Extracción e identificación de metabolitos secundarios presentes en uvas de la variedad

Vitis vinifera Princess y Concord

Guerra Jorge1, Jácome Elina1, Vizuete Oscar1
Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias Químicas, Carrera de Química
Laboratorio de productos naturales
Resumen:
Las metodologías realizadas han tenido como objetivo el tratamiento de la muestra para su
posterior extracción e identificación de metabolitos secundarios presentes en una muestra de
origen vegetal, en este caso se han utilizado uvas verdes y rosadas, Vitis vinifera Princess y
Concord respectivamente, se realizó una selección, un tratamiento de desinfección y un proceso
de secado previo de las muestras obtenidas. Se realizó una extracción en Soxhlet usando un
solvente apolar, hexano, permitiendo la obtención de un extracto de la fase lipídica de la
muestra el cual fue sometido a pruebas cualitativas de reconocimiento de esteroides y
terpenoides, donde el extracto de Vitis vinifera Princess (UV) dio negativo, mientras que para
el extracto de Vitis vinifera Concord (UR) no se realizaron estas pruebas, con nuestras muestras
de UV y UR solidas se realizó un macerado en metanol para extraer la fase polar y al extracto
obtenido se le realizaron distintas pruebas cualitativas de identificación de compuestos
fenólicos dando positivo a antocianinas en el caso de la muestra de UR y negativo en el caso
de la muestra UV donde si existe la presencia de flavonas y flavonoles.
Palabras clave: Tratamiento, Metabolito Secundario, Extracción, cualitativas

Introducción:
Uva es el nombre común de la fruta formada en el racimo de la vid, se la utiliza mundialmente
para obtener vino a través de la fermentación (1). Existe una amplia variedad de uvas las cuales
varían según su color que puede ser negras, moradas, verdes, rosadas. En las uvas verdes su
coloración es responsable a la mutación de dos genes que hace que no desarrollen antocianinas,
siendo estas las que dan la pigmentación. Las antocianinas, y otros pigmentos químicos que
poseen las uvas moradas, son las responsables de los diferentes tonos de morado en los vinos
tintos (3).
El fruto de uva (Vitis vinıfera L.) ha sido ampliamente estudiado por sus propiedades
antioxidantes. La cáscara y semillas de la uva son consideradas fuentes importantes de
compuestos fenólicos, a los que se les atribuyen la propiedad astringente y antioxidante de las
uvas y sus productos. Algunos reportes indican que la concentración de estos compuestos en la
uva, así como la capacidad antioxidante total, varía significativamente con la variedad y tipo de
tejido del fruto (2).
Estos compuestos polifenólicos se clasifican de manera general como fenoles y ácidos fenólicos
(polifenoles no flavonoides), y flavonoides. Los polifenoles son metabolitos secundarios de las
plantas que se han asociados con diversas propiedades, taxonómicas, sensoriales, nutricionales
y farmacológicas (2). En muchos frutos se ha encontrado un mayor poder antioxidante en las
cáscaras y/o semillas que en la porción comestible (2).
Los compuestos polifenólicos se caracterizan químicamente porque llevan un núcleo bencénico
sustituido en una o más posiciones por grupos hidroxilos. Debido a la asociación de compuestos
fenólicos con la capacidad antioxidante el presente estudio tiene como objetivo identificar
mediante reacciones cualitativas polifenoles y flavonoides del extracto de las variedades de
uvas Vitis vinifera Princess y Vitis vinifera Concord

Metodología:
a. Parte experimental
1.Recolección de la muestra
Se recolectaron uvas (Vitis vinifera), de las variedades Princess y Concord (las llamaremos a
partir de ahora uvas rosadas y uvas verdes respectivamente) procedentes del mercado, ubicado
en el municipio de quito. Las muestras se recolectaron en el mes de mayo del año 2022.
2. Tratamiento de la muestra
Se selecciono a las uvas adecuadas para proseguir con su limpieza, la cual se limpió con una
solución de KMnO4 0,1% (m/v). Las uvas después de pasar por el proceso de lavado se las
corto en 4 partes y se extrajo las semillas, se prosiguió a colocar la muestra cortada en cajas de
papel Kraft etiquetando cada una de las cajas, ya que se puso por separada cada una de las
muestras de uvas verdes y rojas, el proceso de secado se realizó en la estufa y se las dejo durante
una semana. Pasado el tiempo de secado se recolectó la muestra de uvas verdes y rojas las
cuales se licuó para obtener una muestra lo más fina posible. La consistencia de la muestra
después de licuarla fue de una masa acaramelada.

