saponinas, como se indica a continuacin:
Altura de menos de 5 mm no se detectan saponinas
Altura de 5-9 mm contenido bajo
Altura de 10-14 mm contenido moderado
Altura mayor de 15 mm contenido alto

Cumarinas
Reaccin de fluorescencia. Se agregan 2
ml de extracto a un tubo de ensayo, la
boca del tubo de ensayo se cubre con
papel filtro humedecido con una solucin
de NaOH, se lleva a un bao de agua de
caliente (aprox 100C), luego de unos
minutos se retira el papel de filtro y se
examina bajo luz UV. La fluorescencia
amarilla sobre el papel, indica de la
presencia de cumarinas.

Alcaloides
Prueba de Wagner. Dos mililitros de extracto se acidulan con HCl hasta pH 4, posteriormente
se agregan 5 gotas del reactivo de Wagner. La formacin de una leve turbidez o de un
precipitado de color marrn, o entre blanco y crema o entre rojo y naranja, muestra la
presencia de alcaloides.
El reactivo de Wagner consiste en la disolucin de 12.7 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio
en un litro de agua destilada.
Prueba de Dragendorff
El extracto fue acidulado con HCl hasta pH 5, se tom 2 mL de ste y se le agreg 3 gotas del
reactivo de Dragendorff. La formacin de un precipitado de color con las mismas
caractersticas que la prueba de Wagner evidencia la presenca de alcaloides.

El reactivo de Dragendorff se prepar a partir de dos soluciones:


Solucin A: 0.85 g de subnitrato de bismuto se mezclaron con 10 mL de cido actico y 40 mL
de agua.
Solucin B: 8 g de KI se disolvieron en 20 mL de agua.
La mezcla de las dos soluciones anteriores se hizo unos minutos antes de la prueba. Se
mezclaron 5 mL cada solucin y luego se aadieron 20 mL de cido actico, finalmente se
complet a 100 mL con agua destilada.

Terpenos
Reaccin de Lieberman Burchard
0.5 mL de extracto se llevan hasta sequedad, luego se adiciona 3 gotas de
cloroformo, se llev a una placa excavada donde se les adicionan algunas
gotas de cido actico seguidas por una gota de cido sulfrico
concentrado que se dej caer por las paredes de la placa. La presencia de
carotenoides se evidencia por el cambio de color, cuya interpretacin se
hace de la siguiente manera:
Azul o verde, indica presencia de esteroides
Rojo, rosado o violeta, indica presencia de triterpenos
Amarillo plido, indica presencia de esteroides o triterpenos saturados
Reaccin de Salkowski
A 0.5 mL de extracto se les adicion 1 mL de cloroformo y por las paredes
de cada tubo se dej caer 1 mL de cido sulfrico concentrado. La
interpretacin de esta prueba se puede hacer de la siguiente manera:
La formacin de colores amarillo o rojo se considera positivo.
Si en la interfase se forma color azul, verde o violado es caracterstica de los
carotenoides.

Fenoles totales
Ensayo con el reactivo de Folin-Ciocalteu
Se depositan 0.5 mL de extracto en tres tubos de ensayo diferentes,
a cada tubo de ensayo se agregan: 5 gotas del reactivo comercial de
Folin-Ciocalteu, y 2 gotas de Na2CO3. Con el objetivo de comparar los
resultados se emple un cuarto tubo de ensayo, en el cual se coloc
la mezcla de los reactivos y se sustituy el volumen del extracto por
agua destilada. La valoracin aproximada de fenoles se hace de la
siguiente manera (Cardarelli et al, 2008).

Coloracin amarilla: indica que no se detectaron fenoles
Coloracin verdosa: se detectaron fenoles en baja cantidad
Coloracin azul clara: se detectaron fenoles en cantidad moderada
Coloracin azul intensa: se detectaron fenoles en alta cantidad