3. Extracción en Soxhlet
Se utilizó papel filtro para armar dos capuchones de dimensiones adecuadas para la cámara de
extracción Soxhlet. Se pesó cada capuchón sin muestra y se continuó a depositar la muestra
seca dentro del capuchón, hasta 1 cm del borde superior del capuchón y se dobló. Se armó el
equipo de extracción Soxhlet y se colocó el capuchón a continuación en la parte superior del
refrigerante se introdujo suficiente cantidad de n-hexano para que se produzca el sifonamiento.
Se calentó a reflujo por 4 horas o hasta que se observó que la extracción ha concluido. Se dejó
enfriar a temperatura ambiente y la disolución que se quedó en el matraz de fondo plano se
concentró por medio del rotavapor para que la fase lipídica que se encontró ahí esté concentrada.
Después de que el capuchón con la muestra se secó se prosiguió a pesar y a calcular el
porcentaje de fase lipídica peso-peso. La fase lipídica concentrada se dejó en una caja Petri en
la estufa para que se evaporara. Se repitió el mismo proceso para la muestra de uvas rojas.

4. Reacciones de color para identificar esteroides

Se utilizó la muestra en la caja Petri de la fase lipídica para estas reacciones de identificación
de esteroides.
a, Prueba de libermann-burchard.
Grupo 4
En una placa de toque colocar en la primera fila se colocó 1 gota de anhídrido acético, 1 gota
de cloroformo y una gota de ácido sulfúrico. Se añadió una gota de la muestra de la fase lipídica
disuelta en cloroformo. Si se observar un cambio de color los cuales pueden ser azul, verde,
rojo o naranja con el pasar del tiempo. Este cambio es muestra de una prueba positiva de
esteroides.
b. Prueba de Rosenheim
En la segunda fila de la placa de toque se colocó 1 gota de ácido tricloro acético y después se
colocó una gota de la muestra de la fase lipídica disuelta en cloroformo. No existe dienos
nucleares se observa el cambio de color a violeta que cambiara a azul en 20 minutos.
2. Cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HPTLC)
Se tomo 1 ml de la muestra de la fase lipídica disuelta en cloroformo. Se sembró la muestra en
la placa cromatográfica 10x10. Al cabo de 20 minutos del sembrado se observó el resultado con
diferentes longitudes de onda como fue el proceso de cromatografía. Se anoto los resultados.
6. Macerado
Se coloco el capuchón dentro de un frasco de vidrio y se adiciono metanol necesario hasta
cubrirlo, se dejó reposar.
7. Identificación
Para estas pruebas de identificación se utilizó un total de 10 tubos de ensayos los cuales se
dividieron entre 5 tubos para el extracto de la uvas rosadas y 5 tubos para el extracto de las uvas
verdes.
a. Pruebas preliminares
En los 5 tubos de ensayos correspondientes para cada muestra se colocó aproximadamente 2
mL del extracto de uvas rosadas y verdes. A cada uno de los tubos utilizados se los rotulo de
esta forma tubo 1-HCl 10%, 2-Blanco,3-Na2CO3 10%, 4- NaOH y 5-FeCl3 10%. A
continuación, se prosiguió a colocar en cada tubo de ensayo 3 gotas de cada reactivo rotulado
en el tubo. Los resultados obtenidos se deben comparar con la siguiente tabla (4):

Flavonas y
Tubo Antocianinas Mezcla
flavonoles
1 Rojo a violeta Amarillo a incoloro Rojo
2 Rojo- azul Amarillo a incoloro Rosado
3 Azul - violeta Amarillo Verde
4 Azul Amarillo Oliva amarillento
5 Azul marino- purpura Oliva- amarillo Oliva - café

b. Reacción de Shinoda
En los 2 tubos que se utilizaron de blanco para la prueba anterior se colocó en cada tubo
limaduras de magnesio y gotas de HCl concentrado.

Grupo 4
Resultados
Peso del capuchón con muestra de las uvas rosadas secas: 7.36 g
Peso del capuchón con muestra de las uvas verdes secas: 6.65 g
Peso del capuchón con muestra de uvas rosadas después de la extracción: 7.27 g
Peso del capuchón con muestra de uvas verdes después de la extracción: 6.59 g
-Uvas Verdes
Cálculo del porcentaje de fase lipídica peso-peso
𝑚 𝑚0 − 𝑚𝑓
( )= ∗ 100 = 0.90%
𝑚 𝑚𝑓

-Uvas Rosadas
Cálculo del porcentaje de fase lipídica peso-peso
𝑚 𝑚0 − 𝑚𝑓
( )= ∗ 100 = 1.22%
𝑚 𝑚𝑓

Tabla 1: Resultados obtenidos en las reacciones para UV

Fase Reacción Resultado Color

Liberman-bucher (-) Incoloro
APOLAR
Rosechein (-) Incoloro
shinoda (+) Incoloro
HCl (+) Incoloro
POLAR Carbonato de sodio (+) Amarillo verdoso
Hidróxido de sodio (+) Amarillo
Cloruro férrico (+) Café

Tabla 2: Resultados obtenidos en las reacciones para UR

Fase Reacción Resultado Color

Liberman-bucher No realizado
APOLAR
Rosechein No realizado
shinoda (+) incoloro
HCl (+) Rojo
POLAR Carbonato de sodio (+) Azul
Hidróxido de sodio (+) Azul
Cloruro férrico (+) Purpura

Grupo 4
Discusiones
La composición de la fruta depende del “genotipo de la variedad, de las condiciones
ambientales y de la interacción entre genotipo y ambiente” (5). Lo que hace que cada uva
cultivada en un determinado momento ya sea de la mima especia sea única en composición,
pero se suele observar ciertas tendencias en las distintas especies de Vitis vinifera, ya que es “el
genotipo el que en la mayor parte de los análisis explica un mayor porcentaje de la variación en
la composición de la baya”, por ende cada baya de cualquier especie de Vitis vinifera tiene una
diferente complejidad, “En esta complejidad participa un componente genético o varietal muy
importante y componentes ambientales y de interacción genotipo–ambiente nada despreciables
que contribuyen a la variación entre añadas y zonas geográficas”(5).
Al momento de moler la muestra UR con el molino se presentó un inconveniente debido a la
gran cantidad de azucares que presenta esta no se obtuvo un polvo fino si no una especie de
pasta, la cantidad de azucares según Moreiras en su artículo de tablas de composición de
alimentos dice que las especies Vitis vinifera es de 23g por cada porción de 100g (6), por esta
razón a la muestra UV se la procedió a triturarla directo en la licuadora, dando como resultado
que en ninguna de las dos muestras se obtuviera un polvo fino para su posterior tamizado y así
obtener un tamaño de partícula homogéneo, esta situación pudo haber interferido en la
extracción de los metabolitos secundarios de ambas muestras.
Se pesó el capuchón que contenía las muestra de UR y UV ya secas antes y después de la
extracción Soxhlet y se determinó el porcentaje de fase lipídica que estas contenían, la fase
lipídica contiene grasas o aceites, terpenos, esteroides, prostaglandinas, carotenoides que son
sustancias apolares, este proceso se llama desengrasado y se usara un solvente apolar de alta
presión de vapor como lo es el hexano, una vez realizada la extracción se calculó el porcentaje
de la fase lipídica, para la muestra UR, es de 1.22% y para UV es de 0.90%.
Con el extracto de la fase lipídica de UV diluido en cloroformo se procedió a realizar una
cromatografía de capa fina de alta resolución usando como eluyente una mezcla de benceno-
éter de petróleo-etanol, con el objetivo de detectar los posibles metabolitos secundarios, el
resultado de este análisis es negativo como se observa en las imágenes 1, 2 y 3 de los anexos,
trac 1, esto se puedo deber a que el concentrado de nuestra fase lipídica no es lo suficientemente
concentrado que se puede explicarse debido a que la extracción Soxhlet de la fase lipídica no
se llevó a cabo de forma correcta debido a la incapacidad del instrumento a realizar el
sifonamiento correctamente, además de que la muestra no tuvo un tamaño de partícula
homogéneo. Otra razón de la falta de coloración es que las muestras no contienen carotenoides
o los contienen en concentraciones muy bajas.
Con el extracto diluido en cloroformo de realizaron dos reacciones de color para identificar
esteroides, el test de libermann-burchard para esteroides y el test de Rosenheim para esteres
con dobles enlaces, la muestra de uvas verdes dio un resultado negativo a estas pruebas, esto
puede deberse de nuevo a la baja concentración de esteroides en nuestro extracto concentrado
o que las uvas verdes no contienen esteroides o los contienen en muy bajas cantidades. Estas
pruebas y la cromatografía no se realizaron con la muestra de uvas rosadas. Lo que tiene sentido
ya que en la bibliografía no se encuentra información sobre que estos tipos de uvas contengas
estos metabolitos secundarios,

Grupo 4
Para la muestra UR, Vitis vinifera Concord, la tabla 2 evidencia los resultados obtenidos para
las pruebas de antocianinas, flavonas y flavonoles, por el color formado en cada una de estas se
puede concluir que los compuestos derivados de las antocianinas están presentes en esta
variedad de uva, así como es posible la presencia de flavonas y flavonoles, la especie Vitis
vinifera Concord, da una prueba positiva pero no concluyente para flavonas y flavonoles lo que
puede significar la presencia de otro tipo de flavonoides, la bibliografía nos dice que esta
especie tiene como “flavonoides relevantes los flavanoles o catequinas en sus formas libres o
polimerizadas que son los que confieren sabor amargo y astringencia al vino”(5) que pudieron
reaccionar en la prueba con NaOH dando ese cambio de color. Caso contrario con las
antocianinas cuyas pruebas dieron todas positivo, las “antocianinas son los pigmentos
responsables del color de la uva y del vino tinto y rosado. Todas las variedades con uvas
coloreadas de la especie Vitis vinifera”. Para el caso de la fase polar de UV, nombre científico,
vemos los resultados en la tabla tal y se observa que no coincide con los resultados de la muestra
de UV, Vitis vinifera Princess, algo completamente lógico ya que la composición de una especie
vegetal no solo depende de su especie o su variedad sino también del entorno donde se cultive,
y estas dos muestras son de variedades y entornos completamente distintos.
Conclusiones:
Se realizaron distintas pruebas las muestras UR y UV, para la fase lipídica de ambas se obtuvo
un resultado negativo para las pruebas de libermann-bucher y Rosechein que identifican la
presencia de esteroides y esteroides con dobles enlaces, en cambio en el extracto de la fase polar
de la muestra UR las pruebas de la tabla 2 dieron un resultado positivo que indica la presencia
de antocianinas, para la muestra UV estas mismas pruebas dieron un resultado negativo excepto
la prueba de carbonato de sodio lo que indica la posible presencia de antocianinas.
Bibliografía:

1. Los compuestos fenólicos de las uvas de vinificación (Vitis vinífera L.) y su efecto en la
calidad de los vinos.
2. Surco Laos F, Ayquipa Paucar H, Quispe Gamboa W, García Ceccarelli J, Valle
Campos M. DETERMINACIÓN DE POLIFENOLES TOTALES Y ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE DE EXTRACTO DE SEMILLAS DE UVAS RESIDUOS DE LA
PRODUCCIÓN DE PISCOS. Rev Soc Quím Perú [Internet]. 2020;86(2):123–31.
Disponible en: http://dx.doi.org/10.37761/rsqp.v86i2.282
3. Brouillard R, Chassaing S, Fougerousse A. Why are grape/fresh wine anthocyanins so
simple and why is it that red wine color lasts so long? Phytochemistry [Internet].
2003;64(7):1179–86. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/s0031-9422(03)00518-1
4. Heredia Martha S. Procedimientos de Laboratorio. Editorial Academica Espanola; 2015.
6. Carbonell, P. (2006). Estructura y composición de la uva y su contribución al vino.
Madre de Dios(51).

5. Moreiras, O. (2002). Tablas de composicion de alimentos. catedra alimentasion

institucional.

Grupo 4
Anexos

Trac 1

Imagen 1: HPTLC bajo longitud de onda

Trac 1

Imagen 2: HPTLC bajo longitud de onda

Grupo 4
 Trac 1

Imagen 3: HPTLC bajo luz blanca

Imagen 4. Reacciones de color del extracto metanólico.

Grupo 4